楊雯雯，李軻，王婷婷，賈娟，劉心如

（1.河南工業(yè)大學(xué)漯河工學(xué)院，河南 漯河 462002；2.漯河職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 漯河 462002；3.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

桑葉（Folium mori），又名鐵扇子、蠶葉，是?？浦参锷５母稍锶~，是一種藥食同源的多功能植物，桑葉中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、多糖、生物堿等物質(zhì)，具有極高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。桑葉性寒，味甘、苦，有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、清肝明目的功效，可用于降血壓、降血脂、預(yù)防心肌梗塞、降血糖、護(hù)肝、消炎等[3-8]。桑葉中的蛋白質(zhì)含量較高，為21%～27%，且氨基酸種類齊全，可作為植物蛋白食品的原料[9-10]。

目前，桑葉蛋白的提取多采用超聲波輔助提取或者鹽水浸提法。李剛鳳等[2]通過正交試驗(yàn)法優(yōu)化了超聲波輔助提取桑葉蛋白的工藝；朱天明等[11]采用纖維素酶輔助提取桑葉蛋白。植物細(xì)胞中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，但細(xì)胞壁堅(jiān)固且不利于營養(yǎng)成分的溶出，超聲波獨(dú)具的物理特性能促使植物細(xì)胞組織變形或破壁，使植物中的有效成分提取更充分，提取率比傳統(tǒng)工藝顯著提高，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取[12]。將超聲波破碎和超聲波輔助提取相結(jié)合，配合適宜的溶劑提取天然活性成分，具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)。本文通過響應(yīng)面法優(yōu)化桑葉蛋白超聲輔助波提取工藝，對(duì)其氨基酸組分進(jìn)行分析，以期為桑葉蛋白的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉（澳桑1號(hào)）：漯河市義林農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，為高蛋白桑葉，霜后采摘，自然晾干后粉碎，過60目篩，于50℃烘干至恒重備用。

牛血清白蛋白：北京索萊寶生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán) G-250、NaCl、乙醇（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀：日本日立有限公司；BILOW-650Y超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：上海比朗儀器有限公司；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)：龍尼柯（上海）儀器有限公司；FA2004型電子天平：上海上平儀器有限公司；TFW100高速萬能粉碎機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫加熱磁力攪拌器：杭州儀表電機(jī)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉蛋白提取工藝

精確稱取桑葉粉末3.0 g，置于250 mL錐形瓶中，以一定的液料比加入NaCl溶液，搖勻后在設(shè)定的超聲波功率下進(jìn)行破碎，在超聲波清洗機(jī)中再次提取，于4 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定蛋白含量，其它上清液于2℃～8℃冷藏備用[1]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 液料比對(duì)桑葉蛋白提取率的影響

稱取桑葉粉3.0 g，以0.4%NaCl溶液為浸提液，以液料比 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）添加浸提液，在超聲波功率390 W下超聲波破碎20 min，40℃超聲波輔助浸提40 min，離心，測(cè)定桑葉蛋白提取率。

1.3.2.2 破碎時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取率的影響

稱取桑葉粉3.0 g，以0.4%NaCl溶液為浸提液，液料比40∶1（mL/g），在超聲波功率390 W下超聲波破碎10、15、20、25、30 min，40 ℃下超聲輔助浸提 40 min，離心，測(cè)定桑葉蛋白提取率。

1.3.2.3 破碎功率對(duì)桑葉蛋白提取率的影響

稱取桑葉粉3.0 g，以0.4%NaCl溶液為浸提液，以液料比 40∶1（mL/g）添加浸提液，在功率 130、260、390、520 W下超聲波破碎20 min，40℃下超聲輔助浸提40 min，離心，測(cè)定桑葉蛋白提取率。

1.3.2.4 浸提時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取率的影響

稱取桑葉粉3.0 g，以0.4%NaCl溶液為浸提液，以液料比40∶1（mL/g）添加浸提液，在超聲波功率390 W下超聲波破碎20 min，40℃下超聲輔助浸提20、30、40、50、60 min，離心，測(cè)定桑葉蛋白提取率。

1.3.2.5 NaCl濃度對(duì)桑葉蛋白提取率的影響

稱取桑葉粉3.0 g，以0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%NaCl溶液為浸提液，以液料比 40∶1（mL/g）添加浸提液，在超聲波功率390 W下超聲波破碎20 min，40℃下超聲輔助浸提40 min，離心，測(cè)定桑葉蛋白提取率。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理[13-14]，以蛋白提取率為響應(yīng)值，對(duì)桑葉蛋白提取工藝進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析方法試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 桑葉蛋白提取試驗(yàn)因素水平Table 1 Levels and factors of mulberry leaf protein extraction

1.3.4 桑葉蛋白提取率的測(cè)定

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定浸提液中蛋白含量，試驗(yàn)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.00522X+0.010 76，R2=0.999 3。取1 mL 1.3.1中上清液稀釋定容后的溶液，與配制好的考馬斯亮藍(lán)溶液顯色反應(yīng)后，于595 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算桑葉蛋白的提取率[1]。

式中：C為桑葉蛋白測(cè)定液中蛋白濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；D為提取液的稀釋倍數(shù)；M為桑葉粉質(zhì)量，g。

1.3.5 桑葉蛋白氨基酸組分的測(cè)定

在最佳條件下，提取桑葉蛋白，離心得到的提取液，用2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至4.0，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀在40℃下烘干至恒重，得到桑葉粗蛋白。用GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》的方法對(duì)粗蛋白中氨基酸的組分進(jìn)行測(cè)定。稱取一定量桑葉蛋白樣品放入水解管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液。真空封存，放在110℃恒溫箱中水解22 h后，取出，冷卻至室溫。將水解液過濾后定容至50 mL容量瓶中，準(zhǔn)確吸取1.0 mL濾液移入25 mL試管內(nèi)，在40℃～50℃加熱環(huán)境下減壓干燥至干。用2.0 mL pH2.2檸檬酸鈉緩沖溶液溶解，通過0.22 μm濾膜后，取20 μL溶液用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析[9，15-16]（色譜條件：色譜柱是磺酸型陽離子樹脂；檢測(cè)波長是570 nm和440 nm）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用Excel進(jìn)行整理，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過Origin 2018軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。運(yùn)用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)、方差分析和響應(yīng)面作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)桑葉蛋白提取率的影響

液料比對(duì)桑葉蛋白提取率的影響見圖1。

圖1 液料比對(duì)桑葉蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on protein extraction rate from mulberry leaves

從圖1可以看出，隨著溶劑用量的增大桑葉蛋白的提取率先增加后降低，當(dāng)液料比為40∶1（mL/g）時(shí)，桑葉蛋白提取率達(dá)到最大值，理論上溶劑用量越大，提取物質(zhì)的得率越大，但當(dāng)溶劑用量達(dá)到一定值后，溶劑中提取的蛋白與桑葉粉中的蛋白濃度相當(dāng)，植物細(xì)胞組織內(nèi)外的蛋白濃度差逐漸平衡，呈現(xiàn)一種溶出平衡趨勢(shì)，提取率不再有明顯的變化，此時(shí)蛋白己基本提取完全，繼續(xù)增加溶劑量，不僅會(huì)造成單位提取液中蛋白濃度的降低，而且浪費(fèi)溶劑和能源，也給后續(xù)的濃縮工作帶來困難[1-2]。因此，綜合提取效果和節(jié)約成本等方面考慮，選擇液料比為40∶1（mL/g）。

2.1.2 破碎時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取率的影響

破碎時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 破碎時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of crushing time on protein extraction rate of mulberry leaves

由圖2可知，在超聲波作用下，桑葉蛋白細(xì)胞破碎程度逐漸增大，蛋白質(zhì)的溶出量逐漸增多，但超聲波作用時(shí)間過長，會(huì)影響蛋白的活性[17-18]，提取時(shí)間超過20 min之后，其提取率沒有明顯的增加，因此選擇破碎時(shí)間為20 min為最佳。

2.1.3 破碎功率對(duì)桑葉蛋白提取率的影響

破碎功率對(duì)桑葉蛋白提取率的影響見圖3。

由圖3可知，桑葉蛋白提取率隨破碎功率的增加呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。在功率從130 W升高到260 W時(shí)，提取率緩慢增加，功率從260 W升高到390 W時(shí)，蛋白提取率明顯升高。隨后伴隨提取功率繼續(xù)增加，蛋白提取率降幅明顯。這可能是因?yàn)殡S著超聲功率的不斷提升，理化作用變得更為劇烈，對(duì)細(xì)胞的破碎效果加強(qiáng)；當(dāng)功率達(dá)到390 W時(shí)，細(xì)胞被理化因素充分破壞，得率最大；隨著功率的繼續(xù)提升，理化作用過于強(qiáng)烈，所產(chǎn)生的熱效應(yīng)及其他影響因素破壞了桑葉蛋白的構(gòu)型，故蛋白提取率略呈下降趨勢(shì)[2，13]。因而選擇破碎功率為390 W為宜。

2.1.4 浸提時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取率的影響

浸提時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取率的影響見圖3。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on protein extraction rate of mulberry leaves

由圖4可知，在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，蛋白的溶出率隨著浸提時(shí)間的延長而提高，適當(dāng)延長超聲波的作用時(shí)間，可以增加細(xì)胞內(nèi)的蛋白溶出，當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到40 min時(shí)，蛋白的溶出率趨于平衡，繼續(xù)延長浸提時(shí)間，蛋白質(zhì)提取率降低，這可能是由于超聲時(shí)間太長，提取液溫度不斷升高，由于蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性較弱，可能導(dǎo)致部分蛋白發(fā)生變性，且細(xì)胞中其他物質(zhì)溶出，影響了顯色反應(yīng)，從而導(dǎo)致得率下降[19]。綜合考慮，選取浸提時(shí)間為40 min比較適宜。

2.1.5 NaCl濃度對(duì)桑葉蛋白提取率的影響

NaCl濃度對(duì)桑葉蛋白提取率的影響見圖5。

圖5 NaCl濃度對(duì)桑葉蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on protein extraction rate of mulberry leaves

從圖5可以看出，隨著NaCl溶液濃度的增大，桑葉蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)NaCl濃度為0.4%時(shí)，其提取率最高，隨后提取率開始下降。隨著NaCl濃度的升高，電荷數(shù)增加，水化層遭到破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度不斷增加，蛋白提取率提高；而高濃度的NaCl濃度可能使得蛋白提取過程發(fā)生鹽析現(xiàn)象，導(dǎo)致桑葉蛋白提取率隨著NaCl濃度的增高而降低[2，20]。因此桑葉蛋白提取的最佳NaCl濃度為0.4%。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Center combination design scheme and results of response surface

對(duì)桑葉蛋白提取率的各因素進(jìn)行多元回歸，擬合得到桑葉蛋白提取率與液料比、破碎時(shí)間、浸提時(shí)間、NaCl濃度之間的二次回歸方程：桑葉蛋白提取率/%=9.140 00+0.424 17A+0.013 333B-0.099 167C+0.145 00D+0.020 000AB+0.100 00AC+0.117 50AD+0.095 000BC-0.33500BD+0.54250CD-0.74125A2-0.83250B2-0.66375C2-0.872 50D2。

根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果，以桑葉蛋白提取率為響應(yīng)值，對(duì)桑葉蛋白提取工藝的模型進(jìn)行回歸分析結(jié)果見表3。

表3 桑葉蛋白提取工藝回歸方程模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation model of mulberry leaf protein extraction process

由方差分析結(jié)果中的 P 值可知：A、C、D、BD、CD、A2、B2、C2和 D2對(duì)蛋白提取率影響極顯著，AD 對(duì)桑葉中蛋白提取率影響顯著。此模型F=92.47，P＜0.01，結(jié)果影響極顯著，失擬項(xiàng)P=0.627 2＞0.05，結(jié)果不顯著，表明模型對(duì)數(shù)據(jù)有較好的擬合作用，可以用該方程代替真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。相關(guān)系數(shù)R2=0.989 3，說明98.93%以上的變化可由自變量解釋，僅有1.07%的變化不被解釋。調(diào)整系數(shù)Radj2=0.978 6，說明該模型的擬合程度較好，可以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)出提取桑葉蛋白的最佳工藝條件。以上各因素對(duì)蛋白提取的影響順序?yàn)橐毫媳龋綨aCl濃度＞浸提時(shí)間＞破碎時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用的分析

根據(jù)回歸模型繪制相應(yīng)的響應(yīng)面曲面圖。各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，兩因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)面值的影響程度和響應(yīng)面的曲面陡峭程度呈正比，即交互作用對(duì)響應(yīng)值影響越強(qiáng)，曲面越陡峭，反之越平緩[21-23]。結(jié)果見圖6～圖11。

圖6 液料比和破碎時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plot of interactions between liquid-solid ratio and crushing time

圖7 液料比和浸提時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plot of interactions between liquid-solid ratio and extraction time

圖8 液料比和NaCl濃度交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plot of interactions between liquid-solid ratio and NaCl concentration

圖9 破碎時(shí)間和浸提時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plot of interactions between crushing time and extraction time

圖10 破碎時(shí)間和NaCl濃度交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plot of interactions between crushing time and NaCl concentration

圖11 浸提時(shí)間和NaCl濃度交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.11 Response surface and contour plot of interactions between extraction time and NaCl concentration

由圖6～圖11可知，NaCl濃度和浸提時(shí)間的交互作用，破碎時(shí)間和NaCl濃度的交互作用，對(duì)蛋白提取率影響極顯著，液料比和NaCl濃度的交互作用影響較顯著，其他交互項(xiàng)不顯著。

2.2.3 最佳工藝條件的驗(yàn)證

通過Box-Benhnken優(yōu)化分析，得到超聲波輔助提取桑葉蛋白的最佳工藝條件：液料比42.94∶1（mL/g），破碎時(shí)間19.95 min，浸提時(shí)間39.88 min，NaCl濃度0.42%，在此優(yōu)化條件下，理論上得到的桑葉蛋白提取率為9.21%。在最佳的提取條件下，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。根據(jù)實(shí)際條件，將最佳提取條件修正為液料比43∶1（mL/g），破碎時(shí)間20 min，浸提時(shí)間40 min，NaCl濃度0.42%，此條件下桑葉蛋白提取率為9.19%，理論值與實(shí)際值很接近，說明該試驗(yàn)的擬合性能較好，該模型具有很好的分析預(yù)測(cè)能力，分析得到的最佳提取工藝合理，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 桑葉蛋白氨基酸組分的分析

用GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》的方法測(cè)定粗蛋白中氨基酸的組分。利用氨基酸組分測(cè)定儀對(duì)提取的桑葉粗蛋白中的17種氨基酸組分進(jìn)行分析測(cè)定，分析測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 桑葉粗蛋白氨基酸組分Table 4 Amino acid components in crude protein of mulberry leaves

如表4所示，桑葉粗蛋白中氨基酸種類齊全，檢測(cè)出了17種氨基酸，其中包括除色氨酸以外的7種必需氨基酸，氨基酸總含量為77.38 g/100 g粗蛋白，其中必需氨基酸含量為29.11 g/100 g粗蛋白，占總氨基酸含量的 37.6%，必需氨基酸（essential amino acids，EAA）/非必需氨基酸 （non-essential amino acids，NEAA，NEAA）為0.603，略低于聯(lián)合國糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的必需氨基酸含量40%和EAA/NEAA值0.614[9]。桑葉粗蛋白中含量最高的兩種氨基酸為谷氨酸和天門冬氨酸，分別占氨基酸總量的13.3%和10.8%，這兩種氨基酸是構(gòu)成鮮味的主要成分，在醫(yī)藥、食品和化工等方面有著廣泛的用途[17]。

4 結(jié)論

本文研究了桑葉蛋白的超聲波輔助提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過高效液相色譜法對(duì)桑葉蛋白中的氨基酸組分進(jìn)行測(cè)定。桑葉蛋白的最佳提取工藝為液料比43∶1（mL/g），破碎時(shí)間 20 min，浸提時(shí)間 40 min，NaCl濃度0.42%，在此條件下桑葉蛋白的提取率為9.19%。提取的桑葉粗蛋白中的氨基酸種類豐富，其中必需氨基酸含量為29.11 g/100 g粗蛋白，占總氨基酸含量的37.6%，必需氨基酸（EAA）/非必需氨基酸（NEAA）為0.603，接近于FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的必需氨基酸含量40%和EAA/NEAA值0.614。因而桑葉蛋白的含量高，且氨基酸種類豐富，是一種十分優(yōu)良的蛋白質(zhì)資源，具有廣闊的發(fā)展前景。