李英英 劉咲頔 王清隆* 王 鵬 王祝年

（1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?71101；2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實驗站，海南?？?571101）

爪耳木（Lepisanthesunilocularis）為無患子科（Sapindaceae）鱗花木屬（Lepisanthes）常綠灌木[1]，為國家二級重點保護(hù)野生植物和海南特有滅絕級植物[2-3]。1935年爪耳木消失在人們視野，2013年人們再次發(fā)現(xiàn)爪耳木身影，時間跨度近80年[4]。爪耳木耐旱、耐瘠薄，是海南熱帶濱海植被中為數(shù)甚少的喬木樹種之一，是海南濱海地區(qū)較理想的造林樹種[5]。爪耳木根可入藥，具有一定的藥用和經(jīng)濟(jì)價值[6]。目前，關(guān)于爪耳木基因組學(xué)的研究鮮報道，這導(dǎo)致爪耳木的研究和利用受到制約。

流式細(xì)胞術(shù)是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、激光和電子計算機科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物[7]，是測定基因組大小的常用方法。目前，流式細(xì)胞術(shù)已應(yīng)用在芭蕉、旱柳、玫瑰茄、紅麻等植物基因組大小測定上[8-11]。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)對爪耳木進(jìn)行染色體倍性測定和基因組大小評估，以期為爪耳木的基因組學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于流式細(xì)胞術(shù)分析的爪耳木葉片采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所農(nóng)業(yè)部儋州熱帶藥用植物種質(zhì)資源圃（東經(jīng) 109°50′09″、北緯19°51′09″），葉片采摘后置于 4 ℃冰箱中保存。

內(nèi)參植物選擇橡膠7-33-97和大豆williams82的新鮮葉片，橡膠7-33-97采于海南儋州橡膠種植圃，基因組大小為1.46 GB[12]；大豆williams82由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供，基因組大小1.12 GB[13]。橡膠新鮮葉片采摘后存于4℃冰箱；大豆williams82為種子苗，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試驗藥品與儀器

供試藥品：PI溶液20 mg/L、DAPI溶液 20 mg/L、WPB解離液、GLB解離液等。

供試儀器：流式細(xì)胞儀、培養(yǎng)皿、鑷子、刀片、漏斗、試管等。

1.3 試驗方法

本試驗用爪耳木初生葉、幼葉、成葉以及橡膠7-33-97嫩葉、大豆williams82嫩葉，用流水反復(fù)沖洗3～5次，每次30 s，將葉片表面完全洗凈后用衛(wèi)生紙擦干，留待試驗取用。分別用WPB解離液和GLB解離液解離這些葉片，篩選合適的解離液。使用DAPI溶液20 mg/L染色，利用流式細(xì)胞儀在UV光線下檢測基因組倍性。使用PI溶液20 mg/L染色，利用流式細(xì)胞儀在632 nm頻率下檢測基因組大小。

1.3.1 爪耳木染色體倍性檢測。①取材：取指甲蓋大小的爪耳木初生葉、幼葉、成葉及橡膠嫩葉、大豆嫩葉分別置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放在冰袋上。②解離：在培養(yǎng)皿中分別加入WPB解離液500～800 μL和GLB解離液500～800 μL，以稍微浸沒葉片為宜，用刀片垂直將葉片切碎，讓葉片碎片充分浸沒在解離液中。③染色：提前將DAPI染液2 mL加入試管中，將解離2～3 min后的樣品連同解離液通過漏斗分別加入試管中，將試管置于避光處染色20 min。④上機：上機前充分吹打混勻試管，激光選擇UV檔位，調(diào)整參照植物大豆樣品峰的位置，位置確定后保持各項設(shè)置不變，暫停程序后更換待測樣本，檢測待測樣本的樣品峰位置，以此計算出待測植物的倍性（待測植物倍性=待測植物樣品峰位置/參照植物樣品峰位置×參照植物倍性）。每次更換待測樣本前用超純水清洗機器。⑤數(shù)據(jù)選擇和保存：調(diào)整參照植物樣品峰位置。檢測完畢后用專用清洗液清洗，清洗后關(guān)機。

1.3.2 爪耳木基因組大小檢測。①取材：取指甲蓋大小的爪耳木初生葉、幼葉、成葉及橡膠嫩葉、大豆嫩葉分別置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放在冰袋上。②解離：在培養(yǎng)皿中分別加入WPB解離液500～800 μL和GLB解離液500～800 μL，以微微浸沒葉片為宜，用刀片垂直將葉片切碎，讓葉片的碎片充分浸沒在解離液中。③染色：提前在試管中加入PI染液2 mL，將解離2～3 min后的樣品連同解離液通過漏斗分別加入試管中，將試管置于避光處染色20 min。④上機：上機前充分吹打混勻試管，激光選擇632 nm波長。檢測參照植物，待出現(xiàn)明顯的樣品峰后通過調(diào)整電壓等方式調(diào)整樣品峰在橫坐標(biāo)上的位置，確定好位置后保持設(shè)定不變，暫停程序后更換待測樣本，計算基因組大?。ù郎y植物基因組大小=待測植物樣品峰位置/參照植物樣品峰位置×參照植物基因組大?。?。每次更換待測樣本前用超純水清洗機器。⑤數(shù)據(jù)選擇和保存：框選樣品峰，將變異系數(shù)控制在5%以下，待檢測到的具有熒光信號的細(xì)胞核超過2 000個后，可暫停程序，保存數(shù)據(jù)。檢測完畢后用專用的清洗液清洗，清洗后關(guān)機。

2 結(jié)果與分析

2.1 爪耳木染色體倍性分析

通過調(diào)整流式細(xì)胞儀的設(shè)置，使大豆williams82樣品峰的位置穩(wěn)定在橫坐標(biāo)上四格的位置（圖1），待樣品峰基本穩(wěn)定后，暫停程序，保持設(shè)定不變，用超純水清洗上樣口。之后上機爪耳木的待測樣本，結(jié)果見圖2。爪耳木的樣品峰位置與對照樣品大豆williams82的位置十分接近。大豆williams82為二倍體，因而推測爪耳木基因組倍性與大豆williams82相同，也為二倍體。

2.2 爪耳木基因組大小鑒定

圖3為大豆williams82的PI熒光強度分布情況。于流式細(xì)胞儀上框選明顯的樣品峰，取具有熒光的細(xì)胞核數(shù)超過2 000個、變異系數(shù)低于5%的數(shù)據(jù)，以此保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。大豆平均值為17 012.71，變異系數(shù)為4.2%。圖4為橡膠7-33-97的PI熒光強度分布情況，框選的樣品峰平均值為21 472.6，變異系數(shù)為3.42%。圖5為爪耳木的PI熒光強度分布情況，樣品峰平均值為13 765.81，變異系數(shù)為4.42%。

依據(jù)大豆williams82基因組大小為1.12 GB，預(yù)測爪耳木基因組大小為906.24 Mb；依據(jù)橡膠7-33-97的基因組大小為1.46 GB，預(yù)測爪耳木基因組大小為935.99 Mb。因此，以大豆williams82和橡膠7-33-97作為參照的爪耳木基因組大小約為921.11 Mb。

3 結(jié)論與討論

基于流式細(xì)胞術(shù)的染色體倍性和基因組大小測定結(jié)果表明，爪耳木為二倍體植物，基因組大小約為921.11 Mb。較高的重復(fù)序列比例和較低的雜合率說明爪耳木在基因型頗為偏向純合的同時也有不小的突變概率。由于爪耳木為極小種群，種群內(nèi)基因頻率較低，加之本身基因型偏向純合，一旦在遺傳發(fā)育過程中發(fā)生基因突變或沉默、缺失，爪耳木就很難恢復(fù)到之前的狀態(tài)，這也可能是之前爪耳木瀕臨滅絕的直接原因。