陳慧娥，賀康，賀楚晗，竹攸汀，楊金龍,3*，梁簫*

(1.上海海洋大學(xué) 國(guó)家海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心，上海 201306；2.上海市水產(chǎn)動(dòng)物良種創(chuàng)制與綠色養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306；3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州),廣東 廣州 511458)

厚殼貽貝Mytiluscoruscus是中國(guó)重要的海水養(yǎng)殖貝類之一，分布于黃海、渤海和東海沿岸海域。厚殼貽貝個(gè)體肥大、味道鮮美，且富含人體所必需的氨基酸、微量元素和礦物質(zhì)，深受廣大消費(fèi)者和養(yǎng)殖業(yè)者的喜愛[1-2]。營(yíng)浮游生活的厚殼貽貝幼蟲發(fā)育到眼點(diǎn)階段后會(huì)附著變態(tài)為稚貝，開始營(yíng)附著生活[3-4]。幼蟲附著變態(tài)率低會(huì)造成苗種數(shù)量不足、質(zhì)量不佳等問題，直接影響厚殼貽貝人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)效益的提升。通過細(xì)菌生物被膜定向附著技術(shù)可顯著提高厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)率，從而改善養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的苗種繁育問題[5-6]。

在海洋環(huán)境中，細(xì)菌主要以生物被膜形式存在。細(xì)菌在形成生物被膜過程中產(chǎn)生的胞外多聚物是其影響幼蟲附著變態(tài)的因素之一。在大多數(shù)生物被膜中，胞外多聚物的生物量比細(xì)菌含量高，其中多糖占大部分[7-8]。細(xì)菌生物被膜的胞外多糖種類繁多，主要包括藻酸鹽、纖維素和可拉酸等[9]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌藻酸鹽作為一種胞外多糖物質(zhì)，參與多種細(xì)菌生物被膜的形成和結(jié)構(gòu)功能的發(fā)揮。陳菲等[10]發(fā)現(xiàn)，百花丹素通過調(diào)節(jié)大腸埃希菌10389(E.coli10389)中rpoE和rseA基因的表達(dá)量，影響藻酸鹽的正常合成量，進(jìn)而影響生物被膜的形成。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，在生物被膜形成過程中，外源性添加纖維素會(huì)抑制生物被膜的形成及厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)[11]；而添加脂多糖則會(huì)促進(jìn)生物被膜的形成及厚殼貽貝幼蟲的附著[12]。由此可見，添加不同種類的細(xì)菌生物被膜胞外多糖物質(zhì)對(duì)生物被膜形成及厚殼貽貝附著具有不同的效果。

藻酸鹽根據(jù)來源不同，可分為藻類來源的海藻藻酸鹽和細(xì)菌來源的細(xì)菌藻酸鹽。這兩種藻酸鹽具有相同的基本結(jié)構(gòu)，均是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic acid)兩種單糖成分構(gòu)成，不同的是細(xì)菌藻酸鹽中C2或C3上的羥基常常發(fā)生不同程度的乙酰化[13]。市場(chǎng)上在售的藻酸鹽多為從大型藻類中提取的雜多糖。細(xì)菌藻酸鹽對(duì)生物被膜形成有一定作用，但來源于大型藻類且結(jié)構(gòu)相似的海藻藻酸鹽是否對(duì)海洋細(xì)菌生物被膜的形成產(chǎn)生影響尚不可知。本研究中，從生物被膜的細(xì)菌密度、膜厚和胞外產(chǎn)物等生物學(xué)特性角度，首次探討了在海假交替單胞菌Pseudoalteromonasmarina生物被膜形成過程中添加海藻藻酸鹽對(duì)生物被膜形成及厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響，以期為進(jìn)一步研究生物被膜定向誘導(dǎo)海洋貝類的附著變態(tài)機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為利用生物被膜提高貽貝育苗成功率提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用厚殼貽貝幼蟲于2021年5月取自浙江省舟山市嵊泗縣(30°72′N、122°77′E)，均為眼點(diǎn)時(shí)期的厚殼貽貝幼蟲，運(yùn)回上海海洋大學(xué)貝類分子實(shí)驗(yàn)室后，在水溫18 ℃、鹽度30的海水中避光充氣培養(yǎng)，養(yǎng)殖密度為1.0×104cells/L，每日投喂湛江等鞭金藻Isochrysiszhanjiangensis，每2 d換水一次。暫養(yǎng)一周后隨機(jī)取樣，用腎上腺素(EPI)進(jìn)行幼蟲變態(tài)檢驗(yàn)，若幼蟲附著變態(tài)后的稚貝率達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，則進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 菌株和生物被膜制備 試驗(yàn)用菌種均為海洋細(xì)菌P.marina，分離于自然生物被膜，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。采用梯度稀釋和平板劃線法分離純化，得到純種單菌落用于后續(xù)試驗(yàn)。

參照楊金龍等[14-15]的方法，取保存的菌種于ZoBell2216平板劃線后，挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，用滅菌過濾海水(autoclaved filtered seawater，AFSW)重復(fù)清洗菌體3次，直至上清液呈現(xiàn)清澈狀態(tài)，加入AFSW均勻混合至細(xì)菌懸浮,取混合菌液稀釋100倍后進(jìn)行細(xì)菌密度計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果確定需要添加的菌液和AFSW體積。

1.2.2P.marina與海藻藻酸鹽共同形成生物被膜的制備 稱取1 g從大型藻中提取的海藻藻酸鹽(以下簡(jiǎn)稱藻酸鹽)標(biāo)準(zhǔn)品[默克生命科學(xué)(上海)有限公司]，用500 mL AFSW溶解后調(diào)pH至7.6，制成母液待用。參照楊金龍等[15]的方法，計(jì)算20 mL體系需要添加的細(xì)菌懸浮液、藻酸鹽母液和AFSW，細(xì)菌終濃度為5.0×108cells/mL，藻酸鹽終質(zhì)量濃度為0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，以滅菌后的玻片為載體，放入無菌玻璃培養(yǎng)皿中，加入上述相應(yīng)體積海水與藻酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，18 ℃下避光培養(yǎng)48 h。

1.2.3 幼蟲附著變態(tài)試驗(yàn) 制備不同質(zhì)量濃度藻酸鹽與P.marina的共同生物被膜，每個(gè)濃度設(shè)置9個(gè)平行。用AFSW輕輕潤(rùn)洗附有生物被膜的玻片，再置于裝有20 mL AFSW的無菌玻璃培養(yǎng)皿中，加入20只眼點(diǎn)幼蟲，18 ℃下避光培養(yǎng)，記錄12、24、48、96 h 時(shí)幼蟲附著變態(tài)個(gè)體數(shù)，變態(tài)個(gè)體數(shù)占眼點(diǎn)幼蟲的比例即為變態(tài)率[16]。

1.2.4 生物被膜細(xì)菌密度計(jì)數(shù) 制備不同質(zhì)量濃度藻酸鹽與P.marina的共同生物被膜，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。參照楊金龍等[15]方法，使用體積分?jǐn)?shù)為5%的福爾馬林溶液固定生物被膜24 h后，再用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的吖啶橙染色5 min，晾干后在熒光顯微鏡(Olympus BX51，1 000放大倍率)下隨機(jī)挑選10個(gè)均勻視野計(jì)數(shù)。

1.2.5 生物被膜細(xì)菌胞外產(chǎn)物染色及生物量的測(cè)定 制備0、0.5 mg/L藻酸鹽與P.marina的共同生物被膜。參照Gonzlez-machado等[17]的染色方法，具體染料見表1。將生物被膜用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水清洗后，添加相應(yīng)染料，避光染色20 min，再用生理鹽水去除染料，避光晾干后制片。在激光掃描共聚焦顯微鏡CLSM(Leica TCS SP8，德國(guó))(63倍鏡)下，以單色激光作為光源，通過LASX軟件(1 024×1 024像素、單位厚度0.20 μm)逐層掃描生物被膜，每個(gè)視野獲得多張圖片，采集得到的圖片使用Image J軟件計(jì)算閾值(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)，再將閾值轉(zhuǎn)換為生物量(μm3)，生物量即為生物被膜胞外產(chǎn)物的含量。每種染料設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物被膜隨機(jī)選擇3個(gè)視野。用于膜厚拍攝的生物被膜需要提前置入體積分?jǐn)?shù)為5%的福爾馬林中固定0.5 h。

表1 試驗(yàn)用激光共聚焦熒光染料Tab.1 Laser confocal microscopy fluorescence dye in this study

1.3 數(shù)據(jù)處理

CLSM圖像經(jīng)Image J軟件處理后再計(jì)算體積，稚貝率、細(xì)菌密度、胞外產(chǎn)物生物量和可拉酸含量均用Prism作圖。試驗(yàn)結(jié)果采用JMP10.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻酸鹽對(duì)P.marina生物被膜誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響

對(duì)12、24、48、96 h幼蟲附著變態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，48 h已全部完成變態(tài)，故本研究中統(tǒng)計(jì)了48 h的幼蟲變態(tài)情況。從圖1可見：當(dāng)藻酸鹽質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，藻酸鹽與P.marina共同形成生物被膜誘導(dǎo)的稚貝率與單一細(xì)菌生物被膜相比無顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)藻酸鹽質(zhì)量濃度≥0.5 mg/L時(shí)，共同形成生物被膜對(duì)幼蟲附著變態(tài)有誘導(dǎo)作用(P<0.05)，但各濃度間無顯著性差異(P>0.05)。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia.圖1 藻酸鹽與P.marina共同形成生物被膜對(duì)厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響Fig.1 Effects of P.marina biofilms formed with alginate on larval settlement and metamorphosis of mussel Mytilus coruscus

2.2 藻酸鹽對(duì)P.marina生物被膜細(xì)菌密度的影響

從圖2可見：添加不同質(zhì)濃度藻酸鹽共同形成的生物被膜的細(xì)菌密度較單一細(xì)菌生物被膜顯著升高(P<0.05)；生物被膜細(xì)菌密度隨藻酸鹽濃度的增加而增加；當(dāng)藻酸鹽質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)，生物被膜的細(xì)菌密度達(dá)到最高值，之后無顯著變化。

圖2 藻酸鹽與P.marina共同形成生物被膜的細(xì)菌密度變化Fig.2 Change in the density of P.marina biofilms formed with alginate

2.3 藻酸鹽對(duì)P.marina生物被膜細(xì)菌分布和膜厚的影響

從圖3可見，添加質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的藻酸鹽溶液共同形成細(xì)菌生物被膜的膜厚(6.44 μm±0.09 μm)較單一細(xì)菌生物被膜的膜厚(5.36 μm±0.08 μm)增加20.15%，膜厚間有顯著性差異(P<0.05)，且細(xì)菌聚集程度更高。

圖3 藻酸鹽對(duì)P.marina生物被膜形態(tài)與膜厚的影響Fig.3 Effects of alginate on images and thickness of P.marina biofilms

2.4 藻酸鹽對(duì)P.marina生物被膜胞外多糖的影響

在形成生物被膜的過程中，添加質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的藻酸鹽溶液時(shí)，生物被膜上α多糖和β多糖含量明顯增加，聚集程度更高(圖4(a、c))。比較生物量發(fā)現(xiàn)，添加藻酸鹽后形成生物被膜的胞外α多糖和β多糖是單一細(xì)菌生物被膜的1.26倍和1.19倍(P<0.05)(圖4(b、d))。

圖4 藻酸鹽與P.marina共同形成生物被膜的胞外多糖形態(tài)和生物量Fig.4 Images and biovolume of extracellular polysaccharides of P.marina biofilms formed with alginate

2.5 藻酸鹽對(duì)P.marina生物被膜胞外蛋白的影響

添加質(zhì)量濃度為0.5 mg/L藻酸鹽溶液共同形成生物被膜的胞外蛋白分布均勻(圖5(a))，與單一生物被膜的胞外蛋白含量無顯著性差異(P>0.05)(圖5(b))。

圖5 藻酸鹽與P.marina共同形成生物被膜的胞外蛋白形態(tài)和生物量Fig.5 Images and biovolume of extracellular proteins of P.marina biofilms formed with alginate

2.6 藻酸鹽對(duì)P.marina生物被膜胞外脂類的影響

添加質(zhì)量濃度為0.5 mg/L藻酸鹽溶液共同形成生物被膜的胞外脂呈顆粒狀分散分布(圖6(a))，與單一生物被膜胞的胞外脂含量無顯著性差異(P>0.05)(圖6(b))。

圖6 藻酸鹽與P.marina共同形成生物被膜的胞外脂形態(tài)和生物量Fig.6 Images and biovolume of extracellular lipids of P.marina biofilms formed with alginate

2.7 藻酸鹽對(duì)P.marina生物被膜可拉酸的影響

經(jīng)過0.5 mg/L藻酸鹽處理的生物被膜有更高含量的可拉酸 (225.16 μg/mL±14.16 μg/mL)，較單一細(xì)菌生物被膜的可拉酸含量(151.40 μg/mL±16.16 μg/mL)增加了48.72%(P<0.05)(圖7)。

圖7 藻酸鹽與P.marina共同形成生物被膜的可拉酸含量Fig.7 Concent of colanic acid of P.marina biofilms formed with alginate

3 討論

附著變態(tài)是海洋無脊椎動(dòng)物生存的必經(jīng)階段，細(xì)菌生物被膜定向附著技術(shù)可以顯著提高厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)率。目前，關(guān)于藻酸鹽對(duì)生物被膜形成及對(duì)厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響研究鮮有報(bào)道。因此，本研究中首次在P.marina生物被膜的形成過程中添加藻酸鹽，以探討其對(duì)生物被膜生物學(xué)特性及厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響。

3.1 藻酸鹽促進(jìn)生物被膜的形成

胞外多糖是細(xì)菌胞外產(chǎn)物的主要部分，也是形成生物被膜不可或缺的條件[19-20]。藻酸鹽作為一種重要的胞外多糖，其含量的增多或減少均能不同程度地影響生物被膜的結(jié)構(gòu)[21-23]。本研究中，藻酸鹽與P.marina共同形成生物被膜的細(xì)菌密度、膜厚、胞外α多糖和β多糖含量顯著增加，而胞外蛋白與胞外脂類的含量無明顯變化。對(duì)銅綠假交替單胞菌的研究顯示，細(xì)菌藻酸鹽可能通過促進(jìn)細(xì)菌間的連接從而形成較厚的生物被膜[24-25]，而本研究中添加海藻藻酸鹽同樣能使生物被膜的膜厚增加，這說明其可能具有與細(xì)菌藻酸鹽相似的功能。藻酸鹽是由β-D-甘露糖醛酸及其同分異構(gòu)體α-L-古洛糖醛酸兩種結(jié)構(gòu)組成的一種線性多糖[26]，本試驗(yàn)中，添加海藻藻酸鹽后形成生物被膜的胞外α多糖和β多糖分別為單一細(xì)菌生物被膜的1.26倍和1.19倍。為了明確生物被膜胞外α多糖和β多糖的變化是否與添加的藻酸鹽有關(guān)，本研究中比較分析了添加藻酸鹽前后生物被膜胞外多糖中的可拉酸含量?？衫崤c藻酸鹽雖同屬細(xì)菌胞外多糖物質(zhì)，均含有α多糖和β多糖，但組成兩者的單糖并不相同，可拉酸由二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-α-D-Glc)、二磷酸鳥苷巖藻糖(GDP-β-L-Fuc)、二磷酸尿苷半乳糖(UDP-α-D-Gal)和二磷酸尿苷葡萄糖醛酸(UDP-α-D-Glca)組成[27-28]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與藻酸鹽共同形成的生物被膜胞外產(chǎn)物中可拉酸的含量顯著增加。因此，在生物被膜形成過程中添加藻酸鹽，可促進(jìn)生物被膜中其他胞外多糖的合成，從而促進(jìn)生物被膜的形成。

3.2 藻酸鹽與P.marina共同形成的生物被膜促進(jìn)厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)

生物被膜的生物學(xué)特征如細(xì)菌密度、膜厚等是影響海洋無脊椎動(dòng)物幼蟲附著變態(tài)的誘因之一[29-30]。已有研究顯示，細(xì)菌密度能夠影響華美盤管蟲Hydroideselegans[31]、紫貽貝Mytilusgalloprovincialis[32]等海洋無脊椎動(dòng)物幼蟲的附著變態(tài)。然而，并非所有細(xì)菌所形成生物被膜的細(xì)菌密度都與厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)有關(guān)。Peng等[33]以7株不同假交替單胞菌生物被膜為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)僅有3株假交替單胞菌生物被膜的細(xì)菌密度與幼蟲附著變態(tài)率相關(guān)，且用不同酶處理生物被膜發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)幼蟲附著變態(tài)的誘導(dǎo)因子可能包括多糖、蛋白和脂類。Zeng等[34]研究發(fā)現(xiàn)，解脂假交替單胞菌Pseudoalteromonaslipolytica自發(fā)突變菌株所形成的生物被膜，因其莢膜多糖減少或纖維素含量過量抑制了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)。Peng等[35]研究發(fā)現(xiàn)，P.marina中多糖合成基因01912的缺失導(dǎo)致胞外多糖可拉酸含量增加，從而促進(jìn)了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)。本研究中，不同質(zhì)量濃度的藻酸鹽與P.marina共同形成的生物被膜，誘導(dǎo)幼蟲附著變態(tài)的能力并未呈現(xiàn)出與細(xì)菌密度一樣的上升趨勢(shì)，由此推測(cè)，生物被膜細(xì)菌密度并不是誘導(dǎo)幼蟲附著變態(tài)的主要因素。與單一細(xì)菌生物被膜相比，添加藻酸鹽形成的生物被膜胞外α多糖和β多糖的含量顯著增加，可拉酸含量也顯著增加。因此，在生物被膜形成過程中添加藻酸鹽，能夠促進(jìn)生物被膜胞外多糖的產(chǎn)生，尤其是可拉酸的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)。

綜上所述，在P.marina生物被膜的形成過程中添加藻酸鹽，有利于形成較厚的生物被膜；同時(shí)，生物被膜細(xì)菌密度、膜厚的改變，以及胞外多糖可拉酸含量的增多，促進(jìn)了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)。因此，海藻藻酸鹽在細(xì)菌生物被膜形成過程中具有與細(xì)菌藻酸鹽相似的功能。本研究結(jié)果為解析多糖物質(zhì)在海洋細(xì)菌生物被膜形成中的作用機(jī)制，以及進(jìn)一步探究生物被膜與海洋貝類附著變態(tài)間的互作關(guān)系具有積極意義。本研究結(jié)果可為利用生物被膜提高厚殼貽貝育苗成功率、推動(dòng)厚殼貽貝人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供科學(xué)參考。

4 結(jié)論

1)添加藻酸鹽能夠增加P.marina生物被膜的細(xì)菌密度、膜厚、胞外α多糖和β多糖含量，促進(jìn)生物被膜的形成。

2)添加藻酸鹽使P.marina生物被膜中可拉酸等其他胞外多糖含量顯著增加，從而促進(jìn)生物被膜對(duì)厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的誘導(dǎo)能力。