陳 東,周焱祎

(1 唐山市第二醫(yī)院口腔科,唐山 063015；2 唐山市人民醫(yī)院口腔科；* 通訊作者,E-mail:978359455@qq.com)

IL-17A已被確定為牙周病的關(guān)鍵炎癥與免疫細(xì)胞因子，因?yàn)檠装Y與免疫反應(yīng)過(guò)程可能主要通過(guò)Th17細(xì)胞及其主要因子白細(xì)胞介素-17A(IL-17)來(lái)介導(dǎo)、激活一系列炎癥相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響炎癥的發(fā)生和發(fā)展[1]。大鼠牙周炎模型研究發(fā)現(xiàn)IL-17能增強(qiáng)牙齦組織的局部炎癥反應(yīng)，可促進(jìn)牙槽骨丟失和破骨細(xì)胞分化[2]。臨床研究也提供了一些證據(jù)，如慢性牙周炎患者的血漿、齦溝液和牙齦活檢樣本中的IL-17水平明顯高于健康人[3]。針對(duì)IL-17A的免疫療法也開(kāi)始受到關(guān)注，但就特定抗細(xì)胞因子的藥物研發(fā)，口腔藥物受到的關(guān)注遠(yuǎn)比不上其他全身系統(tǒng)性疾病，如目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出特異性抑制IL-17A的靶向治療單克隆抗體，用于銀屑病、關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎等自身免疫疾病的治療，而專(zhuān)業(yè)用于牙周炎細(xì)胞因子拮抗治療的藥物尚處在實(shí)驗(yàn)階段[4]。因此，干預(yù)牙周炎IL-17A的分泌或者中和牙周炎IL-17A抗體的靶向治療，值得積極探索。

殼聚糖是一種可自體降解、生物相容性好的天然多糖，由于其功能的多樣性和易得性，在牙科領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖及其衍生物可以作為口腔粘接劑、屏障膜、骨替代物、組織再生和抗菌劑等材料，更好地治療口腔疾病[5]。國(guó)內(nèi)外也有大量羧甲基殼聚糖用于牙周炎藥物輔助劑的報(bào)道[5,6]，本課題組前期也開(kāi)展了有關(guān)甲硝唑羧甲基殼聚糖凝膠(metronidazole carboxymethyl chitosan topical gel，M/CMCS)治療動(dòng)物牙周炎的研究，發(fā)現(xiàn)該制劑能夠抑制牙周炎大鼠的前列腺素E2(PGE2)，具有保護(hù)牙槽骨的作用[7]。本項(xiàng)目繼續(xù)采用大鼠模型來(lái)研究牙周炎病理過(guò)程中M/CMCS影響炎癥因子IL-17A的變化情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與試藥

含0.75%甲硝唑和20%羧甲基殼聚糖的甲硝唑羧甲基殼聚糖復(fù)方溫敏凝膠依前法[8]自制，醋酸溶解制備的甲基殼聚糖溶液，加甘油磷酸鈉混合溶解的甲硝唑液，在4 ℃條件下充分?jǐn)噭蚝蠹硬绰迳衬穚407混勻、定量靜置即得；試驗(yàn)藥物2%鹽酸米諾環(huán)素軟膏(PERIO?派麗奧，Sunstar INC.，日本)和0.75%甲硝唑凝膠(湖北康正藥業(yè)有限公司)均本地采購(gòu)；Western及IP細(xì)胞裂解液(無(wú)抑制劑)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；大鼠IL-17A免疫組化(IHC)檢測(cè)試劑盒、ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司。

1.2 SD大鼠牙周炎模型制備

選擇華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心培育的75只2月齡SD大鼠[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(冀)2015-0038]，稱(chēng)重、適應(yīng)性飼養(yǎng)后將大鼠2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，直徑0.3 mm的牙科專(zhuān)用細(xì)絲結(jié)扎大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙頸部，然后采用密度為1×109CFU/ml的ATCC 33277牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增培養(yǎng)的菌液200 μl進(jìn)行牙周接種，每日1次、計(jì)3次；飲水為10%葡萄糖糖水。

結(jié)扎造模滿6周后，75只中隨機(jī)抽取3只作為檢測(cè)牙周炎模型成功與否的判定。結(jié)合文獻(xiàn)和本課題組過(guò)去的造模方法[7-9]，牙周檢查記錄牙齦指數(shù)、結(jié)扎牙松動(dòng)度、牙周袋深度；然后動(dòng)物安樂(lè)死，截取上頜骨，先X線攝片，檢查牙槽骨吸收情況，再常規(guī)制作牙周牙體聯(lián)合組織塊進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察病理形態(tài)改變。結(jié)果顯示造模均成功，達(dá)到進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求。

1.3 大鼠分組與處置

將剩余72只模型大鼠隨機(jī)分為4組，每組18只。模型組(model)，局部不涂布任何藥物；甲硝唑羧甲基殼聚糖凝膠(M/CMCS)組，結(jié)扎牙四面牙周局部早晚各涂布自制的甲硝唑羧甲基殼聚糖復(fù)方溫敏凝；2%鹽酸米諾環(huán)素軟膏(PERIO)組，涂布派麗奧軟膏；0.75%甲硝唑凝膠(MNZ)組，涂布甲硝唑凝膠；每日治療2次，治療過(guò)程中如果發(fā)現(xiàn)結(jié)扎絲脫落則立即重新結(jié)扎。

每組18只大鼠，在治療的第8，22，36天分別取6只大鼠，先腹腔麻醉，采集齦溝液和腹主動(dòng)脈全血樣本，再安樂(lè)死，然后分離截取上頜骨及牙周組織塊，一側(cè)組織塊供ELISA實(shí)驗(yàn)，后續(xù)蛋白提取處理見(jiàn)1.4.3；對(duì)側(cè)組織塊供免疫組化實(shí)驗(yàn)，具體方法見(jiàn)1.5的免疫組化實(shí)驗(yàn)。

簡(jiǎn)略的實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線和流程示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 技術(shù)路線和實(shí)驗(yàn)流程示意圖Figure 1 Schematic diagram of technology roadmap and experimental process

1.4 ELISA法檢測(cè)組織樣本IL-17A濃度

1.4.1 齦溝液測(cè)試樣本采集與制備 3次齦溝液采樣分別在各組動(dòng)物涂藥治療的第8，22，36天的上午8時(shí)開(kāi)始。對(duì)每次各組需要齦溝液采樣的6只大鼠，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后暴露結(jié)扎牙，隔濕后用干棉球擦拭干凈牙齦緣部位，然后鈍性分離結(jié)扎磨牙遠(yuǎn)中牙齦溝，將預(yù)先準(zhǔn)備好的1根吸潮濾紙尖沿牙根面輕輕推入齦溝并停留30 s后取出(若有血跡則棄置并重新在腭側(cè)取樣)，置EP管中放-80 ℃冰箱凍存。ELISA檢測(cè)前，常溫解凍、加PBS緩沖液、震蕩后低溫離心，收集上清液后供ELISA法檢測(cè)IL-17A濃度。

1.4.2 全血血清樣本采集與制備 接1.4.1步驟，每組6只大鼠的齦溝液采集完成后，立即無(wú)菌開(kāi)腹、抗凝管采集腹主動(dòng)脈血5 ml，低溫離心準(zhǔn)備上清液放-80 ℃冰箱，供ELISA法測(cè)定IL-17A濃度。

1.4.3 牙周軟組織和牙槽骨的總蛋白裂解與提取制備 前述1.3處獲得的上頜骨，正中截?cái)酁樽笥覂啥?，一?cè)用于制備牙體牙周聯(lián)合標(biāo)本切片供免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，具體見(jiàn)1.5.1。另一側(cè)拔牙后將牙槽窩周?chē)? mm范圍的軟組織截取，拔除出來(lái)的牙體用無(wú)菌手術(shù)刀刮取根面附著的牙周膜等軟組織，同時(shí)搔刮牙槽窩牙周軟組織至牙槽骨硬表面，將兩處所得軟組織盡量剪碎、濾紙吸干、精確稱(chēng)重(每樣本不低于50 mg)后放入無(wú)菌凍存管、標(biāo)記后立即置液氮冷凍；同時(shí)將牙槽窩用預(yù)冷PBS液沖洗并除凈軟組織殘?jiān)?，用骨鑿和挖匙剝?nèi)⊙啦鄹C周邊厚約2 mm范圍的牙槽骨，同樣收集稱(chēng)重(每樣本不低于30 mg)標(biāo)記后也立即液氮冷凍，供裂解蛋白提取。ELISA測(cè)定前先分別進(jìn)行組織裂解與牙槽骨總蛋白提取，將軟組織或者骨組織在液氮缽中加液氮快速磨成細(xì)粉末，然后在離心管中按照20 mg組織加200 μl標(biāo)準(zhǔn)加入Western及IP細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，再通過(guò)冰浴、振蕩、低溫離心，獲得上清液并轉(zhuǎn)移，即分別得牙周軟組織與牙槽骨總蛋白提取物，置-80 ℃冰箱供ELISA法測(cè)定IL-17A濃度。

1.4.4 ELISA測(cè)定IL-17A濃度 將上述制備好的大鼠齦溝液、全血、牙周組織與牙槽骨總蛋白提取上清液的待測(cè)標(biāo)本，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)各樣品IL-17A的濃度。實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，終止反應(yīng)后在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處空白調(diào)零后測(cè)各孔OD值，繪制曲線并進(jìn)行計(jì)算。

1.5 免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-17A的表達(dá)

1.5.1 切片制備 將1.3處獲得的供免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的半側(cè)上頜骨，立即放入4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液中，4 ℃固定48 h，10% EDTA-2Na脫鈣液處理，常規(guī)梯度濃度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，4 μm SP法常規(guī)免疫組化染色操作，實(shí)驗(yàn)按照本課題組在文獻(xiàn)中提到的方法[7,8]，步驟嚴(yán)格遵照大鼠IL-17A免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.2 陽(yáng)性判定 封片后先低倍鏡下觀察，以細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒著色為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)、細(xì)胞質(zhì)無(wú)棕黃色顆粒著色為陰性標(biāo)準(zhǔn)。每張切片中各選取5個(gè)面積相同的視野拍攝圖片，然后電腦端采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)處理，計(jì)算平均光密度值(mean optical density，MOD)。

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，并得到動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：DW20170902)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同組織樣本中IL-17A濃度比較

2.1.1 齦溝液 模型組大鼠齦溝液IL-17A濃度值最高，在第8，22，36天各時(shí)間點(diǎn)分別為(65.89 ±7.44)pg/ml、(65.86 ±7.68)pg/ml和(63.56 ±7.62)pg/ml，不同時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比，3個(gè)治療組的IL-17A濃度在第8天即明顯下降，且在第8，22，36天與模型組相比均降低(P<0.05)。在第8，22，36天，M/CMCS組和PERIO組的IL-17A水平均低于MNZ組(P<0.05)；M/CMCS組和PERIO組在第8，22天差異尚未見(jiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在第36天時(shí)，M/CMCS組比PERIO組降低(P<0.05，見(jiàn)圖2)。

同組與第8天比較，* P <0.05；與模型組比較，#P <0.05；與MNZ組比較，Δ P <0.05；與PERIO組比較，& P <0.05

將各組不同樣本組織的IL-17A濃度結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)同組齦溝液的數(shù)值均低于牙周軟組織(P<0.05)，且顯著低于全血水平(P<0.01)；只有M/CMCS組齦溝液的IL-17A濃度高于牙槽骨，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他各組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)。

2.1.2 牙周軟組織 模型組在第8，22，36天IL-17A濃度呈現(xiàn)較高水平表達(dá)，不同時(shí)間點(diǎn)間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，M/CMCS組、PERIO組和MNZ組在第8，22，36天的IL-17A濃度均降低(P<0.05)。在第8，22，36天，M/CMCS組、PERIO組與MNZ組比較IL-17A的濃度均明顯下降(P<0.05)；在第36天，M/CMCS組IL-17A濃度比PERIO組低(P<0.05，見(jiàn)圖3)。同組牙周軟組織IL-17A的濃度均明顯高于齦溝液(P<0.05，見(jiàn)表1)。

與第8天比較，* P <0.05；與模型組比較，# P <0.05；與MNZ組比較，Δ P <0.05；與PERIO組比較，& P <0.05

表1 各組不同樣本組織的IL-17A濃度結(jié)果比較

2.1.3 牙槽骨 模型組的IL-17A濃度在第8，22，36天不同時(shí)間點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，M/CMCS組、PERIO組和MNZ組在第8，22，36天IL-17A濃度均降低(P<0.05)。在第8，22，36天，M/CMCS組與PERIO組間IL-17A濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但該兩組IL-17A濃度在第8，22，36天均較MNZ組降低(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

與第8天比較，* P <0.05；與模型組比較，# P <0.05；與MNZ組比較，Δ P <0.05

在第8，22，36天，M/CMCS組、PERIO組和MNZ組牙槽骨的IL-17A濃度值均比牙周軟組織低(P<0.05)，但M/CMCS組牙槽骨的IL-17A濃度值在第36天時(shí)比同時(shí)期該組的齦溝液高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.1.4 全血 模型組全血的IL-17A濃度，在第8，22，36天均較高，不同時(shí)間點(diǎn)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；M/CMCS組、PERIO組和MNZ組全血的IL-17A濃度在第22，36天較第8天均下降(P<0.05)，且3個(gè)藥物治療組在第8，22，36天較模型組明顯降低(P<0.05)，但M/CMCS組、PERIO組和MNZ組間在相同時(shí)間點(diǎn)均未見(jiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖5)。

與第8天比較，* P <0.05；與模型組比較，# P <0.05

在各相同時(shí)間點(diǎn)，同組全血IL-17A濃度均比齦溝液、牙周軟組織、牙槽骨為低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表1)。

2.2 牙周組織IL-17A的免疫組織化學(xué)結(jié)果

各組牙周組織的IL-17A免疫組化結(jié)果，在組織形態(tài)和陽(yáng)性表達(dá)程度方面均呈現(xiàn)一定差異。模型組大鼠正常牙周組織的基本形態(tài)嚴(yán)重破壞，齦附著點(diǎn)向根方嚴(yán)重退縮，牙根大部分暴露，齦乳頭上皮嚴(yán)重潰破且出現(xiàn)組織缺損，牙槽骨嚴(yán)重不規(guī)則吸收已經(jīng)接近根尖(見(jiàn)圖6A)；M/CMCS組在高倍鏡下可見(jiàn)齦附著點(diǎn)位置幾乎沒(méi)有發(fā)生根方位移，牙齦乳頭上皮下齦纖維致密完整、走向正常，牙周袋淺，結(jié)合上皮和上皮釘突完整，齦纖維下牙槽嵴頂發(fā)生少許不規(guī)則骨吸收，但形態(tài)基本正常，牙周韌帶未見(jiàn)明顯破壞(見(jiàn)圖6B)；PERIO組牙周軟組織形態(tài)與M/CMCS組相似，但牙周袋略寬略深且牙槽嵴水平型和垂直型吸收較M/CMCS組稍多(見(jiàn)圖6C)；MNZ組牙齦組織受損比M/CMCS組和PERIO組均嚴(yán)重，牙齦乳頭下纖維少許紊亂，牙槽嵴水平型吸收明顯且出現(xiàn)多個(gè)骨吸收陷窩(見(jiàn)圖6D)。

A.模型組(×100) B. M/CMCS組(×200) C. PERIO組(×100) D. MNZ組(×200)淺黃色、棕黃色表示陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度；B：牙槽骨；P：牙周膜；R：牙根

不同時(shí)間點(diǎn)牙周組織IHC結(jié)果顯示，與模型組比較，M/CMCS組、PERIO組和MNZ組在第8，22，36天IL-17A平均光密度(MOD)值均低(P<0.05)；MNZ組的MOD值在第8，22，36天均明顯高于M/CMCS組和PERIO組(P<0.05)；在第36天時(shí)，PERIO組也高于M/CMCS組(P<0.05，見(jiàn)圖7)。

與第8天比較，* P <0.05；與模型組比較，# P <0.05；與MNZ組比較，Δ P <0.05；與PERIO組比較，& P <0.05

3 討論

IL-17A在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有著重要的保護(hù)和破壞雙重作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，IL-17A通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和級(jí)聯(lián)反應(yīng)作用于不同的效應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生不同的生理或病理效應(yīng)，介導(dǎo)牙周炎的發(fā)生和發(fā)展[10,11]。IL-17A通過(guò)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分泌RANKL，提高RANKL的表達(dá)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞中的RANK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與破骨細(xì)胞分化，介導(dǎo)牙周炎的牙槽骨吸收[1,12]；IL-17A也可以在沒(méi)有RANKL的情況下誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成[1]。動(dòng)物研究表明，在局部注射IL-17A干預(yù)的牙周炎大鼠模型中，破骨細(xì)胞數(shù)量和牙槽骨吸收增加[13]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在局部牙周區(qū)域持續(xù)輸送IL-17A中和抗體可以限制實(shí)驗(yàn)性牙周炎小鼠的炎癥性骨丟失[14]。在該項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，研究者開(kāi)發(fā)出一種局部持續(xù)給藥系統(tǒng)，通過(guò)在聚乳酸-乙醇酸微粒中加入中和抗IL-17A抗體，該制劑系統(tǒng)在結(jié)扎誘導(dǎo)的牙周炎小鼠牙周組織中控制釋放抗IL-17A抗體，抑制牙周組織中的IL-17A活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠牙周炎誘導(dǎo)后局部注射抗IL-17A聚乳酸-乙醇酸微?？梢种蒲啦酃莵G失和破骨細(xì)胞活性；抗IL-17A聚乳酸-乙醇酸微粒配方還降低了IL-6的表達(dá)，而IL-6則是已知的可誘導(dǎo)牙周組織骨吸收的IL-17A靶基因。研究結(jié)果提示IL-17A單克隆抗體的局部和持續(xù)釋放是一種有希望的牙周炎治療策略[14]。因此，有理由期待更多的研究來(lái)確定IL-17A抑制劑是否可以局部用于治療牙周炎，以及在牙周炎的哪個(gè)發(fā)展階段應(yīng)該使用IL-17A抑制劑。

關(guān)于牙周炎過(guò)程中IL-17A的組織分布，許多研究表明，IL-17A存在于牙周病患者的牙周組織[15]、齦溝液[15-17]、唾液[18]和血漿[19]中，而且均較健康牙周者顯著增高。此外，慢性牙周炎患者牙齦組織中IL-17A mRNA的表達(dá)水平高于牙齦炎患者[20]。據(jù)此IL-17A被認(rèn)為是牙周炎病理過(guò)程中一個(gè)重要的生物學(xué)標(biāo)志因子。本次動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，牙周炎大鼠的IL-17A檢測(cè)結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)相同[15-19]。大鼠牙周炎發(fā)病過(guò)程中，IL-17A在齦溝液、牙周軟組織和牙槽骨包括全血發(fā)生表達(dá)變化。在未經(jīng)治療的模型組，都出現(xiàn)了IL-17A相對(duì)穩(wěn)定的高濃度表達(dá)，而且隨著時(shí)間變化，各組織樣本中的IL-17A水平趨于穩(wěn)定且沒(méi)有出現(xiàn)大的波動(dòng)，可能與牙周慢性炎癥持續(xù)狀態(tài)有關(guān)。因?yàn)檠乐苎鬃鳛橐环N慢性炎癥持續(xù)病理狀態(tài)，在沒(méi)有新的干預(yù)因素作用下，機(jī)體在一定時(shí)間內(nèi)會(huì)達(dá)到一種與感染誘導(dǎo)和免疫關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子間平衡。結(jié)合牙周檢查結(jié)果和形態(tài)學(xué)觀察，可以肯定IL-17A高表達(dá)與牙周組織的破壞有密切關(guān)系，因?yàn)?種藥物局部治療后，都出現(xiàn)了不同程度的IL-17A表達(dá)抑制，再結(jié)合IHC的MOD值分析，可以肯定藥物干預(yù)后牙周組織健康狀況的好轉(zhuǎn)與IL-17A的低表達(dá)有密切關(guān)系，尤其在M/CMCS組的表現(xiàn)更為明顯。

牙周炎治療的總體目標(biāo)是消除菌斑微生物及其他促進(jìn)因素，消除炎癥，控制牙周炎進(jìn)展并防止復(fù)發(fā)?，F(xiàn)在臨床廣泛采用的局部齦下刮治、根面平整后予以抗菌藥物和輔助劑治療，特別是齦下控釋與緩釋制劑的應(yīng)用，有一定的效果。甲硝唑因?yàn)榫邆鋵?zhuān)性厭氧菌的殺菌活性，多年來(lái)一直是臨床牙周炎抗生素治療的首選藥物，而派麗奧軟膏的主要成分為二甲胺四環(huán)素(又稱(chēng)米諾環(huán)素，minocycline)，也是目前臨床牙周治療中局部給藥最多的藥物之一，但是這些藥物的耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，療效面臨挑戰(zhàn)[21,22]。為了提高牙周炎的療效，現(xiàn)在臨床傾向于開(kāi)發(fā)以較低藥物劑量置入牙周袋的緩釋和/或控釋的靶向裝置，其中可以作為牙周藥物緩釋控載體的羧甲基殼聚糖，因?yàn)榫哂歇?dú)特的抗菌、抗炎、促進(jìn)組織愈合和誘導(dǎo)成骨的作用而為牙周病學(xué)界所重視[5,6]。因此，利用甲殼素作為藥物輸送載體，與具有抗厭氧菌效果的甲硝唑制成復(fù)方制劑便是一種理想的開(kāi)發(fā)思路。關(guān)于甲殼素與甲硝唑組成復(fù)方制劑后的細(xì)胞毒性和藥物釋放效果，相關(guān)研究也證實(shí)甲殼素/明膠/β-甘油磷酸酯溫敏水凝膠是一種無(wú)細(xì)胞毒性作用的藥物載體[23]。選擇低分子的甲硝唑和高分子的鹽酸萬(wàn)古霉素進(jìn)行藥物釋放比較研究，結(jié)果甲硝唑的體外初始釋放量和總釋放量分別為13%和67%，明顯優(yōu)于鹽酸萬(wàn)古霉素的3%和23%，表明甲殼素/明膠/β-甘油磷酸鹽可以形成并維持甲硝唑的持續(xù)釋放，其濃度隨著時(shí)間的推移可有效消除病原菌[23]。一項(xiàng)研究制備了可生物降解的殼聚糖包被甲硝唑和左氧氟沙星的藥物薄膜，體外抗菌效果測(cè)試表明該膜具有良好的抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的活性，臨床治療試驗(yàn)將藥膜置入患者牙周袋后，結(jié)果顯著降低了牙周炎的牙齦指數(shù)、菌斑指數(shù)和牙周袋深度，成為一種治療牙周炎的良好藥劑[24]。本實(shí)驗(yàn)采用甲硝唑羧甲基殼聚糖凝膠和對(duì)照藥物對(duì)大鼠牙周炎干預(yù)治療，對(duì)齦溝液、牙周軟硬組織和全血的IL-17A的分析，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物在牙周炎持續(xù)狀態(tài)下，均存在高表達(dá)，而在藥物干預(yù)后均有下降，自制的M/CMCS凝膠效果要優(yōu)于另外兩種對(duì)照抗生素藥物，通過(guò)齦溝液與牙周軟組織的結(jié)果可以看出，M/CMCS凝膠抑制IL-17A的分泌在第36天時(shí)不但優(yōu)于甲硝唑凝膠，而且也好過(guò)派麗奧軟膏。特別是如果將M/CMCS凝膠與單純的甲硝唑凝膠進(jìn)行比較，無(wú)論是對(duì)IL-17A的表達(dá)抑制還是在形態(tài)學(xué)方面，M/CMCS凝膠的優(yōu)勢(shì)更明顯，其中M/CMCS凝膠在第36天影響牙槽骨的IL-17A的表達(dá)與同時(shí)期齦溝液的比較，結(jié)果具有明顯差異，而派麗奧軟膏和單純的甲硝唑凝膠組均沒(méi)有出現(xiàn)此種現(xiàn)象，再結(jié)合免疫組化實(shí)驗(yàn)IL-17A的陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果和牙周組織的形態(tài)學(xué)變化特別是牙槽骨吸收的情況，可以初步說(shuō)明羧甲基殼聚糖聯(lián)合甲硝唑在抑制牙槽骨吸收方面有較好的作用，可能與IL-17A的表達(dá)抑制存在一定的關(guān)聯(lián)性。因?yàn)镸/CMCS凝膠制劑所含的羧甲基殼聚糖，除固有的抗炎、抑菌、促進(jìn)組織修復(fù)等生物學(xué)效應(yīng)外，尚具備緩釋控釋作用。其治療大鼠牙周炎良好的效果與緩釋制劑在牙周袋局部釋放甲硝唑的持久和增效相關(guān)，表現(xiàn)出了較好的抗感染和抑制口腔厭氧菌的作用。

總之，M/CMCS凝膠治療大鼠牙周炎的效應(yīng)可能與M/CMCS能夠抑制炎癥細(xì)胞因子IL-17A的分泌密切關(guān)聯(lián)，在目前抗生素治療牙周炎廣泛耐藥的情況下，是一種值得進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)的復(fù)方制劑。

致謝：本研究在唐山市人民醫(yī)院工作期間完成，感謝唐山市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室劉艷坤主任技術(shù)支持。