喻江南,宋鈴榆,楊紅,冉蘇葉,劉琦

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種最常見的慢性肝病，包括從單純脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎，再到晚期肝纖維化、肝硬化，最終發(fā)展為肝細胞癌，是減少肝臟相關(guān)并發(fā)癥和降低病死率的關(guān)鍵[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群可以通過肝—腸軸影響代謝性疾病，包括影響能量代謝、內(nèi)毒素血癥、膽汁酸代謝、膽堿代謝、產(chǎn)生內(nèi)源性乙醇等，從而影響NAFLD的發(fā)生、發(fā)展[2-3]。但大多數(shù)研究主要聚焦于腸道細菌發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(SCFAs)的作用[4]。很少有研究分析其他有機酸(如琥珀酸或乳酸)的作用。琥珀酸是宿主和微生物的重要代謝物，通常被視為宿主細胞內(nèi)三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，在細菌發(fā)酵、某些炎性反應(yīng)和代謝異常時，也會大量積累[5]。其主要由擬桿菌門代謝產(chǎn)生，而擬桿菌門的升高是非酒精性脂肪性肝炎患者腸道菌群主要變化趨勢之一[6]。然而針對腸道菌群代謝產(chǎn)物琥珀酸對NAFLD的影響作用，研究甚少。因此本研究擬建立NAFLD小鼠模型，初步探索腸道菌群代謝產(chǎn)物琥珀酸在NAFLD小鼠中的影響作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：C57BL/6雄性無菌小鼠40只[購自湖南省長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物合格證號：430726210100336626，許可證號：SCXK(湘)2019-0014]，周齡5周，體質(zhì)量15～17 g。小鼠飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，溫度25℃左右，自動光控(12 h/12 h晝夜交替)，小鼠自由飲水。動物實驗流程經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理審查批準(200639)。(2)藥物與試劑：琥珀酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；60%高脂飼料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)；4%多聚甲醛、三酰甘油檢測盒、總膽固醇檢測盒、蘇木素—伊紅(HE)染色劑、油紅O染色檢測盒(均購自南京建成科技有限公司)。(3)儀器設(shè)備：正置白光拍照顯微鏡(Ci-E，Nikon公司)；高速臺式低溫離心機(Thermo公司)；多功能酶標儀(Molecular Devices公司)；魚躍血糖儀(型號305A，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)；電子天平(昆山利平劑量設(shè)備有限公司)。

1.2 實驗方法 2021年9月—2022年3月于貴州醫(yī)科大學(xué)實驗室進行實驗。隨機數(shù)字表法將小鼠40只分為正常飲食組(ND組)、正常飲食+琥珀酸處理組(ND+Suc組)、高脂飲食組(HFD組)、高脂飲食+琥珀酸處理組(HFD+Suc組)，每組10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，從第2周開始，ND組和ND+Suc組采用正常飲食喂養(yǎng)小鼠，HFD組和HFD+Suc組采用高脂(含有60%脂肪)飼料喂養(yǎng)小鼠建立NAFLD模型，ND+Suc組和HFD+Suc組飲水中混入2.5%琥珀酸[7]，ND組和HFD組采用純凈水喂養(yǎng)，各組小鼠均自由飲水。均喂養(yǎng)15周。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 小鼠體質(zhì)量檢測：使用電子天平每周監(jiān)測小鼠體質(zhì)量，至實驗結(jié)束。

1.3.2 血糖測定：采用口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)，小鼠禁食不禁水12 h，予蒸餾水配制20%D-葡萄糖0.01 ml/g，予小鼠灌胃針灌胃，分別在0、15、30、60、120 min，經(jīng)小鼠尾靜脈取血并棄去第一滴血，電子血糖儀檢測第二滴血血糖值。

1.3.3 血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)測定： 經(jīng)小鼠眼球取血后，離心取血清40～80 μl，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定TG、TC水平，按檢測盒說明書進行。

1.3.4 肝組織脂質(zhì)檢測：頸椎脫臼法處死小鼠，剪開腹腔暴露視野并取出完整肝臟，觀察肝臟顏色、形態(tài)，取一完整肝葉予4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚4 μm，置于獨立的玻璃切片上；HE染色10 min，后予蒸餾水沖洗10 min去除多余染液，乙醇脫水，二甲苯使切片透明，中性樹膠封片處理，顯微鏡下觀察肝細胞病理形態(tài)及肝臟脂肪變性情況。油紅O染色：配置油紅O試劑，并用0.22 μm過濾器過濾，將預(yù)先制作好并保存于-20℃的冰凍切片回溫5～10 min待染，按油紅O染色試劑盒說明書進行，以貯備液∶稀釋液=5∶2，配置油紅O試劑，滴于切片上并浸沒組織染色15 min，蒸餾水水洗15 s，封固劑固定、封片，并于顯微鏡下觀察肝組織脂質(zhì)沉積情況。

2 結(jié) 果

2.1 實驗前后4組小鼠體質(zhì)量變化 實驗前ND組、ND+Suc組、HFD組、HFD+Suc組小鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第15周，ND+Suc組小鼠體質(zhì)量與ND組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，HFD組較ND組體質(zhì)量明顯增高(P<0.01)，HFD+Suc組較HFD組體質(zhì)量下降，但仍高于ND+Suc組(P均<0.05)，見表1。

表1 實驗前后4組小鼠體質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of body weight of mice in four groups before and after the experiment

2.2 4組小鼠葡萄糖耐量變化比較 喂養(yǎng)15周后，與ND組比較，ND+Suc組血糖各時點(0、15、30、60、120 min)變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與ND組比較，HFD組OGTT 0、15、30、60、120 min血糖水平均顯著增高(t/P=7.346/<0.001、6.393/<0.001、4.621/0.002、8.900/<0.001、7.895/<0.001)；HFD+Suc組各時點血糖較HFD組降低(t/P=4.457/0.003、4.812/0.001、3.006/0.008、4.598/0.002、2.939/0.009)，但仍高于ND+Suc組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t/P=4.815/0.001、3.323/0.004、3.086/0.006、6.091/<0.001、7.186/<0.001)。見表2。

表2 4組小鼠OGTT不同時點血糖水平比較Tab.2 Comparison of blood glucose levels at different time points of OGTT in 4 groups of mice

2.3 4組小鼠血清TG、TC水平比較 ND組血清TG、TC濃度與ND+Suc組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；HFD組血清TG、TC較ND組小鼠顯著增高(P<0.01)；HFD+Suc組血清TG、TC水平低于HFD組，但仍高于ND+Suc組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組小鼠血清TG、TC水平比較Tab.3 Comparison of serum TG and TC levels of mice in four groups

2.4 4組小鼠肝組織脂質(zhì)比較 光鏡下顯示，ND組、ND+Suc組小鼠肝臟組織中肝細胞排列整齊，細胞核大而圓，無擠壓變形，細胞質(zhì)未見明顯脂肪空泡樣變性，小葉結(jié)構(gòu)清晰可見。HFD組小鼠可見肝細胞彌漫分布脂肪沉積，以大小泡混合性肝細胞脂肪變性為主，部分細胞核被擠壓變形甚至消失，肝細胞排列紊亂，未見明顯炎細胞浸潤。HFD+Suc組可見散在分布小空泡樣肝細胞脂肪變性，較HFD組明顯減輕。油紅O染色切片示脂肪滴呈紅色，細胞核為淡藍色，HFD組可見大小不等的紅色脂滴彌漫性分布，HFD+Suc組可見紅色脂滴散在分布，程度較HFD組小鼠明顯減輕，此外，在ND組和ND+Suc組小鼠中未觀察到明顯脂質(zhì)沉積，與HE染色的脂肪變性結(jié)果一致。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟脂質(zhì)比較(×200)Fig.1 Comparison of liver lipids of mice in each group (×200)

3 討 論

NAFLD與內(nèi)臟脂肪增多和代謝異常密切相關(guān)，其中2型糖尿病、肥胖、高脂血癥、高血壓會顯著增加肝硬化和相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險[8]。研究證實，益生菌制劑可通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善代謝性疾病進而改善NAFLD[9]，然而其機制尚不清楚。血脂代謝異常是NAFLD的主要危險因素。脂肪攝取和生成超過脂肪氧化和輸出，導(dǎo)致脂質(zhì)在肝臟過度沉積，形成脂肪肝，甚至通過氧化應(yīng)激進一步促進肝細胞損傷和疾病進展[10]。相關(guān)研究報道調(diào)節(jié)腸道菌群可有效改善宿主能量吸收及營養(yǎng)代謝，通過調(diào)節(jié)腸道菌群控制體質(zhì)量較其他減肥類藥物不良反應(yīng)更小，更能適應(yīng)宿主自身微環(huán)境[11]。有效控制肥胖是治療NAFLD的關(guān)鍵所在，通過腸道菌群改善肥胖癥狀對NAFLD潛在治療作用還需要更深入研究。其他繼發(fā)性因素如內(nèi)分泌紊亂也在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[12]。多項研究證實，NAFLD與2型糖尿病密切相關(guān)，其機制主要通過胰島素抵抗和代償性高胰島素血癥，導(dǎo)致NAFLD中脂質(zhì)代謝缺陷和肝臟三酰甘油積累或β細胞功能障礙。與非糖尿病患者比較，T2DM 患者患NAFLD的風(fēng)險更高，而且患晚期肝病(如肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌)的風(fēng)險也更高[13]。所以有效控制代謝性疾病從而有效管理NAFLD成為研究的重中之重。

越來越多研究表明，NAFLD的高發(fā)病率與腸道微生物群密切相關(guān)，Chiu 等[14]將非酒精性脂肪性肝炎患者的糞便接種于無菌小鼠腸道，并予高脂飲食喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪性肝炎小鼠腸道菌群加重了肝臟脂肪變性和炎性改變。進一步證實NAFLD的進展與腸道微生物群的不同組成密切相關(guān)。Kim 等[15]發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)腸道菌群可以有效調(diào)節(jié)腸道基因表達，改善血脂水平、肥胖癥狀，降低肝臟脂肪變性及細胞炎性反應(yīng)。Zhou等[16]證實，通過糞便微生物群移植調(diào)節(jié)腸道微生物群可減輕高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的非酒精性脂肪性肝病，并且有效改善了門靜脈高壓。其他研究也進一步證實了腸道菌群作為NAFLD潛在治療靶點的可行性，通過使用抗生素、益生元、益生菌和合生元等調(diào)節(jié)腸道微生物群和腸道屏障功能可有效改善NAFLD小鼠脂質(zhì)積累和肝臟炎性反應(yīng)[17]。這也提示腸道菌群可能在NAFLD診療中有著巨大潛力。但腸道菌群在NAFLD的致病及治療作用機制尚未完全明確，仍需要大量臨床和基礎(chǔ)研究深入探索。

琥珀酸是一種由宿主細胞和微生物細胞產(chǎn)生的共同代謝產(chǎn)物之一，在腸道炎性反應(yīng)和微生物群破壞的情況下可大量積累，并可以啟動重要的保護機制，以抵抗代謝應(yīng)激或組織損傷，但在其他炎性反應(yīng)刺激的情況下，也可能會調(diào)節(jié)失衡，并導(dǎo)致疾病。除了對宿主組織的影響外，腸腔內(nèi)琥珀酸鹽的增加還改變了腸道微生物群落的代謝循環(huán)，可能導(dǎo)致將琥珀酸鹽作為營養(yǎng)源的致病菌增殖。另外琥珀酸積累的腸腔紊亂也可能與丙酸鹽、丁酸鹽和醋酸鹽等在內(nèi)的抗炎性短鏈脂肪酸水平的變化，以及共生微生物與致病微生物的相對豐度的變化有關(guān)[18]。De Vadder等[19]通過給予小鼠富含纖維或琥珀酸飲食，發(fā)現(xiàn)腸道來源琥珀酸能有效增加腸道糖異生，降低小鼠血糖，改善胰島素抵抗。從而影響肝臟葡萄糖生成，改善血糖調(diào)節(jié)和能量代謝。但迄今為止還沒有相關(guān)研究報道腸道來源琥珀酸對NAFLD的影響作用，本研究通過琥珀酸干預(yù)高脂喂養(yǎng)小鼠，發(fā)現(xiàn)琥珀酸能有效改善NAFLD小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，其機制可能與降低血清三酰甘油和總膽固醇水平，改善葡萄糖調(diào)節(jié)受損，進而降低肝臟脂質(zhì)合成有關(guān)。

綜上所述，琥珀酸作為腸道菌群的一種有機酸，對高脂誘導(dǎo)小鼠NAFLD具有保護作用，然而關(guān)于腸道菌群代謝產(chǎn)物琥珀酸在NAFLD中的相關(guān)分子機制的研究仍需更深入探索，細胞水平仍在進一步驗證之中。本研究為非酒精性脂肪性肝病的臨床治療提供新的參考依據(jù)，為調(diào)節(jié)腸道菌群治療NAFLD奠定前期基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

喻江南、宋鈴榆：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；楊紅、劉琦：提出研究思路，分析實驗數(shù)據(jù)，論文審核，論文修改；冉蘇葉：實施研究過程，資料搜集整理，進行統(tǒng)計學(xué)分析