宮路路，趙志敏，楊 顏，王若曦，李 潔*

（1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校 醫(yī)學技術系，貴州 遵義 563000；2.云南朗恒科技有限公司，云南 昆明 650500；3.雷山縣丹江鎮(zhèn)衛(wèi)生院，貴州 黔東南苗族侗族自治州 442700；4.昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650500）

丹江鎮(zhèn)位于貴州省黔東南苗族侗族自治州雷山縣，年降雨量豐富，空氣濕度大。日常食用“辣椒紅酸湯”，可起到除濕祛寒、開胃等作用[1]。當?shù)厥⑿袀鹘y(tǒng)手工制作辣椒紅酸湯：挑選完好的當?shù)丶t辣椒，去除頭部，洗凈，瀝干水分；與事先洗好的姜一起剁碎，撒少許鹽和酒，放入壇中腌制即可。壇內(nèi)辣椒在腌制過程中，環(huán)境中的微生物附著生長，發(fā)酵成熟的辣椒呈現(xiàn)特殊的“酸”味，因此又稱為“酸湯”。為與常見的凱里紅酸湯（凱里地區(qū)的辣椒紅酸湯主要原材料為辣椒和番茄）區(qū)別[2]，這里稱為辣椒酸或者辣椒紅酸湯。目前，市場上流通的酸湯主要有兩種類型：一種是工業(yè)化生產(chǎn)的酸湯成品；一種是民間傳統(tǒng)手工制作而成的酸湯。酸湯成品會在出廠前進行滅菌（以增加其保質(zhì)期），包裝后進行銷售；傳統(tǒng)手工制作的酸湯經(jīng)自然發(fā)酵完成后便可進入市場進行零售。傳統(tǒng)手工制作的酸湯中蘊含著豐富的微生物（可稱為活性酸湯），其在售賣和儲藏期間基本處于開放環(huán)境中，品質(zhì)易受環(huán)境影響、易產(chǎn)生腐敗。目前研究主要集中于凱里酸湯的微生物菌群，對丹江辣椒紅酸湯的研究較少，因丹江辣椒紅酸湯與凱里酸湯原料的不同，受到了廣泛的關注。

Illumina MiSeq高通量測序技術可對大量的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子同時進行測序，利用基因序列分析特定微生物群體構成[3]，廣泛用于發(fā)酵食品中微生物多樣性[4-6]、種類以及群落結構等研究[7]。有研究利用Illumina MiSeq高通量測序技術研究貴州酸湯中的微生物多樣性，如王琪琪等[8]利用Illumina Miseq高通量測序技術研究發(fā)現(xiàn)，辣椒紅酸湯中的優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria），優(yōu)勢細菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）和未分類屬；李潔等[9]采用Illumina Miseq高通量測序技術研究發(fā)現(xiàn)，凱里辣椒紅酸湯中的優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），優(yōu)勢細菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）；王若曦[10]采用Illumina Miseq高通量測序技術研究貴州各地區(qū)不同品種酸湯，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門（Firmicutes），細菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。

食源性致病菌是一類以食品為傳播媒介，引起食物中毒的一類致病性細菌[11]。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）[12]、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）[13]和大腸桿菌（Escherichia coli）[14]為常見的食源性致病菌，與人類健康及生命安全息息相關[15]。食品中致病菌存在著健康隱患，改善食品抗菌能力是延長食品保質(zhì)期和提高食品安全的有效途徑。有研究表明，發(fā)酵食品中分離的乳酸菌能夠產(chǎn)生有機酸、細菌素等抑菌物質(zhì)，能夠殺滅脂環(huán)酸芽孢桿菌[16]，對蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌亦具有很好抑菌活性[17]。前期研究發(fā)現(xiàn)，酸湯中含有很多能產(chǎn)酸且具有抑制食源性致病菌的乳酸菌[10]。

由此，本研究從貴州省黔東南菌族侗族自治州雷山縣丹江鎮(zhèn)采集辣椒紅酸湯樣品，利用Illumina MiSeq高通量測序技術進行細菌多樣性分析，結合微生物純培養(yǎng)技術和雙層平板法[18]從中分離優(yōu)勢乳酸菌，并篩選抗食源性致病菌乳酸菌，以期為提高人們對丹江鎮(zhèn)辣椒紅酸湯細菌多樣性的認識以及促進乳酸菌在生物抑菌防腐方面的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

從丹江鎮(zhèn)雷山衛(wèi)生局旁農(nóng)貿(mào)市場、丹江鎮(zhèn)西后街農(nóng)貿(mào)市場、丹江鎮(zhèn)羊場壩農(nóng)貿(mào)市場以及丹江鎮(zhèn)某農(nóng)家共采集到辣椒紅酸湯樣品4份，分別編號為ST1、ST2、ST6和ST7。

1.1.2 菌種

食源性致病菌（蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）ST2-1、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）ST2-6和大腸桿菌（Escherichia coli）ST1-0）：從酸湯樣品中分離，保存于本實驗室。

1.1.3 試劑

乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、胰蛋白胨、瓊脂糖：上海生工生物工程有限公司；Premix ExTaqTM：日本TaKaRa公司；QIAquick gel Extraction Kit試劑盒：德國Qiangen公司；甘油：天津試劑三廠；酵母提取物：英國OXOID公司；溴甲酚紫、MgSO4·7H2O、K2HPO4、NaHCO3、葡萄糖：天津市風船化學試劑科技有限公司；CaCl2：天津市致遠化學試劑有限公司；吐溫80：上海源葉生物科技有限公司。本研究所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.4 培養(yǎng)基

葡萄糖產(chǎn)酸培養(yǎng)基：參考文獻[10]配制；MRS液（固）體培養(yǎng)基：北京鼎國生物技術有限公司；LB培養(yǎng)基、腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GHP-9160恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；ABI 7200聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；羅氏GS-FLX測序儀：瑞士Roche公司；Labnet 230V EU渦旋儀：美國Labnet公司；SIGMA 3-18K高速離心機：德國Sigma公司；YP1002N電子天平：上海恒平科學儀器有限公司；GL-3250A磁力攪拌器：麒麟貝爾儀器制造有限公司；Ultrospec 2100 pro紫外分光光度計：安瑪西亞（中國）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 辣椒紅酸湯樣品微生物宏基因組DNA的提取

取少量紅酸湯樣品研磨，參考文獻[19-20]提取細菌宏基因組DNA，置于-20 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2 細菌16S rDNAV3-V4區(qū)基因PCR擴增和高通量測序

以提取的紅酸湯基因組DNA為模板，使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）PCR擴增細菌16S rDNA V3-V4區(qū)域基因序列。PCR擴增體系：Premix ExTaqTM聚合酶10 μL，模板基因組0.5 μL，引物338F和806R各1 μL，雙蒸水（ddH2O）8 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸15 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸5 min。將PCR擴增產(chǎn)物稀釋10倍，按原條件再進行5個循環(huán)，以減少非特異性擴增[21]。采用QIAquickgelExtraction Kit純化回收PCR擴增產(chǎn)物，采用分光光度計定量后送上海生工生物工程有限公司進行Illumina Miseq測序[22]。

1.3.3 測序結果處理

根據(jù)引物中barcode序列將測序結果分配到相應樣品中，去除barcode序列和引物序列，剩余序列使用mothur v1.43.1進行拼接，去除質(zhì)量欠佳的序列，保留堿基長度＞400bp的有效序列。運用classify.seqs命令進行分析，結合Silva的SSU rRNA序列數(shù)據(jù)庫V138分類信息進行數(shù)據(jù)分析[23]。

1.3.4α多樣性指數(shù)分析

使用mothur 1.14.1軟件對微生物α多樣性指數(shù)進行分析。以0.03為cut off值，劃分可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。計算Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Coverage值。

1.3.5 辣椒紅酸湯樣品中優(yōu)勢乳酸菌的分離與鑒定

參考文獻[10]采用倍比稀釋涂布法分離辣椒紅酸湯中的乳酸菌。

以改良的十六烷基三乙基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取分離菌株的基因組DNA[24-25]。以分離菌株的基因組DNA為模板，利用16S rRNA通用引物27F（5'-AGAGTATGATCATGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR擴增體系：Premix ExTaqTM25.0 μL，引物27F和1492R各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 21.0 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃預變性30 s 60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min 30 s，循環(huán)35次；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行序列測定，將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性搜索比對，當被檢菌株的核苷酸序列與參考菌株的同源性＞97%時，即將它們確定為同一個菌種[26]。

1.3.6 產(chǎn)酸及抗食源性致病菌乳酸菌的篩選

產(chǎn)酸乳酸菌的篩選：將分離鑒定的乳酸菌按照1×106CFU/mL的接種量接種至葡萄糖產(chǎn)酸培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，同時觀察培養(yǎng)基顏色變化。當觀察到培養(yǎng)基顏色由深變淺，最終變?yōu)辄S色，且顏色不再變化時停止培養(yǎng)[10]。培養(yǎng)基中指示劑（溴甲酚紫）變黃表示產(chǎn)酸[27]。

抗食源性致病菌乳酸菌的篩選：將篩選的產(chǎn)酸菌株接種至MRS固體培養(yǎng)基中，利用雙層平板法[18]考察產(chǎn)酸乳酸菌對蠟樣芽孢桿菌ST2-1、陰溝腸桿菌ST2-6和大腸桿菌ST1-0的抑菌能力。

2 結果與分析

2.1 測序結果分析和α多樣性分析

利用mothur v1.43.1軟件對Illumina MiSeq高通量測序結果進行分析，結果見表1。由表1可知，通過Illumina MiSeq高通量測序從4個辣椒紅酸湯樣品中共得到12 208條有效序列，按照序列同源性的97%劃分OTU，共得到291個OTU。樣品的覆蓋率（Coverage）均＞93%，說明基于此次實驗測序深度，盡管會忽略樣品中含量較少的微生物，但在酸湯發(fā)酵過程中占優(yōu)勢的微生物均能得到分析。其中，樣品ST1的Shannon指數(shù)最高，說明該樣品具有最大的細菌菌群多樣性；樣品ST7的Chao1指數(shù)最高，說明該樣品具有最大的細菌菌群物種豐度。

表1 不同辣椒紅酸湯樣品細菌菌群的α多樣性分析結果Table 1 Results of α diversity analysis of bacterial flora in different chili red sour soup samples

2.2 辣椒紅酸湯樣品細菌菌群結構分析

2.2.1 基于門水平細菌菌群結構分析

從門水平對辣椒紅酸湯樣品中的細菌菌群結構進行分析，結果見圖1。由圖1可知，4個辣椒紅酸湯樣品中共有的優(yōu)勢細菌門（相對含量＞1%）為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），與王琪琪等[8]對辣椒紅酸湯中微生物多樣性分析的結果基本一致。此外，樣品ST1中的優(yōu)勢細菌門還包括放線菌門（Actinomycetes）（3.24%）和類桿菌門（Bacteroides）（2.52%）。

圖1 基于門水平辣椒紅酸湯樣品中細菌菌群結構分析結果Fig.1 Results of bacterial flora structure analysis in chili red sour soup samples based on phylum level

2.2.2 基于屬水平細菌菌群結構分析

從屬水平對辣椒紅酸湯樣品中的細菌菌群結構進行分析，結果見圖2。由圖2可知，樣品ST1的優(yōu)勢細菌屬（相對含量＞1%）有13個，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、綠膿桿菌屬（Aeribacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、依格納季氏菌屬（Ignatzschineria）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、嗜鹽單胞菌屬（Halomonas）、Anaeroslibacter、假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）、中華芽孢桿菌屬（Sinibacillus）和曲桿菌屬（Curvibacter），相對含量分別為42.39%、14.44%、7.81%、6.62%、5.03%、3.58%、3.31%、1.46%、1.46%、1.32%、1.32%、1.19%和1.06%。樣品ST2的優(yōu)勢細菌屬有2個，分別為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和弧菌屬（Vibrio），相對含量分別為87.61%和7.45%。樣品ST6的優(yōu)勢細菌屬有4個，分別為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Lelliottia和腸桿菌屬（Enterobacter），相對含量分別為90.52%、1.74%、1.12%和1.08%。樣品ST7的優(yōu)勢細菌屬有2個，分別為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus），相對含量分別為90.54%和2.42%。在所有樣品中，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）均為辣椒紅酸湯樣品中的優(yōu)勢細菌屬。王琪琪等[8]對辣椒紅酸湯樣品中的優(yōu)勢細菌屬進行分析，得到其優(yōu)勢細菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）；肖甜甜等[28]在白酸湯微生物多樣性研究中發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）為其優(yōu)勢細菌屬；李潔等[9]研究凱里地區(qū)辣椒紅酸湯細菌菌群多樣性發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢細菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）。本研究與王琪琪等[8-9]研究的樣品均以辣椒為主要原料發(fā)酵而成，且其主要優(yōu)勢菌屬均為乳桿菌屬（Lactobacillus）。肖甜甜等[28]研究的白酸湯以米湯為原料發(fā)酵而成，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為其優(yōu)勢菌屬之一?？梢娚鲜霾煌牧习l(fā)酵的紅酸湯、白酸湯，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）均為優(yōu)勢細菌屬。

圖2 基于屬水平辣椒紅酸湯樣品中細菌菌群結構分析結果Fig.2 Results of bacterial flora structure analysis in chili red sour soup samples based on genus level

2.3 辣椒紅酸湯樣品中優(yōu)勢乳酸菌的分離與鑒定結果

結合Illumina MiSeq高通量測序結果，利用MRS固體培養(yǎng)基對辣椒紅酸湯樣品中優(yōu)勢乳酸菌進行分離，結果從4個辣椒紅酸湯樣品中共分離到17株乳酸菌，通過分子生物學技術進行鑒定，結果見表2。由表2可知，經(jīng)鑒定，11株干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、3株副干酪乳桿菌（Lac-tobacillus paracasei）、1株副干酪乳桿菌亞種（Lactobacillus paracaseisubsp.）、1株乳酸桿菌（Lactobacillussp.）和1株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。其中干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）和副干酪乳桿菌亞種（Lactobacillus paracaseisubsp.）共15株，占總分離菌株數(shù)的88.23%。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）和副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）廣泛存在于發(fā)酵乳制品和泡菜等環(huán)境中[29]，具有很好的益生作用[30-35]，廣泛應用于食品開發(fā)[36]。該研究從樣品ST7篩選得到豐富的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），其對丹江鎮(zhèn)辣椒紅酸湯營養(yǎng)保健價值方面的作用值得進一步探索。

表2 辣椒紅酸湯樣品中乳酸菌的分離與鑒定結果Table 2 Isolation and identification results of lactic acid bacteria in chili red sour soup

2.4 產(chǎn)酸乳酸菌的篩選及抗食源性致病菌能力的測定結果

通過觀察葡萄糖產(chǎn)酸培養(yǎng)基顏色的變化從17株乳酸菌株中篩選到4株顏色變化明顯的乳酸菌，分別為干酪乳桿菌L.caseiST7-1、L.caseiST7-14、L.caseiST7-15和乳酸桿菌Lactobacillussp.ST7-20。4株菌對食源性致病菌B.cereusST2-1、E.cloacaeST2-6和E.coliST1-0的抑菌能力見表3。由表3可知，4株產(chǎn)酸乳酸菌對B.cereusST2-1、陰溝腸桿菌E.cloacaeST2-6和大腸桿菌E.coliST1-0均具有抑制作用。其中干酪乳桿菌L.caseiST7-14對B.cereusST2-1和E.cloacaeST2-6的抑菌效果最好，抑菌圈直徑分別達到了31.5mm和37.0 mm。Lactobacillussp.ST7-20對B.cereusST2-1的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為29.0 mm。

表3 4株乳酸菌對食源性致病菌的抗菌活性Table 3 Antibacterial activity of 4 strains of lactic acid bacteria against foodborne pathogens

發(fā)酵食品中分離的乳酸菌能夠產(chǎn)生有機酸、細菌素等抑菌物質(zhì)，能夠殺滅脂環(huán)酸芽孢桿菌（Aliyclobacillus acidoterrestris）[16]，對蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和大腸桿菌（Escherichia coli）亦具有很好抑菌活性[37]。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）能夠有效抵抗食源性致病菌[38]，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)平衡[39]。楊子燕等[40]從云南省各地區(qū)發(fā)酵樣品中分離得到大量干酪乳桿菌，并從中篩選到4株能夠抑制大腸桿菌、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）等腸道致病菌菌株；CHEN H L等[41]研究發(fā)現(xiàn)，口服干酪乳桿菌可降低幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）、大腸桿菌ATTC25922菌落數(shù)量，達到調(diào)節(jié)腸道菌群平衡作用；曾獻春等[32]研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌可提高便秘小鼠腸道中乳酸桿菌屬豐度，降低條件致病菌普雷沃氏菌屬（Prevotella）豐度，從而改善腸道菌群，達到緩解便秘的作用；遲珺曦等[42]研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌可抑制念珠菌，用于生物治療；在其進入腸道后可存活，從而調(diào)節(jié)腸內(nèi)微生態(tài)平衡，抑制有害物質(zhì)產(chǎn)生，顯示了很好的益生特性。本研究中干酪乳桿菌的整體抑菌效果較好，為進一步開展抑菌特性研究奠定了基礎。

3 結論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術對貴州丹江鎮(zhèn)辣椒紅酸湯樣品中細菌群落多樣性研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）為其優(yōu)勢細菌門；乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為其優(yōu)勢細菌屬。采用微生物純培養(yǎng)技術以及雙層平板法從中分離得到17株乳酸菌，經(jīng)分子生物學技術鑒定均為乳酸桿菌（Lactobacillus）。其中11株為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、3株為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、1株副干酪乳桿菌亞種（Lactobacillus paracaseisubsp.）、1株乳酸桿菌（Lactobacillussp.）和1株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。干酪乳桿菌L.caseiST7-1、L.caseiST7-14、L.caseiST7-15和Lactobacillussp.ST7-20具有較好的產(chǎn)酸和抗食源性致病菌性能，且L.caseiST7-14對B.cereusST2-1和E.cloacaeST2-6的抑菌效果最好，抑菌圈直徑分別為37.0 mm、31.5 mm。后續(xù)將進一步開展抑菌特點和辣椒紅酸湯純菌種發(fā)酵研究，以期開發(fā)出具有優(yōu)良抑菌特性的辣椒紅酸湯產(chǎn)品；同時為丹江鎮(zhèn)以及貴州省辣椒紅酸湯推廣做出貢獻。