時曉麗，沙蕊，彭漢勇，溫蓓,3,*

1.晉中學院生物科學與技術系，晉中 030619

2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境化學和生態(tài)毒理學國家重點實驗室，北京 100085

3.中國科學院大學，北京 100049

合成納米材料(ENMs)是指在三維空間中至少有一個維度或內部結構在納米尺度(1～100 nm)或由它們作為基本單元構成的材料，相當于10～1 000個原子緊密排列在一起的尺度。由于合成納米材料具有獨特的物理化學特性，已被廣泛應用于能源、電子、食品、農業(yè)、環(huán)境科學、化妝品和醫(yī)藥等領域[1]。例如，每年生產3 000 t二氧化鈦(TiO2)納米粒子，其中50%以上用于防曬霜等個人護理產品[2-3]。合成納米材料也被作為藥物或成像探針載體，用于診斷和治療腦神經失調等多種疾病，如脂質體、樹狀大分子、金屬納米粒子、碳納米管和量子點等[1]。

隨著合成納米材料的大量生產和使用，在環(huán)境中的含量急劇增加，部分合成納米材料在粉塵和煙霧中以超細顆粒物的形式長期存在[4]，其安全問題引起公眾的廣泛關注。由于合成納米材料的體積較小，極易進入并長期停留在機體外周組織中，與活體組織和細胞相互作用，發(fā)生構象變化，誘導組織和細胞的功能發(fā)生改變[5]。研究發(fā)現合成納米材料可以穿過或繞過血腦屏障(BBB)，進入中樞神經系統(CNS)，引起血腦屏障和神經遞質功能障礙、神經退行性病變及認知學習和記憶功能障礙進而誘發(fā)神經毒性[6]。由于神經組織發(fā)揮生理功能的條件要求嚴格，且神經元細胞難以再生的特點，使得神經毒性成為合成納米材料研究的關注熱點和難點問題。

合成納米材料的神經毒性分子機制仍在探索中，目前已報道的研究工作主要涉及氧化應激誘導細胞凋亡或自噬、免疫反應和炎癥等，不同合成納米材料通過激活特定的信號通路來影響神經細胞的功能。但合成納米材料神經毒性研究亟需進一步拓展和深入。本文綜述了合成納米材料和靶細胞(特別是神經元和膠質細胞)之間相互作用的分子機制，并對相關領域發(fā)展方向作了展望。

1 影響合成納米材料毒性的因素(Factors influencing toxicity of ENMs)

合成納米材料由于其材料尺寸在納米級，產生了不同的光、熱、電、磁和力等性質，如吸附、分散、比表面積、表面活性以及催化性能等[7]。合成納米材料按化學成分可分為碳納米材料、無機納米材料、有機納米材料和雜化納米材料等[8]，其毒性主要取決于化學組成、尺寸、形狀、表面性質(電荷、表面涂層等)、濃度和降解性能等參數[9]。以下部分簡述了影響合成納米材料毒性的主要影響因素。

1.1 尺寸和形狀

納米材料的尺寸影響其進入細胞及與機體作用的方式和毒性效應。合成納米材料(特別是過渡金屬及金屬氧化物納米粒子)表面的電子供體或受體與分子氧反應生成超氧自由基或羥基自由基，進而氧化其他生物分子，顆粒尺寸越小活性氧(ROS)的生成量越高。>50 nm合成納米材料則通過吞噬作用進入細胞，而幾納米到幾百納米的合成納米材料通過胞飲或大型胞飲作用內化，網格蛋白依賴的胞吞作用可能是細胞攝取<100 nm合成納米材料的主要機制[10]。Park等[11]發(fā)現粒徑較小的納米銀顆粒(<71 nm)能夠被小腸吸收通過血液循環(huán)系統進入腦、肺、肝和腎等器官，而粒徑較大的顆粒(323 nm)無法被小腸吸收。合成納米材料的形狀和長徑比是影響其毒性的關鍵因素。合成納米材料具有球狀、平板狀、管狀、環(huán)形和纖維狀等多種形狀。與纖維狀和桿狀合成納米材料相比，球形合成納米材料更易被細胞胞吞[12]。Chithrani等[13]發(fā)現細胞對合成納米材料的吸收率與形狀有關，細胞對球形納米金(74 nm或14 nm)的吸收率分別比金納米棒(74 nm×14 nm)的高500%和375%。

1.2 表面性質

合成納米材料表面電荷影響其與生物大分子(如蛋白質等)的相互作用，從而產生不同的吸收、排出速率和組織分布[7]。通過調節(jié)合成納米材料的表面電荷能夠影響細胞對合成納米材料的吞噬作用。例如，帶正電荷的合成納米材料更容易穿過帶負電荷的細胞膜，細胞攝入量更高。與中性合成納米材料相比，帶正電荷的合成納米材料可迅速從血液中被巨噬細胞清除[14]。與聚對苯乙烯磺酸鈉(PSS)或十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)修飾的金納米棒相比，聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDAC)修飾的金納米棒在MCF-7細胞中攝取量最高[15]。同時，合成納米材料表面修飾能夠降低合成納米材料團聚，延緩其降解速率并抑制蛋白冠的形成，進而增加其生物利用度。Li等[16]發(fā)現組成和大小相同的L-谷胱甘肽或D-谷胱甘肽修飾的DdTe量子點(L/D-GSH-QDs)對細胞毒性存在差異，D-GSH-QDs的毒性低于L-GSH-QDs的。

1.3 金屬納米材料的溶解和金屬離子的釋放

金屬納米材料在組織和器官內會被溶解，產生的離子影響其細胞毒性。二氧化硅(SiO2)納米粒子能夠進入人臍靜脈內皮細胞HUVEC的胞漿和溶酶體，并溶解生成Si離子而排出胞外[17]。氧化鐵納米顆粒(IONPs)在體內代謝產生鐵離子，與血紅蛋白結合進入紅細胞。γ-Fe2O3磁性納米粒子(MNPs)與間充質干細胞溫育1個月，通過透射電鏡(TEM)觀察發(fā)現大部分鐵粒子溶解成較小的鐵蛋白[18]，該蛋白在人體內調節(jié)鐵含量方面起著重要作用[14]。Qu等[19]通過同步輻射技術(X射線原位微區(qū)元素成像)結合化學結構分析技術研究量子點在秀麗線蟲體內代謝與溶解過程，發(fā)現量子點經飲食攝入的方式進入消化系統，被內皮細胞攝取并定位于溶酶體，且能夠從消化系統遷移進入生殖系統，同時量子點芯殼結構破壞釋放出有毒鎘離子，進一步導致生殖障礙和發(fā)育異常。Gliga等[20]發(fā)現10 nm檸檬酸鹽包被AgNPs處理培養(yǎng)基4 h，其Ag+釋放量為10.6%，顯著高于10 nm PVP包被AgNPs的Ag+釋放量(5.8%)。

2 合成納米材料進入血腦屏障的攝取機制和轉運途徑(Uptake mechanism and transport pathways of ENMs in the blood-brain barrier)

血腦屏障(BBB)允許親脂性分子、O2和CO2的自由擴散和運輸，而其他化合物主要通過轉運體或受體介導的胞吞作用進入大腦[22]。體內和體外研究均證實合成納米材料可以經口服或注射的方式通過腦毛細血管內皮細胞上一系列轉運體或受體跨過血腦屏障進入大腦，或經呼吸道通過鼻上皮進入嗅球繞過血腦屏障進入中樞神經系統[5,23-24]。通過對懷孕小鼠靜脈注射70 nm SiO2和35 nm TiO2納米粒子，發(fā)現合成納米材料能夠穿過懷孕小鼠的胎盤屏障進入子鼠的胎盤、大腦和肝臟[25]。Korzeniowska等[26]采用永生化腦微血管內皮細胞(hCMEC/D3)和原代星形膠質細胞為細胞模型，研究納米銀和納米鉑共同暴露對人腦細胞的影響，納米銀和納米鉑共暴露毒性大于單獨暴露納米銀，且能夠增強BBB的滲透性。TiO2納米粒子能夠誘導斑馬魚幼魚和PC12細胞出現帕金森樣癥狀，導致孵化過早并干擾其運動，并能夠誘導斑馬魚腦組織中ROS生成，導致下丘腦區(qū)域細胞死亡[27]。石墨烯基納米粒子神經毒性在多種生物模型中均有報道，如人類神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y和SK-N-SH)[28-29]、膠質細胞[30-31]、秀麗隱桿線蟲[32]、斑馬魚[33]和小鼠[34]等。

合成納米材料通過跨細胞轉運、細胞旁途徑、受體介導的胞吞作用(帶有轉鐵蛋白、胰島素或載脂蛋白E(Apo E)等配體的合成納米材料)、吸附介導的胞吞作用(帶正電荷的合成納米材料)和細胞(巨噬細胞)介導的胞吞作用等不同方式跨過血腦屏障(圖1)，沉積在嗅球、海馬、大腦皮層和紋狀體等不同的大腦區(qū)域[21,35-36]。人工納米脂粒表面富含Apo E分子能夠與血腦屏障上過表達的低密度脂蛋白(LDL)受體之間特異性識別，經網格蛋白介導的胞吞作用將合成納米材料攝入細胞，通過跨細胞轉運途徑穿過BBB[37]。Mendon?a等[38]采用基質輔助激光解吸電離質譜成像(MALDI-MSI)表征還原氧化石墨烯在大鼠大腦中的時空分布，發(fā)現還原氧化石墨烯通過細胞旁途徑進入BBB。Liu等[39]通過體外和體內實驗研究發(fā)現SiO2納米粒子通過ROS和ROCK/JNK介導的信號通路誘導緊密連接喪失和細胞骨架重排，進而干擾BBB結構和功能。Kafa等[40]采用一種低密度脂蛋白受體相關蛋白-1(LRP1)的配體angiopep-2(ANG)，作為一種靶向多壁碳納米管腦傳遞配體，能夠顯著提高多壁碳納米管的血腦屏障轉運。Huang等[41]采用乳鐵蛋白(Lf)修飾樹枝狀陽離子納米粒子的腦靶向配體，發(fā)現受體介導和吸附介導的胞吞作用有助于Lf修飾的納米粒子跨過BBB。除此之外，巨噬細胞能夠吞噬血液中的合成納米材料，通過血腦屏障釋放合成納米材料進入中樞神經系統[21]。

圖1 不同物理化學性質的合成納米材料(ENMs)通過血腦屏障(BBB)的方式[21]注：ROS表示活性氧；RNS表示活性氮。Fig.1 Engineered nanomaterials (ENMs) with specific physicochemical properties could pass through the blood-brain barrier (BBB) by way of several different strategies[21]Note:ROS stands for reactive oxygen species;RNS stands for reactive nitrogen species.

在合成納米材料內化過程開始前，細胞膜是合成納米材料與細胞相互作用的第一個接觸部位，細胞膜上的脂質和蛋白質可能是其作用靶點。在神經元(和膠質細胞)的神經遞質和神經激素受體中，轉運體轉運和通道轉運是調節(jié)神經元活動和對外界刺激做出響應的主要方式。合成納米材料能夠通過影響神經元信號通路和其他參與神經信號傳遞的相關蛋白表達而對細胞造成損傷。離子轉運蛋白是細胞內離子穩(wěn)態(tài)的主要調控因子，目前在這方面的有關研究相對缺乏。Fe2O3納米粒子能夠抑制大鼠腦細胞內的Na+-K+泵、Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性[43]。TiO2納米粒子(5 nm，5～30 μg·mL-1)能夠降低大鼠海馬神經元細胞的Na+-K+泵和Ca2+-ATPase的活性[44]。ZnO納米粒子(30 nm，2.5～10 μg·mL-1)也能夠降低大鼠視網膜神經節(jié)細胞質膜上Ca2+-ATPase的活性[45]。AgNPs通過網格蛋白/胞膜窖依賴的胞吞作用或胞飲作用進入細胞，經囊泡運輸進入溶酶體，溶酶體內的酸性環(huán)境導致AgNPs釋放Ag+[46]。一方面，AgNPs誘導的氧化應激、堿化、滲透性腫脹或超負荷引起溶酶體膜滲透性改變，溶酶體膜完整性或酸度的喪失導致溶酶體功能障礙。AgNPs和Ag+從溶酶體逃逸到胞質中。胞質中的AgNPs和Ag+引起胞內ROS水平增加，從而誘導細胞的應激反應(如：內質網應激、DNA損傷等)和細胞器損傷(線粒體功能障礙)。另一方面，AgNPs還可以引起質膜的脂質過氧化而破壞細胞膜系統的完整性，使其能夠直接穿過質膜進入細胞。除此之外，AgNPs與蛋白質巰基相互作用，導致蛋白質發(fā)生錯誤折疊，進而引發(fā)內質網應激。在ROS或應激反應和細胞器損傷協同作用下細胞自噬系統被激活。由于AgNPs誘導溶酶體發(fā)生損傷，溶酶體功能障礙與自噬體-溶酶體融合受阻密切相關，AgNPs中斷溶酶體途徑可能嚴重干擾自噬機制的功能，由于自噬清除途徑無法發(fā)揮作用可能進一步加劇AgNPs誘導的毒性[47](圖2)。

圖2 細胞攝取和轉運納米銀的途徑[42]Fig. 2 Uptake mechanism and transport pathways of silver nanoparticles[42]

3 合成納米材料誘導神經毒性的分子機制(Molecular mechanisms of neurotoxicity exerted by ENMs)

合成納米材料誘導神經毒性的主要分子機制包括氧化應激、DNA損傷、炎癥反應、自噬和凋亡等(圖3)。在多數情況下，合成納米材料通過多種機制共同產生神經毒性。

圖3 合成納米材料(ENMs)誘導神經毒性的潛在分子機理[6]Fig. 3 Mechanisms of neurotoxicity induced by ENMs[6]

3.1 氧化應激

圖4 合成納米材料誘導ROS產生的機制[21]Fig. 4 Mechanisms of ROS production induced by ENMs [21]

氧化應激能夠增強血腦屏障的通透性，并誘導BBB產生炎癥。Liu等[39]發(fā)現SiO2納米粒子誘導腦微血管內皮細胞(BMECs)產生ROS，ROS通過下調緊密連接蛋白(CLDN5、OCLN等)來增加BBB的通透性，導致微管不穩(wěn)定而引發(fā)炎癥反應。Nel等[9]認為ROS的過量產生是導致氧化應激和炎癥反應的主要因素，低濃度ROS通過nrf-2轉錄因子激活細胞抗氧化元件，較高濃度ROS通過激活NF-κB信號通路進而引起炎癥反應，更高濃度ROS則啟動細胞凋亡程序。此外，合成納米材料能夠誘導小膠質細胞產生ROS，并對周圍的神經元造成損傷[21,58]。合成納米材料能夠激活小膠質細胞和NLRP3炎性小體而觸發(fā)炎癥反應，該反應是由ROS和NF-κB信號通路激活介導的[6]。

合成納米材料通過胞飲和網格蛋白介導的胞吞作用進入細胞，經胞吞-溶酶體途徑轉移到溶酶體，誘導線粒體ROS的產生從而導致溶酶體破裂，激活NLR家族的NLRP3炎性小體，調節(jié)促炎細胞因子的釋放(如IL-1β)[58-61]。30 nm TiO2納米粒子(5 μmol·L-1)能夠進入溶酶體等亞細胞結構，誘導活性氧的產生和促炎細胞因子IL-1β的表達發(fā)生改變[62]。45 nm氧化鐵納米粒子(3 mmol·L-1)能夠在小膠質細胞的溶酶體中大量積累，對小膠質細胞的毒性遠高于對神經元和星形膠質細胞的毒性[63]。合成納米材料能夠激活小膠質細胞，使小膠質細胞的形態(tài)由分枝狀轉變?yōu)閳A形巨噬細胞樣并產生促炎細胞因子，如白細胞介素、腫瘤壞死因子蛋白家族和炎癥趨化因子等[21]，還能激活小膠質細胞細胞膜上的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)，如TLR2、TLR4，活化的TLRs進一步激活NF-κB信號通路導致炎癥因子的釋放[64]。與此同時，合成納米材料也可以通過抑制MAPK磷酸酶活性而激活ERK1/2導致炎癥細胞因子的釋放。

3.2 DNA損傷

合成納米材料誘導DNA損傷的方式有2種，一種是合成納米材料進入細胞核直接作用于DNA或DNA相關蛋白，另一種是由ROS和炎癥引起的DNA損傷[21]。El-Ghor等[65]發(fā)現TiO2納米粒子能夠誘導小鼠大腦發(fā)生DNA損傷。AgNPs能夠下調參與DNA損傷反應/修復系統基因的表達水平(XRCC1、XRCC13、FEN1、RAD51C和RPA1等)[66]。AgNPs(100 nm)通過PAK、MAPK和PPP2A途徑間接誘導DNA損傷和細胞凋亡[67]。CdTe量子點(QDs)通過提高小膠質細胞BV-2胞內鎘(Cd)離子濃度誘導ROS的生成而間接導致DNA損傷[68]。ZnO納米粒子能夠誘導SH-SY5Y細胞DNA氧化損傷和H2AX磷酸化，即DNA雙鏈斷裂[69]。DNA損傷導致細胞周期阻滯，為DNA修復系統提供充足的時間，而低效的DNA修復能夠進一步誘導細胞凋亡。Valdiglesias等[70]發(fā)現TiO2納米粒子能夠誘導SH-SY5Y細胞產生微核和DNA雙鏈斷裂，進而誘導細胞凋亡。

3.3 細胞死亡

合成納米材料誘導神經細胞死亡的途徑包括3個方面。(1)依賴于caspase的凋亡：死亡受體途徑、線粒體途徑和內質網應激途徑。(2)壞死：在TNFα作用下，RIP3通過與RIP1形成壞死復合體，介導caspase非依賴性細胞壞死。(3)自噬：通過PI3K-Akt-mTOR通路負反饋調節(jié)機制進行調控[21]。

合成納米材料誘導神經膠質細胞凋亡涉及多條信號通路。MAPKs是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，包括JNK(c-Jun氨基末端激酶)、ERK(胞外調節(jié)蛋白激酶)、p38 MAPK，參與細胞的發(fā)育、增殖、分化和凋亡。ZnO納米粒子通過JNK信號通路和線粒體內源性凋亡途徑來誘導原代星形膠質細胞的凋亡[71]，也能夠誘導小神經膠質細胞的ERK發(fā)生磷酸化，釋放細胞色素c到細胞質，激活caspase-9(內源性凋亡通路的生物標志物)，還能夠誘導p38 MAPK的磷酸化，激活caspase-8和caspase-3，進而導致PARP的裂解[31]。TiO2納米粒子能夠誘導C6和U373小膠質細胞ROS生成量增加，進而誘發(fā)炎癥和細胞凋亡[51]。Zhang等[72]研究發(fā)現AgNPs誘導的細胞凋亡過程中內質網應激起著重要的調節(jié)作用，產生了內質網應激標志物的變化，如PERK、eIF2α、IRE1的磷酸化、XBP-1的剪接、ATF6(內質網應激傳感器)的裂解、Grp-78和CHOP/GADD153蛋白表達水平的上調。其中，ATF6在AgNPs誘導細胞焦亡過程中起到至關重要的作用[73]。由多種合成納米材料(如聚苯乙烯納米粒子、TiO2納米粒子、Al2O3納米粒子和Fe3O4納米粒子)誘導的內質網應激可以介導自噬激活。PERK依賴的內質網應激途徑可能是自噬和凋亡的交互作用機制的基礎[47]。壞死是一種非依賴于caspase的細胞死亡途徑。氧化鋁納米粒子能夠誘導ICR小鼠海馬細胞壞死和凋亡，其中壞死是導致ICR小鼠神經行為缺陷的直接原因[74]。Sun等[75]發(fā)現Ag+對大鼠腦星形膠質細胞的毒性顯著高于AgNPs，Ag+損壞細胞膜的完整性進而誘導細胞壞死，而AgNPs通過增強caspase的活性從而誘導細胞凋亡。合成納米材料誘導的神經細胞壞死及其作用機制有待更深入的研究。

自噬是一種合成納米材料的潛在毒性作用機制[76]，但有關合成納米材料與神經毒性關系的研究報道非常有限。納米金能夠增加人胚肺成纖維細胞(MRC-5)中自噬相關蛋白的表達水平，同時生成過量的丙二醛(MDA)[77]。SiO2納米粒子通過抑制自噬特異性蛋白的磷酸化和PI3K-Akt-mTOR信號通路來促進PC12細胞自噬[54]。ZnO納米粒子能夠誘導PINK1/parkin介導的選擇性線粒體自噬過程，parkin蛋白從細胞質轉運到線粒體以及PINK1蛋白表達水平的下調，從而導致線粒體自噬的發(fā)生[29]，而線粒體功能障礙與多種神經退行性疾病有關[6]。AgNPs能夠誘導阻斷自噬通量，引發(fā)自噬小體積累，從而在細胞和機體水平上加劇AgNPs誘導的穩(wěn)態(tài)失衡[47]。氧化鐵納米粒子和TiO2納米粒子誘導人大腦內皮細胞(HCECs)發(fā)生自噬，同時產生氧化應激和DNA斷裂[78]。

3.4 DNA甲基化

阿爾茲海默癥、亨丁頓舞蹈癥和肌萎縮性脊髓側索硬化癥等神經退行性疾病均受到DNA甲基化的調控。神經膠質瘤細胞中興奮性氨基酸轉運蛋白(EAAT2)啟動子的超甲基化導致星形膠質細胞EAAT2的表達缺失，通過抑制DNA甲基轉移酶活性能夠恢復EAAT2的轉錄。精神疾病與大腦中異常的DNA甲基化狀態(tài)有關[76]。合成納米材料引起DNA甲基化水平異常已有相關研究報道。SiO2納米粒子能夠降低人永生化角質形成細胞HaCaT的整體DNA甲基化水平，并改變PARP-1啟動子的甲基化狀態(tài)[79-80]。AgNPs和氧化石墨烯在A549和293T細胞中通過改變DNMT酶和TET(ten-eleven translocation)蛋白的濃度導致DNA整體甲基化水平的改變。TET蛋白可以催化5-甲基胞嘧啶(5-mC)轉化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)，是DNA去甲基化過程中的一種重要的酶。DNA的甲基化和去甲基化過程均易受合成納米材料暴露的影響[81]。然而，DNA甲基化在合成納米材料誘導的神經毒性中的作用有待進一步研究。

4 總結與展望(Conclusion and perspectives)

合成納米材料穿過或繞過血腦屏障進入中樞神經系統的過程，受到合成納米材料的化學組成、尺寸、表面性質(電荷、表面涂層等)、形狀、濃度和降解性等性質的影響。通過對多種不同類型的合成納米材料的神經毒性研究，揭示了一系列潛在的分子機制，包括氧化應激、遺傳毒性、炎癥反應、自噬和細胞凋亡、對細胞組分的直接損傷、DNA甲基化等。不同的毒性機制往往會協同產生，例如，氧化應激會引發(fā)炎癥、DNA損傷和細胞凋亡等，DNA損傷也能夠導致細胞凋亡。目前，合成納米材料神經毒性的評價主要針對無機納米材料，如金屬及金屬氧化物納米材料、碳基納米材料，而有機納米材料的研究尚未開展，如高分子納米粒子和脂質體。在合成納米材料毒理研究中已發(fā)現的多種分子機制如細胞自噬、壞死以及DNA甲基化等，需要更多的研究證據。此外，合成納米材料在跨越BBB過程中，與生物分子作用形成蛋白冠，改變了合成納米材料的理化性質，影響其轉運途徑和產生毒性的機制，其表面蛋白冠組成對神經毒性的影響亟需系統深入的研究。