葉佳凈，趙錦鵬，卞世杰，郭衛(wèi)麗，李新崢

（河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

南瓜屬主要栽培種中國(guó)南瓜（CucurbitamoschataDuchesne，俗稱(chēng)倭瓜、番瓜）、印度南瓜（Cucurbita maximaDuchesne，俗稱(chēng)筍瓜）和美洲南瓜（Cucurbita pepoL.俗稱(chēng)西葫蘆），在世界范圍廣泛栽培，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。白粉病是普遍發(fā)生且嚴(yán)重危害南瓜生產(chǎn)的一種真菌性病害，其發(fā)病率高、發(fā)病面積大、傳播速度快，在黑龍江、河南、甘肅以及陜西關(guān)中等地區(qū)發(fā)生日趨嚴(yán)重，成為限制南瓜生產(chǎn)的重要因素[2-4]。南瓜白粉病主要侵染葉片，發(fā)病初期葉面出現(xiàn)白色小斑點(diǎn)，隨后擴(kuò)散至整個(gè)葉片，表現(xiàn)為覆蓋白色粉狀物；發(fā)病后期白粉病斑由白色變?yōu)辄S褐色，有分生孢子閉囊殼產(chǎn)生，葉片發(fā)黃嚴(yán)重甚至焦枯，嚴(yán)重影響植株正常光合作用，降低南瓜的產(chǎn)量與品質(zhì)[5]。

病原菌侵染時(shí)，植物光合效率降低，通常與光合器官受損、光合代謝所需激發(fā)能過(guò)量增加有關(guān)，最終導(dǎo)致氧氣的下降和活性氧（Reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生[6-8]。過(guò)量ROS積累間接誘導(dǎo)植物的過(guò)敏性反應(yīng)（Hypersensitive reaction，HR）[9]。HR是植物與病原菌不親和互作發(fā)生的一種抗病反應(yīng)，表現(xiàn)為在病原菌侵染處形成不同于周?chē)】到M織的局部細(xì)胞壞死斑[10]，是細(xì)胞程序性死亡的主要形式，可以激發(fā)鄰近組織的防衛(wèi)反應(yīng)和植株的系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR）[11]。甜瓜幼苗感染白粉病后光合指標(biāo)下降，包括凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）[12]。張兆輝等[13]研究發(fā)現(xiàn)，接種白粉病菌的西葫蘆葉片葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生類(lèi)囊體膨大、基質(zhì)片層和基粒片層扭曲等變化。白粉病降低植物的光合作用，但關(guān)于白粉病菌如何影響南瓜光合特性的機(jī)制報(bào)道很少。鑒于南瓜果實(shí)發(fā)育期開(kāi)花和幼果生長(zhǎng)階段易暴發(fā)白粉病，以白粉病不同抗性南瓜品種為試材，研究白粉病菌對(duì)南瓜結(jié)果期葉片光合指標(biāo)、細(xì)胞壞死及葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響，分析其光合特性變化的生理機(jī)制，以期豐富南瓜抗白粉病的機(jī)制研究理論。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試南瓜材料為中國(guó)南瓜品種九江轎頂（JJJD）和自交系112-2，其中JJJD 高感白粉病，112-2 高抗白粉病。2001 年至今，在實(shí)驗(yàn)室人工接種白粉病菌，自交系112-2 幼苗期植株均表現(xiàn)出穩(wěn)定的高抗白粉病特性[14-15]。在田間自然發(fā)病條件下，南瓜結(jié)果期自交系112-2 整株基本未出現(xiàn)白粉癥狀，而相鄰定植的JJJD 中下部葉片布滿大小不一的白粉斑，發(fā)病嚴(yán)重的基部葉片出現(xiàn)萎黃、早衰癥狀，并向上蔓延。112-2和JJJD 種子均由河南科技學(xué)院南瓜課題組提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2020 年4 月在河南科技學(xué)院育種實(shí)驗(yàn)室將供試南瓜種子浸種催芽后播種于穴盤(pán)內(nèi)，幼苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)移栽到口徑為30 cm 的大盆中，將大盆搬至室外進(jìn)行盆栽管理，植株進(jìn)入結(jié)果期即第1 朵雌花開(kāi)花后，進(jìn)行白粉病菌接菌處理。采集感白粉病的南瓜葉片[白粉病菌為單囊殼屬白粉菌（Podosphaera xanthii）]，用軟毛刷將白粉病菌孢子掃入培養(yǎng)皿內(nèi)，無(wú)菌水稀釋?zhuān){(diào)整孢子懸浮液終濃度為1×105個(gè)/mL。采用噴霧法將白粉病菌孢子懸浮液噴灑于結(jié)果期南瓜第1 朵雌花上下的2 片葉片，以葉片布滿霧滴狀水珠但不滴落為宜，CK 噴清水（不接種白粉病菌）。以112-2-PM、JJJD-PM 分別表示112-2、JJJD 接種白粉病菌處理，112-2-CK、JJJD-CK分別表示112-2、JJJD清水對(duì)照處理。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 光合參數(shù)測(cè)定 自然光照條件下，隨機(jī)選取清水（CK）和白粉病菌處理的結(jié)果期南瓜植株各9株，每株選擇雌花附近、長(zhǎng)勢(shì)一致的2 片葉片做標(biāo)記，于9:00—11:00 間用Li-6400 便攜式光合儀測(cè)定南瓜葉片的Pn、Gs、Tr和Ci，從接種白粉病菌當(dāng)天開(kāi)始，間隔1 d 測(cè)1 次，至接種后第12 天結(jié)束，即0、2、4、6、8、10、12 d。每個(gè)葉片重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.2 壞死斑觀察 分別在接種白粉病菌后0、4、5、6 d 隨機(jī)選取2 種南瓜材料各12 株，每株選擇雌花附近、長(zhǎng)勢(shì)一致的葉片，避開(kāi)葉脈，剪取葉片樣本大小1 cm×1 cm，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將剪取的南瓜葉片浸沒(méi)在臺(tái)盼藍(lán)染色液中，沸水浴2 min 后，乙醇脫色至透明。將脫色后的葉片制成玻片，在倒置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞壞死斑被臺(tái)盼藍(lán)染色劑染成藍(lán)色。每個(gè)樣品取10個(gè)視野。

1.3.3 葉綠素含量測(cè)定 參照蔡慶生[16]的方法。分別于接種白粉病菌后0、4、8、12 d隨機(jī)選取2種結(jié)果期南瓜植株各12 株，每株選擇雌花附近、長(zhǎng)勢(shì)一致的葉片，避開(kāi)葉脈剪碎混勻，稱(chēng)取0.2 g放于研缽中，倒入95%乙醇及少量碳酸鈣，研磨成勻漿，靜置3～5 min 后過(guò)濾，95%乙醇定容至25 mL，搖勻，設(shè)置3次重復(fù)。測(cè)定葉綠素a（Ca）含量、葉綠素b（Cb）含量以及總?cè)~綠素（CT）含量。

Ca（mg/g）=13.95A665-6.88A649，

Cb（mg/g）=24.96A649-7.32A665，

CT（mg/g）=6.63A665+18.08A649。

1.3.4 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察 接種白粉病菌后4 d，選取112-2 和JJJD 南瓜各3 株，取上述相同葉位的葉片，以健康無(wú)病害的葉片作CK。用鋒利徠卡刀片避開(kāi)主葉脈切取0.5 mm×1.0 mm 的小塊，快速投入裝有預(yù)冷戊二醛（4%）溶液的青霉素小瓶中，用注射器抽氣至材料大部分下沉于瓶底部，4 ℃下固定6 h；用磷酸緩沖液（0.1 mol/L）沖洗3 次，每次30 min；四氧化餓固定液二次固定6 h，磷酸緩沖液再次沖洗；用不同體積分?jǐn)?shù)的（15%、30%、50%、70%、80%、90%、100%）乙醇連續(xù)脫水2 次，每次30 min；丙酮過(guò)渡，環(huán)氧樹(shù)脂滲透包埋，在35 ℃12 h、45 ℃12 h、60 ℃24 h 條件下分別聚合；用LEICA EM UC7 型超薄切片機(jī)鉆石刀切片，切片厚60～80 nm，25 ℃下用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色。于HITACHI-HT7700 型透射電子顯微鏡下觀察拍照，每個(gè)樣品取10個(gè)視野。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均取3 次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)分析和作圖分別用SPSS 2.0軟件和Excel 2003進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉病菌對(duì)南瓜結(jié)果期葉片光合指標(biāo)的影響

圖1 顯示，接種白粉病菌后，2 種材料（112-2 和JJJD）葉片的Pn、Tr 和Gs 均低于清水對(duì)照，JJJD 的Pn 下降幅度總體上大于112-2，其中，112-2 和JJJD葉片Pn 在接種后2 d 分別比相應(yīng)對(duì)照降低45.4%和63.8%；但接種后6～10 d，2 種材料葉片的Ci 則高于對(duì)照?？剐圆牧?12-2 接菌后總體上表現(xiàn)為Pn 高于感病材料JJJD 接菌處理，Ci低于感病材料JJJD 接菌處理?？梢?jiàn)，白粉病會(huì)影響結(jié)果期南瓜葉片的光合效率，降低Pn、Tr 和Gs，增加Ci，說(shuō)明白粉病菌侵染降低了葉片對(duì)Ci 的利用率，此外，感病材料中這種影響高于抗病材料。

圖1 白粉病菌對(duì)南瓜材料112-2和JJJD結(jié)果期葉片光合指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of powdery mildew pathogens on photosynthetic indexes of leaves of pumpkin（112-2 and JJJD）at fruiting stage

2.2 白粉病菌對(duì)南瓜結(jié)果期葉片葉綠素含量的影響

圖2顯示，與CK 相比，接種白粉病菌后，JJJD 的Ca、Cb 和CT 含量在接菌前期（接種后0～8 d）無(wú)明顯變化，而在接種后第12天明顯降低，與CK相比分別降低50.0%、47.0%和49.0%；材料112-2 Ca、Cb 和CT含量在接種后4 d和12 d明顯低于CK，其中接種后12 d 分別下降65.0%、54.0%和57.0%，降幅明顯高于感病材料JJJD。表明白粉病菌侵染降低了南瓜結(jié)果期葉片Ca、Cb 和CT 的含量，其中Ca 含量下降最多，且抗病材料葉綠素含量的下降幅度較大。

圖2 白粉病菌對(duì)南瓜材料112-2和JJJD結(jié)果期葉片葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of powdery mildew pathogens on chlorophyll content in leaves of pumpkin（112-2 and JJJD）at fruiting stage

2.3 白粉病菌對(duì)南瓜結(jié)果期葉片細(xì)胞壞死的影響

圖3 顯示，接種白粉病菌后4 d，112-2 和JJJD均出現(xiàn)壞死斑，隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，壞死斑面積增大、顏色加深，感病材料JJJD 壞死斑面積明顯大于抗病材料112-2 且顏色較深，表明接種白粉病菌誘發(fā)結(jié)果期南瓜葉片出現(xiàn)HR，感病材料HR 發(fā)生較嚴(yán)重。

圖3 結(jié)果期南瓜接種白粉病菌后葉片細(xì)胞壞死的觀察Fig.3 Observation of cell necrosis in powdery mildew-infected pumpkin leaves at fruiting stage

2.4 白粉病菌對(duì)南瓜結(jié)果期葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

圖4 顯示，清水處理南瓜材料（112-2 和JJJD）葉綠體呈現(xiàn)長(zhǎng)橢圓形，緊靠細(xì)胞膜分布，葉綠體膜結(jié)構(gòu)清晰平滑，基質(zhì)片層和基粒片層排列緊密，片層垛疊整齊均勻，有少量電子密度高的嗜鋨體存在。接種白粉病菌后4 d，112-2 葉片葉綠體大多腫脹變形，并向細(xì)胞中央游離，基質(zhì)片層排列疏松，基粒片層不規(guī)則排列，嗜鋨體增多，積累較多的淀粉粒；JJJD 葉片葉綠體的腫脹程度大于112-2，葉綠體間擠壓嚴(yán)重，細(xì)胞膜、基質(zhì)片層、基粒片層模糊不清，淀粉粒較多，并形成大量油滴。

圖4 結(jié)果期南瓜接種白粉病菌后葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察Fig.4 Chloroplast ultrastructure observasion of powdery mildew-infected pumpkin leaves at fruiting stage

3 結(jié)論與討論

植物葉片光合系統(tǒng)對(duì)白粉病非常敏感。金海軍等[17]研究表明，在感染白粉病菌的17 份黃瓜材料中大多數(shù)材料Pn、Tr、Gs明顯降低，Ci增加。本研究也表明，結(jié)果期接種白粉病菌的南瓜葉片Pn、Tr、Gs均降低，而Ci 增加。通常，氣孔關(guān)閉和葉肉細(xì)胞光合活性下降導(dǎo)致的非氣孔因素是病原菌脅迫引起植物光合作用下降的主要影響因素。FARQUHAR等[18]研究表明，Gs 下降，Ci 不變或上升，光合速率下降是由葉肉細(xì)胞同化能力降低等非氣孔因素引起的。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)果期接種白粉病菌后，南瓜葉片的Gs 下降，Ci 上升，說(shuō)明非氣孔因素是南瓜葉片光合作用降低的主要原因之一，這與李寧等[19]和王瑩等[20]的研究結(jié)果一致。

植物的光合作用受過(guò)敏反應(yīng)抑制，光合作用受抑制又會(huì)導(dǎo)致ROS 產(chǎn)生[21]，ROS 影響葉綠體PSⅡ的活性，被侵染的細(xì)胞由于PSⅡ活性喪失，干擾了細(xì)胞存活所必需的動(dòng)態(tài)平衡，反過(guò)來(lái)加速了過(guò)敏反應(yīng)[22]。本試驗(yàn)中，接種白粉病菌后4 d，南瓜（112-2和JJJD）葉片均出現(xiàn)明顯的過(guò)敏反應(yīng)，隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，感病材料JJJD 細(xì)胞壞死斑面積擴(kuò)展更大，進(jìn)一步限制了葉片的光合速率，說(shuō)明過(guò)敏反應(yīng)與南瓜材料的抗/感病性有關(guān)，在抗性材料112-2 上白粉病菌的生長(zhǎng)受到有效抑制[13]。

病原菌侵染植物后可破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能，使葉綠素含量下降。甜瓜感染白粉病后葉綠素含量下降[23]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種白粉病菌后，南瓜材料Ca、Cb 和CT 含量均明顯下降，且抗性材料112-2葉綠素含量的下降幅度較大，與柯思佳等[24]研究認(rèn)為抗性甜瓜材料能減緩蔓枯病對(duì)葉綠素含量的影響不同，這可能與試驗(yàn)品種或測(cè)定時(shí)間不同有關(guān)。葉綠體是植物光合反應(yīng)的主要場(chǎng)所，其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定與否直接影響光合作用的強(qiáng)弱[25]，甘薯感染瘡痂病后葉綠素被降解，葉綠體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，葉綠體膜流動(dòng)性降低，感病品種葉綠體受損程度遠(yuǎn)大于抗病品種[26]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，南瓜感染白粉病菌后葉綠體腫脹變形，基質(zhì)片層排列疏松，基粒片層不規(guī)則排列，嗜鋨體和淀粉粒增多，且感病材料葉綠體結(jié)構(gòu)受損更為嚴(yán)重。病原菌侵染導(dǎo)致植株產(chǎn)生大量ROS，引起葉綠體膜過(guò)氧化[27]，造成葉綠素降解，致使植物光合能力下降。ROS 對(duì)膜系統(tǒng)的損傷進(jìn)一步阻礙了淀粉的水解和向外運(yùn)輸，導(dǎo)致葉綠體中大量淀粉粒累積，淀粉的這種積累稱(chēng)為被動(dòng)存儲(chǔ)[28]。大量淀粉顆粒的產(chǎn)生擠壓葉綠體，使葉綠體腫脹加劇，南瓜接種白粉病菌后葉綠體中嗜鋨體數(shù)量增多反映葉綠體膜受到了過(guò)氧化損傷，感病材料JJJD 葉綠體中出現(xiàn)大量油滴表明葉綠體膜過(guò)氧化程度加深，對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)造成了不可逆的損傷?？傊?，結(jié)果期白粉病菌侵染引起南瓜葉片光合性能下降，主要?dú)w因于侵染點(diǎn)細(xì)胞壞死、葉綠素含量下降和葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞，抗病材料112-2 光合速率降幅較小與細(xì)胞壞死和葉綠體結(jié)構(gòu)受損程度較輕有關(guān)。