孫迎春,郝自新,楊積慧,程世云,汪玉萍,劉 喜
(1 安慶市食品藥品檢驗(yàn)中心,安慶 246001;2 安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院;* 通訊作者,E-mail:ychsun1219@126.com)
補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸)是由黃芪、黨參、甘草、白術(shù)、當(dāng)歸、升麻、柴胡、陳皮、生姜、大棗10味中藥制成的濃縮丸,具有補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)舉陷的功效,由我國(guó)經(jīng)典名方補(bǔ)中益氣湯轉(zhuǎn)換劑型所得。補(bǔ)中益氣湯初次記載于《內(nèi)外傷辨惑論》,是金元四大家李東垣的代表方劑之一[1]?,F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明,補(bǔ)中益氣湯具有調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞、抗炎、抗腫瘤等作用[2-6],在胃腸道、心肺及肝腎等多種器官疾病的治療上均取得滿意的療效[7-10]。中藥濃縮丸從古流傳至今,保留了傳統(tǒng)湯劑的確切療效,且具有載藥量大、順應(yīng)性好、服用和攜帶方便、適用人群范圍廣等特點(diǎn)[11]。補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第7冊(cè),現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[12]僅收錄性狀描述和顯微鑒別,無(wú)含量測(cè)定項(xiàng),質(zhì)量控制水平低,難以全面反映其內(nèi)在質(zhì)量,完善其質(zhì)量評(píng)價(jià)體系,是當(dāng)前亟需解決的問(wèn)題。本研究通過(guò)建立簡(jiǎn)單、操作性強(qiáng)的高效液相色譜(HPLC)多波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸)中甘草苷、阿魏酸、異阿魏酸、橙皮苷、甘草酸銨的含量,從而系統(tǒng)、整體地為補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸)的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)的依據(jù)。
UltiMate3000型高效液相色譜儀(兩元泵,DAD-3000型檢測(cè)器,自動(dòng)進(jìn)樣器,Chromeleon 7工作站),賽默飛世爾科技公司;XPE105型電子分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī),功率500 W,昆山市超聲儀器有限公司;0.45 μm微孔濾膜,比克曼生物科技有限公司。
對(duì)照品甘草苷(111610-201005,純度94.9%)、阿魏酸(110773-201915,純度99.4%)、異阿魏酸(111698-201904,純度99.3%)、橙皮苷(110721-201014,純度95.1%)、甘草酸銨(批號(hào):110731-202021,純度96.2%)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸)樣品11批,市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu),其中上海寶龍安慶藥業(yè)有限公司3批,批號(hào)分別為210315、210313、200615;上海華源制藥安徽廣生藥業(yè)有限公司,批號(hào)分別為210401、210402、210502;蕪湖張恒春藥業(yè)有限公司,批號(hào)分別為1910281、2103112;黃山市天目藥業(yè)有限公司,批號(hào)分別為200601、210201、201101;各陰性樣品由上海寶龍安慶藥業(yè)有限公司提供;乙腈、甲醇均為色譜純,來(lái)自美國(guó)Fisher公司,水為超純水,其他試劑均為分析純。
1.2.1 色譜條件 色譜柱:Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:以乙腈為流動(dòng)相A,0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B,按表1進(jìn)行梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng):0~12 min,276 nm;12~15 min,324 nm;15~25 min,283 nm;25~39 min,252 nm;流速:1.0 ml/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μl。
表1 梯度洗脫程序
1.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取各對(duì)照品適量,精密稱定,加70%甲醇配制成每1 ml含甘草酸銨3.828 8 mg、甘草苷0.982 2 mg、阿魏酸0.111 8 mg、異阿魏酸0.859 9 mg、橙皮苷0.841 7 mg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液,分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液2 ml,置同一25 ml棕色量瓶中,加70%甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為混合對(duì)照品溶液,室溫避光保存,備用。
1.2.3 供試品溶液的制備 取補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸),研細(xì),取2.0 g,精密稱定,置25 ml棕色量瓶中,加70%甲醇20 ml,超聲處理45 min,放冷至室溫,用70%甲醇定容,搖勻,經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。
1.2.4 陰性樣品溶液的制備 按照補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸)的處方和制備工藝,分別制備缺甘草、缺當(dāng)歸和升麻、缺陳皮的陰性樣品,按“1.2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法分別制備各陰性樣品溶液。
分別吸取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、“1.2.3”項(xiàng)下供試品溶液及“1.2.4”項(xiàng)下陰性樣品溶液各5 μl,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖。理論板數(shù)按各峰計(jì)算分別為:甘草苷30 026、阿魏酸44 818、異阿魏酸53 527、橙皮苷77 361、甘草酸銨49 523;5個(gè)成分分離度均大于1.5;陰性樣品溶液色譜圖中,在與混合對(duì)照品溶液色譜相對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處均沒(méi)有干擾峰,結(jié)果見(jiàn)圖1。
1.甘草苷(liquiritin);2.阿魏酸(ferulic acid);3.異阿魏酸(isoferulic acid);4.橙皮苷(hesperidin);5.甘草酸銨(ammonium glycyrrhizinate)
精密量取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液0.2,0.5,1.0,3.0,5.0,10.0 ml,分別置25 ml量瓶中,加70%甲醇定容至刻度,得系列濃度混合對(duì)照品溶液。取5 μl,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(X),相應(yīng)峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 各成分線性關(guān)系
精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5 μl注入液相色譜儀,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)得甘草苷、阿魏酸、異阿魏酸、橙皮苷、甘草酸銨峰面積RSD分別為0.57%,0.32%,0.38%,0.74%,0.61%,結(jié)果表明,儀器精密度良好。
取同一批樣品(批號(hào):210401)6份,各約2.0 g,精密稱定,分別按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄峰面積并采用外標(biāo)法計(jì)算出各成分的含量。甘草苷、阿魏酸、異阿魏酸、橙皮苷、甘草酸銨的平均含量分別為0.968 9,0.113 2,0.853 9,0.844 8,3.755 5 mg/g,RSD分別為1.35%,0.54%,1.08%,0.83%,0.76%,結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。
取同一份供試品溶液(批號(hào):210401),分別于室溫下放置0,4,8,12,16,24 h后,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)得甘草苷、阿魏酸、異阿魏酸、橙皮苷、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.91%,1.18%,0.55%,0.98%,0.74%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
稱取已知含量的樣品(批號(hào):210401)6份,各約1.0 g,精密稱定,分別置25 ml棕色量瓶中,各精密加入“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液1 ml,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依法進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)
取補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸)各批次,分別按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,除批號(hào)210401按重復(fù)性試驗(yàn)取6份外,其他各取3份,依法測(cè)定甘草苷、阿魏酸、異阿魏酸、橙皮苷、甘草酸銨的含量并計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸)中5種成分含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g)
試驗(yàn)考察了不同濃度的甲醇(100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇)和乙醇(100%乙醇、70%乙醇、50%乙醇)作為提取溶劑,經(jīng)比較以70%甲醇提取樣品時(shí)各成分提取率均較高,且雜質(zhì)干擾少。在此基礎(chǔ)上對(duì)比浸泡過(guò)夜、超聲、加熱回流提取,結(jié)果顯示,超聲提取較加熱回流提取各待測(cè)組分響應(yīng)值無(wú)明顯差別,且超聲提取處理時(shí)間短,操作更為簡(jiǎn)便。進(jìn)一步比較不同提取時(shí)間(30,45,60 min)對(duì)提取結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)45 min時(shí)各成分可提取完全,因此,試驗(yàn)采用70%甲醇超聲提取45 min作為補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸)樣品的提取方法。
中藥制劑具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn),現(xiàn)代研究表明,中藥制劑藥效的發(fā)揮主要依靠制劑內(nèi)各組分的整體協(xié)同作用,單一成分的含量檢測(cè)無(wú)法全面反映中藥制劑的質(zhì)量[13,14]。因黃芪中主要成分黃芪甲苷紫外最大吸收波長(zhǎng)在200 nm附近,不適合紫外檢測(cè)器測(cè)定含量,本課題組前期使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)對(duì)黃芪甲苷含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究;按照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件,黨參中主要成分黨參炔苷對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間為19.2 min,而11批供試品溶液在對(duì)應(yīng)時(shí)間均未檢出,可能是黨參炔苷遇熱不穩(wěn)定[15],在處方制備過(guò)程中因煎煮濃縮導(dǎo)致含量降低而無(wú)法檢出;參考相關(guān)文獻(xiàn)[16,17],實(shí)驗(yàn)前期采用5%氨水的甲醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行提取,結(jié)果顯示,柴胡皂苷a信號(hào)很弱,柴胡皂苷d幾乎沒(méi)有信號(hào),可能與補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸)前處理中煎煮時(shí)間有關(guān),柴胡在煎煮35 min(先煎煮15 min)時(shí)有效成分溶出率最高,隨著煎煮時(shí)間延長(zhǎng),柴胡水煎液中有效成分濃度逐漸降低,因?yàn)椴窈碥誥和柴胡皂苷d屬于原生皂苷,其環(huán)氧結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定,遇熱易轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2[18];白術(shù)的化學(xué)成分包括揮發(fā)油、多糖、內(nèi)酯類、倍半萜和苷類等,但其功效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確[19]。因此,選擇甘草中主要成分甘草苷和甘草酸銨、陳皮代表性成分橙皮苷、當(dāng)歸和升麻中共有的主要成分阿魏酸和異阿魏酸作為指標(biāo)進(jìn)行定量控制。
試驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)對(duì)補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸)中5種待測(cè)成分在190~400 nm波長(zhǎng)段進(jìn)行光譜掃描,發(fā)現(xiàn)甘草酸銨在252 nm,阿魏酸和異阿魏酸在324 nm,橙皮苷在283 nm有最大吸收;甘草苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為276 nm與217 nm,考慮217 nm為末端吸收,故選擇276 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng);待測(cè)組分群各組分最大吸收差異較大。預(yù)實(shí)驗(yàn)階段,篩選單一檢測(cè)波長(zhǎng),很難使每個(gè)組分的檢測(cè)響應(yīng)值達(dá)到理想要求,最終采用波長(zhǎng)切換法,0~12 min在276 nm檢測(cè)甘草苷,12~15 min在324 nm檢測(cè)阿魏酸和異阿魏酸,15~25 min在283 nm檢測(cè)橙皮苷,25~39 min在252 nm檢測(cè)甘草酸銨,實(shí)現(xiàn)各組分在最佳波長(zhǎng)處被檢測(cè),提高檢測(cè)靈敏度,使結(jié)果更加準(zhǔn)確。
考察4種不同流動(dòng)相體系(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液),結(jié)果顯示,有機(jī)相為乙腈,無(wú)機(jī)相中加入磷酸后,待測(cè)各組分峰形變銳,分離效果較好,但仍然有雜質(zhì)峰干擾。采用梯度洗脫,比較洗脫條件,最后確定“1.2.1”項(xiàng)下表1中洗脫程序。在此條件下,各待測(cè)組分與相鄰雜質(zhì)峰均能達(dá)到有效分離,且保留時(shí)間適中。
11批補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸)樣品含量測(cè)定結(jié)果顯示,同一廠家不同批次各成分含量較接近,但不同廠家差異明顯,可能與投料和生產(chǎn)工藝有關(guān),因此,補(bǔ)中益氣丸(濃縮丸)質(zhì)量的整體控制方法亟需進(jìn)一步完善,以確保產(chǎn)品質(zhì)量,從而為臨床安全用藥提供保障。