龔竹韻 楊曉丹 程 序 孫懷艷 高 翔

(1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科,合肥,230061; 2 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科,合肥,230001)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)是直腸和結(jié)腸發(fā)生的一種原因未明的炎癥性疾病,腸道炎癥介質(zhì)水平升高。臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、血便等[1]。雖然其病因尚不十分明確,但普遍認(rèn)其發(fā)病與免疫、遺傳、環(huán)境及腸道感染等多因素有關(guān)[2]。葛根芩連湯源于《傷寒論》,為中醫(yī)方劑名,可以調(diào)節(jié)人體的內(nèi)分泌系統(tǒng),有助于控制血糖含量,預(yù)防心血管疾病,還可以消除體內(nèi)炎癥,降低腸炎因子,能夠改善腸道菌群,減輕細(xì)菌性痢疾[3-4]。miR-542-3p是一種微RNA(microRNA,miRNA/miR),參與機體多種疾病的調(diào)節(jié),尤其是在結(jié)直腸疾病中發(fā)揮重要作用。有研究表明。miR-542-3p在結(jié)直腸癌患者中表達量降低,在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起抑制作用,可作為診斷結(jié)直腸癌的生物學(xué)標(biāo)志物[5]。過表達miR-542-3p,可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力[6]。本實驗主要探討葛根芩連湯調(diào)控miR-542-3p表達對UC大鼠的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取160只8～10周齡SD大鼠,體質(zhì)量(200±10)g,購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,許可證編號SCXK(皖)2021-009,為排除性別因素影響,本研究均采用雄性SD大鼠。21～25 ℃溫度,40%～70%相對濕度,通風(fēng)環(huán)境,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。本研究動物組織處理經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)(倫理審批號:AHZYYDXTCM21211945)。

1.1.2 藥物 葛根、黃連、黃芩、甘草購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房,批號分別為2020625、20200821、20210209、20211225。葛根芩連湯由葛根150 g、黃連90 g、黃芩90 g、炙甘草60 g制備,葛根芩連湯用臨床方法煎煮:加入8倍體積的水量,浸泡30 min,加熱沸騰,保持微沸40 min,回流提取,低溫減壓濃縮至650 mL,藥液濃度為0.6 g/mL,每日按此劑量煎煮1次用于灌胃。美沙拉嗪膠囊購自葵花藥業(yè)集團佳木斯鹿靈制藥有限公司,批號:201124。

1.1.3 試劑與儀器 酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒:腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司,貨號:SP12250),白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)試劑盒(上海初態(tài)生物科技有限公司,貨號:CT9077),白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)試劑盒(上海初態(tài)生物科技有限公司,貨號:CT9082)；化學(xué)比色檢測試劑盒:丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒(深圳子科生物科技有限公司,貨號:ZK-L3236),超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD試劑盒(深圳子科生物科技有限公司,貨號:GMS70042),谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-Px)試劑盒(深圳子科生物科技有限公司,貨號:ZK-L3218)；Lipofectamine? 3000轉(zhuǎn)染試劑(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，貨號：L3000150)Trizol試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號R0016)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海初態(tài)生物科技有限公司,貨號:CT670730)；TB Green Fast qPCR Mix熒光定量qPCR試劑盒400 Rxns(Takara公司,日本,貨號:Takara.RR430B)。酶標(biāo)儀(Thermo公司,美國,型號:MK3);實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)分析儀(博日科技股份有限公司,LineGene Mini,型號:FQD-16B)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠禁食24 h,腹腔注射10 mL/kg的3%戊巴比妥鈉麻醉,用聚丙烯管插入肛門上段約8 cm處,第1天,注入0.04 mmol/L的二硝基氯苯(Dinitrochlorobenzene,DNCB)乙醇溶液0.25 mL,注射2 d。第3天注入8%的乙酸溶液2 mL,15 s后用生理鹽水沖洗,觀察結(jié)腸組織病理變化,確定UC造模成功。同批次等體質(zhì)量健康大鼠16只作為空白對照組。造模成功后的大鼠，根據(jù)大鼠體質(zhì)量做區(qū)間隨機化分組，各組大鼠之間的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，分成模型組、美沙拉嗪組、葛根芩連湯低劑量、中劑量、高劑量組，每組16只?？瞻讓φ战M:正常大鼠20 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃；模型組:大鼠UC模型及等體積生理鹽水灌胃、美沙拉嗪組:10 mg/(kg·d)美沙拉嗪灌胃、低劑量組：5 mL/(kg·d)葛根芩連湯灌胃、中劑量組：10 mL/(kg·d)葛根芩連湯灌胃、高劑量組：20 mL/(kg·d)葛根芩連湯灌胃,連續(xù)給藥1周。對UC大鼠進行安樂死，分離潰瘍段結(jié)腸，使用眼科剪刀剪碎，加入0.1% I型膠原酶37 ℃消化30 min，分離獲得大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞。大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。UC結(jié)腸細(xì)胞進入對數(shù)生長期后消化傳代至24孔板培養(yǎng)，每孔加入2×105個細(xì)胞。貼壁過夜后，用Lipofectamine? 3000將miR-NC、miR-542-3p、anti-miR-NC、anti-miR-542-3p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至對數(shù)生長期的UC結(jié)腸上皮細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同分成miR-NC組、miR-542-3p組、anti-miR-NC組及anti-miR-542-3p組。其中miR-NC、miR-542-3p組經(jīng)含10%生理鹽水處理24 h，anti-miR-NC、anti-miR-542-3p組經(jīng)含10%葛根芩連湯DMEM培養(yǎng)基處理24 h，處理結(jié)束后分析細(xì)胞上清液炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化。實驗重復(fù)3次，每次實驗細(xì)胞來源于同一只UC大鼠。

1.2.2 給藥方法 空白對照組:同劑量生理鹽水灌胃、模型組:構(gòu)建大鼠UC模型、美沙拉嗪組:10 mg/(kg·d)灌胃、葛根芩連湯低劑量組5 mL/(kg·d)灌胃、中劑量組10 mL/(kg·d)灌胃、高劑量組20 mL/(kg·d)灌胃組,藥物處理持續(xù)1周。將miR-NC、miR-542-3p轉(zhuǎn)染至UC大鼠的結(jié)腸細(xì)胞,作為UC+miR-NC、UC+miR-542-3p組;將anti-miR-NC、anti-miR-542-3p轉(zhuǎn)染至UC大鼠的結(jié)腸細(xì)胞,再用葛根芩連湯處理,作為UC+anti-miR-NC+葛根芩連湯組、UC+anti-miR-542-3p+葛根芩連湯組。

1.2.3 檢測指標(biāo)及方法

1.2.3.1 ELISA檢測大鼠結(jié)腸組織和細(xì)胞炎癥介質(zhì)含量 提取大鼠結(jié)腸組織和細(xì)胞中的上清液,按照ELISA試劑盒說明書中介紹的實驗步驟,檢測TNF-α、IL-6、IL-8含量。

1.2.3.2 化學(xué)比色法檢測大鼠結(jié)腸組織和細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)水平 提取大鼠結(jié)腸組織和細(xì)胞中的上清液,采用化學(xué)比色法,并根據(jù)MDA、SOD、GSH-Px試劑盒的具體方法進行操作。

1.2.3.3 RT-qPCR檢測大鼠結(jié)腸組織和細(xì)胞miR-542-3p表達水平 根據(jù)Trizol試劑盒的要求進行實驗步驟,提取組織和細(xì)胞中的總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄為目的基因cDNA。以目的基因cDNA為模板,進行RT-PCR實驗。PCR擴增條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35個循環(huán)。miR-542-3p以U6為內(nèi)參,2-△△Ct法計算miR-542-3p相對表達水平。miR-542-3p上游引物5′-TGTGACAGATTGATAAC-3′,下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′,下游引物5′-AATATGGAACGCTTCACGAAT-3′。

2 結(jié)果

2.1 葛根芩連湯對UC大鼠結(jié)腸組織炎癥介質(zhì)的影響 與空白對照組比較,模型組炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-8含量明顯增加(P<0.05);與模型組比較,葛根芩連湯中、高劑量組炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、IL-8含量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 葛根芩連湯對UC大鼠結(jié)腸組織炎癥介質(zhì)的影響

2.2 葛根芩連湯對UC大鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與空白對照組比較,模型組MDA水平明顯上調(diào),SOD、GSH-Px水平明顯下調(diào)(P<0.05);與模型組比較,葛根芩連湯中劑量、高劑量組MDA水平顯著降低,SOD、GSH-Px水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 葛根芩連湯對UC大鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

2.3 葛根芩連湯對UC大鼠結(jié)腸組織miR-542-3p表達的影響 與空白對照組組比較,模型組miR-542-3p表達水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,葛根芩連湯中劑量、高劑量組miR-542-3p表達水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 葛根芩連湯對UC大鼠結(jié)腸組織miR-542-3p表達水平的影響

2.4 過表達miR-542-3p對UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激的影響 與UC+miR-NC組比較,UC+miR-542-3p組細(xì)胞miR-542-3p表達水平顯著升高;TNF-α、IL-6、IL-8含量顯著降低;MDA水平顯著降低以及SOD、GSH-Px水平顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 過表達miR-542-3p對UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激的影響

2.5 抑制miR-542-3p逆轉(zhuǎn)葛根芩連湯對UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激的影響 與UC+anti-miR-NC+葛根芩連湯組比較,UC+anti-miR-542-3p+葛根芩連湯組細(xì)胞miR-542-3p表達水平顯著降低;TNF-α、IL-6、IL-8含量顯著升高;MDA水平顯著升高以及SOD、GSH-Px水平顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 抑制miR-542-3p逆轉(zhuǎn)葛根芩連湯對UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激的影響

3 討論

UC是一種炎癥性腸病,會在結(jié)腸的內(nèi)壁引起刺激、炎癥和潰瘍[7]。臨床上直腸與乙狀結(jié)腸先產(chǎn)生病變,然后病變蔓延到結(jié)腸,最終累及全結(jié)腸發(fā)生炎癥,UC的特點是腸黏膜水腫、廣泛充血,最后糜爛出血,嚴(yán)重影響患者的健康和生命質(zhì)量,給患者帶來痛苦,所以及時治療非常重要[8]。UC的發(fā)病機制與腸道菌群失調(diào)、結(jié)腸黏膜屏障損傷及機體免疫功能紊亂密切相關(guān)[9]。其實這些都是相互作用的,菌群失調(diào)導(dǎo)致結(jié)腸黏膜失去保護,引起損傷后機體炎癥水平上升進一步導(dǎo)致結(jié)腸炎加重。炎癥常伴隨氧化應(yīng)激的產(chǎn)生,黃岑湯通過抗氧化應(yīng)激保護UC[10]。大量實驗結(jié)果表明中藥/復(fù)方對UC具有顯著的治療效果。黃連解毒湯通過抑制核因子κB(Nuclear Factor Kappa-B,NF-κB)信號通路,激活核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear Factor E2-related Factor 2,Nrf-2)信號通路,抑制炎癥和氧化應(yīng)激來保護腸黏膜，達到治療效果[9]。熱化濕祛瘀方通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、改善結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡對UC具有一定的改善作用[11]。葛根芩連湯在臨床上不僅具有清熱解毒、瀉火益氣的作用。而且對胃腸炎也具有較好的效果,對UC小鼠腸黏膜上皮屏障功能有修復(fù)效果[12],改善Th17/Treg平衡改善UC病理損傷[13],通過下調(diào)炎癥介質(zhì)表達改善立UC相關(guān)結(jié)腸癌小鼠病理情況[14],對急性腸炎也有明顯的改善效果[15]。本實驗研究表明,與模型組比較,葛根芩連湯中、高劑量組TNF-α、IL-6、IL-8含量顯著降低;MDA水平顯著降低,SOD、GSH-Px水平顯著升高,與之前研究結(jié)果一致。

近幾年,已經(jīng)有很多研究結(jié)果顯示,miRNA參與UC的發(fā)生發(fā)展,并且通過中藥聯(lián)合miRNA探索中藥治療結(jié)腸炎的機制研究。柚皮素通過miR-22抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3,NLRP3)炎癥小體并減輕UC大鼠模型腸屏障損傷[16]。清腸溫中方通過miR-675-5p/VDR(維生素D受體)信號通路調(diào)控UC的Th17/Treg免疫平衡及腸黏膜屏障[17]。復(fù)方芩柏顆粒劑通過靶向干預(yù)miR-199-3p改善UC的損傷[18]。在UC大鼠模型中,miR-542-3p相對表達量降低,過表達miR-542-3p可減輕結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)，對UC大鼠有一定保護作用[19]。本實驗通過探索葛根芩連湯與miR-542-3p對UC大鼠的改善機制研究,發(fā)現(xiàn),模型組大鼠miR-542-3p表達顯著降低,葛根芩連湯中劑量、高劑量組miR-542-3p表達水平顯著升高,miR-542-3p過表達后,UC大鼠的TNF-α、IL-6、IL-8含量顯著降低;MDA水平顯著降低以及SOD、GSH-Px水平顯著升高。

綜上所述,葛根芩連湯上調(diào)miR-542-3p表達抑制細(xì)胞炎癥介質(zhì),降低氧化應(yīng)激來保護UC大鼠,消除腸道炎癥。