汪 濤，張振華，陳文兵，劉建軍，張彩霞，呂嘉華

(1.南京醫(yī)科大學附屬蘇州科技城醫(yī)院眼科，江蘇 蘇州 215153；2.蘇州眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科，江蘇 蘇州 215006；3.蘇州大學附屬第一醫(yī)院眼科，江蘇 蘇州 215006；4.上海復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科，上海 200031)

纖維化是一種慢性多器官疾病，其主要病變基礎為病理性上皮—間充質轉化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)[1]。晶狀體纖維性疾病，如前囊下白內(nèi)障(anterior subcapsular cataract，ASC)和后囊膜混濁(posterior caular opacification，PCO)，是視力障礙的常見原因[2-3]，其細胞學機制都與晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)EMT有關，轉化生長因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)誘導的LECsEMT被認為是構建晶狀體纖維性疾病體外模型的有效途徑，這為我們開展相關研究提供了方便的實驗模型[4]。據(jù)報道，眾多非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)在調節(jié)EMT過程中發(fā)揮關鍵作用[5-7]。深入探索基因調控網(wǎng)絡，如LncRNAs/miRNAs/mRNAs，有助于了解晶狀體纖維化的進展機制。本研究結合ASC患者的晶狀體前囊膜組織轉錄組學數(shù)據(jù)，篩選差異性表達最典型的LncRNA PVT1，探究其在LECs纖維化和白內(nèi)障進展中的作用及潛在分子機制，以期證實針對LncRNA PVT1/miR-124/Jagged-1/Notch通路的藥物靶向在預防和治療ASC、PCO或其他器官纖維化方面的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本采集 共收集了18例捐贈者(年齡40～58歲，男性15例，女性3例)的新鮮晶狀體標本，其中9例來自白內(nèi)障手術患者(ASC患者，晶狀體混濁度LOCSⅢ分級4～6級，排除糖尿病葡萄膜炎病史者)，術中取出晶狀體囊膜后，用撕囊鉗分離前囊纖維化組織部分；另9例正常透明晶狀體組織來自健康人體的死后捐贈眼(在死后8 h內(nèi)獲得，排除眼部疾病，LOCSⅢ分級1～2級)，采用撕囊鉗沿晶狀體赤道區(qū)切開晶狀體前囊膜，取晶狀體上皮組織。將晶狀體上皮組織塊置于含體積分數(shù)1%胎牛血清、體積分數(shù)1%非必需氨基酸、100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)上皮側面朝上。本研究獲南京醫(yī)科大學附屬蘇州科技城醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(2020021)，所有實驗及樣本采集符合《赫爾辛基宣言》。

1.1.2 細胞、主要藥物與試劑 人晶狀體上皮細胞株SRA01/04(中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所協(xié)和醫(yī)院)。TGFβ2、特異性Notch受體裂解抑制劑同義γ-分泌酶抑制劑Ⅸ(γ-Secretase Inhibitor Ⅸ，GSI-Ⅸ)、TGF-β/Smad抑制劑SB431542(美國Sigma-Aldrich公司)；miRNeasy Mini試劑盒(德國Qiagen公司)。GenePORTER轉染試劑(美國Genlantis公司)；pcDNA3.1質粒(美國Invitrogen公司)；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒、PrimeScript RT Master Mix試劑盒、SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)。初級抗體：纖維蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅳ型膠原蛋白(collagen type Ⅳ，Col Ⅳ)、鈣黏附蛋白E(E-cadherin)、鈣黏附蛋白N(N-cadherin)、肌動蛋白α(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3、Snail、Slug(美國Cell Signaling Technology公司)。EZ-Magna RIP RNA結合蛋白免疫沉淀試劑盒(美國Millipore公司)。

1.1.3 主要儀器 ND-1000紫外分光光度計(美國NanoDrop Technologies公司)；LSM510激光掃描共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)；LightCycler 480II實時PCR系統(tǒng)(瑞士Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染及分組 將SRA01/04細胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基(含體積分數(shù)1%胎牛血清、體積分數(shù)1%非必需氨基酸、100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素)中。為了研究下調LncRNA-PVT1表達對EMT及下游通路的影響，將SRA01/04細胞分為空白組、TGFβ2組、si-control組、si-PVT1組、si-PVT1+miR-NC組、si-PVT1+miR-124-inhibitor組。空白組細胞不作任何特殊處理。TGFβ2組用5 ng·mL-1TGFβ2作用48 h，si-control組、si-PVT1組、si-PVT1+miR-NC組、si-PVT1+miR-124-inhibitor組分別轉染PVT1小分子干擾RNA(siRNAs)的陰性對照序列、si-PVT1-1/si-PVT1-2、si-PVT1+miR-124 inhibitor陰性對照序列或miR-124 inhibitor序列后，用5 ng·mL-1TGFβ2作用48 h。為了研究TGFβ2對LncRNA PVT1表達的影響，將SRA01/04細胞分為空白組、TGFβ2組、GSI-Ⅸ+TGFβ2組和SB431542+TGFβ2組。GSI-Ⅸ+TGFβ2組和SB431542+TGFβ2組分別在TGFβ2作用前60 min加入GSI-Ⅸ(10 μmol·L-1)或SB431542(10 μmol·L-1)。

1.2.2 微陣列分析 使用TRIzol試劑和miRNeasy Mini試劑盒提取組織或細胞總RNA(每3份RNA合并成1份樣本)。利用紫外分光光度計檢測RNA樣本的質量和純度，通過凝膠電泳測定RNA完整性。利用Agilent Array平臺進行微陣列分析，分別以健康眼和ASC眼、TGFβ2組和未經(jīng)TGFβ2處理的空白組SRA01/04細胞LncRNAs差異表達為目標。從總RNA中去除rRNA后提純mRNA，然后采用隨機引物法擴增樣本，并沿著整個轉錄本長度轉錄成熒光cRNA。將標記的cRNAs與Arraystar人LncRNA微陣列v3.0雜交。利用Agilent G2505C掃描儀掃描和特征提取軟件v11.0.1.1對采集的陣列圖像進行分析，用GeneSpring GX v11.5.1軟件對微陣列數(shù)據(jù)進行生物信息學分析和可視化處理。

1.2.3 實時熒光定量PCR法檢測基因表達 利用TRIzol試劑提取SRA01/04細胞總RNA，使用DNase I酶提純基因組DNA。合成cDNA，并在ABI Prism7000熱循環(huán)儀上進行實時PCR反應。循環(huán)條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；然后在95 ℃ 10 s和60 ℃ 45 s下進行40次循環(huán)。采用RNU6B和GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.4 Western blot法檢測蛋白表達 用100 μL裂解液提取細胞總蛋白，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，半干法電印跡到聚偏氟乙烯膜上。用體積分數(shù)5%的脫脂牛奶封閉細胞膜，并與不同的一抗(Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3、Snail、Slug、FN、Col Ⅳ、E-cadherin、N-cadherin、α-SMA)在4 ℃下孵育過夜。然后在室溫下與辣根過氧化物酶藕聯(lián)的二抗孵育1 h。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因分析 利用兩種靶向識別工具Pictar(http://pictar.mdc-berlin.de/)和TargetScan 4.2(http://www.targetscan.org/vert_42/)來尋找LncRNA PVT1和miR-124的潛在靶基因。用PCR法擴增含有預測miR-124結合位點或相應突變位點的Jagged-1和LncRNA PVT1的3’-UTR序列，并轉染至pMIR-RB-REPORT熒光素酶編碼區(qū)。在轉染前24 h先將293T細胞接種于96孔板中。次日用LipofectamineTM2000轉染試劑將100 ng·mL-1報告質粒和50 nmol·L-1的miR-124 mimics或對照序列共轉染至293T細胞，用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.2.6 RNA結合蛋白免疫共沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation，RIP)法分析 裂解1×107個細胞，將100 μL細胞裂解混合物與含有抗Ago2結合磁珠的RIP緩沖液共孵育。用蛋白酶K緩沖液消化樣本，分離免疫沉淀RNA。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 微陣列分析LncRNAs差異表達譜

利用人LncRNA微陣列分析，熱圖顯示健康眼、ASC眼前囊膜組織存在628個差異性表達的LncRNAs(變化倍數(shù)≥2.0，P<0.05)，其中287個LncRNAs表達上調，341個LncRNAs表達下調，其中PVT1上調最明顯(圖1a)。此外，在LECs樣本中，空白組、TGFβ2組存在371個差異性表達的LncRNAs(變化倍數(shù)≥2.0，P<0.05)，其中171個LncRNAs表達上調，200個LncRNAs表達下調，PVT1是上調最明顯(前五位)的LncRNAs之一(圖1b)。

a：健康眼和ASC眼差異性表達的聚類分析熱圖和火山圖；b：空白組和TGFβ2組SAR01/04細胞差異性表達的聚類分析熱圖和火山圖

2.2 實時熒光定量PCR法檢測前囊膜組織和細胞中LncRNA PVT1、miR-124 mRNA表達水平

ASC眼的前囊膜組織和TGFβ2組SAR01/04細胞中LncRNA PVT1 mRNA表達水平較健康眼或空白組細胞升高(P<0.05)，同時miR-124 mRNA表達水平降低(P<0.05)。經(jīng)Spearman秩相關系數(shù)分析，在ASC眼的前囊膜組織或TGFβ2組SRA01/04細胞中LncRNA PVT1與miR-124表達水平均呈負相關性(P<0.05)。此外，分別用1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1TGFβ2作用于細胞48 h，LncRNA PVT1 mRNA表達水平逐漸升高(P<0.05)；用5 ng·mL-1TGFβ2分別作用于細胞12 h、24 h、48 h，LncRNA PVT1 mRNA表達水平亦逐漸升高(P<0.05)，說明TGFβ2可顯著誘導SRA01/04細胞LncRNA PVT1過表達，且呈劑量依賴性和時間依賴性，見圖2。

a：前囊膜組織LncRNA PVT1 mRNA表達差異(n=9)；b：前囊膜組織miR-124 mRNA表達差異(n=9)；c：SRA1/04細胞中LncRNA PVT1 mRNA表達差異(n=8)；d：SRA1/04細胞中miR-124 mRNA表達差異(n=8)；e：前囊膜組織LncRNA PVT1 mRNA和miR-124 mRNA表達的關系；f：SRA1/04細胞LncRNA PVT1 mRNA和miR-124 mRNA表達的關系；g:不同濃度TGFβ2作用于SRA1/04細胞48 h；h:不同時間5 ng·mL-1 TGFβ2作用于SRA1/04細胞 *：P<0.05

2.3 Western blot法檢測SRA01/04細胞EMT標記蛋白表達

與空白組相比，TGFβ2組上皮分化標志物E-cadherin蛋白表達下調，同時間充質細胞標志物FN蛋白表達上調(P<0.05)。然而分別轉染si-PVT1-1和si-PVT1-2后，E-cadherin蛋白表達高于TGFβ2組和si-control組，同時FN蛋白表達低于TGFβ2組和si-control組，尤其以si-PVT1-2組變化最明顯(P<0.05)，見圖3a。故選擇轉染si-PVT1-2用于后續(xù)實驗。此外，與空白組相比，TGFβ2組和si-control組間充質細胞標志物FN、α-SMA、Col IV、Snail、Slug蛋白表達上調，而si-PVT1組和si-PVT1+miR-NC組上述蛋白表達低于TGFβ2組和si-control組，但si-PVT1+miR-124-inhibitor組可逆轉si-PVT1對上述蛋白表達的下調作用(P<0.05)，見圖3b。

a：FN、E-cadherin蛋白表達；b：FN、α-SMA、Col Ⅳ、Snal、Slug蛋白表達 *：與空白組相比，P<0.05；#：與TGFβ2組相比，P<0.05；△：與si-control組相比，P<0.05；▲：與si-PVT1組相比，P<0.05；□：與si-PVT1+miR-NC組相比，P<0.05

2.4 雙熒光素酶報告基因驗證LncRNA PVT1、miR-124、Jagged-1之間的靶向作用

與轉染miR-NC相比，轉染miR-124 mimics能顯著降低PVT1、Jagged-1野生型(位點1、位點2)的熒光素酶活性(P<0.05)，見圖4。

a：LncRNA PVT1與miR-124靶向結合關系；b：Jagged1與miR-124靶向結合關系 *：與miR-NC相比，P<0.05

2.5 RIP法分析LncRNA PVT1和miR-124的調控關系

結果證實，LncRNA PVT1和miR-124都特異性富集了Ago2抗體相關復合物(P<0.05)，見圖5，表明PVT1通過“海綿吸附”miR-124，負向調節(jié)miR-124的表達。

*：與IgG相比，P<0.05

2.6 Western blot法檢測SRA01/04細胞Jagged-1/Notch通路相關蛋白表達

與空白組相比，TGFβ2組Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表達顯著上調，而GSI-Ⅸ+TGFβ2組、SB431542+TGFβ2組Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表達則低于TGFβ2組(P<0.05)，見圖6a。此外，同樣在TGFβ2作用下，si-PVT1組Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表達則低于TGFβ2組和si-control組，同時si-PVT1+miR-124-inhibitor組可逆轉si-PVT1對上述蛋白表達的下調作用(P<0.05)，見圖6b。

a： TGFβ2對Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表達的影響；b：LncRNA PVT1對Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表達的影響 *：與空白組相比，P<0.05；#：與TGFβ2組相比，P<0.05；△：與si-control組相比，P<0.05；▲：與si-PVT1組相比，P<0.05；□：與si-PVT1+miR-NC組相比，P<0.05

3 討論

本研究首先基于微陣列數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)LncRNA PVT1在ACS前囊膜組織或TGFβ2誘導的LECs中明顯表達上調。進一步的細胞實驗證實，TGFβ2可誘導LECs中上皮分化標志物E-cadherin蛋白表達下調，同時間充質細胞標志物FN蛋白表達上調，說明TGFβ2可促進LECs向間充質細胞表型轉化。在機制分析實驗中，TGFβ2可誘導SRA01/04細胞LncRNA PVT1過表達，這是一個呈劑量依賴性和時間依賴性的過程；而PVT1可負性調節(jié)miR-124，進而導致Jagged-1/Notch信號通路激活。因此，我們認為PVT1/miR-124/Jagged-1/Notch軸可能是TGFβ2誘導LECs發(fā)生EMT的重要分子機制之一。

LncRNA是非編碼轉錄體，雖然缺乏蛋白質編碼能力，但其在調節(jié)基因表達方面起著關鍵作用[8]。LECs發(fā)生EMT是導致ASC或PCO等繼發(fā)性白內(nèi)障的重要原因，而TGFβ2被認為是一個重要的誘因[2-4]。本研究結果顯示，TGFβ2以劑量依賴性和時間依賴性的方式誘導SRA01/04細胞LncRNA PVT1表達上調，這一點在ASC眼的前囊膜組織中也得到證實，說明LncRNA PVT1參與了ASC的病變過程。Western blot結果顯示，TGFβ2可抑制上皮分化標志物E-cadherin蛋白表達，同時誘導間充質細胞標志物FN蛋白表達上調，且TGFβ2誘導LECs發(fā)生EMT的作用受到LncRNA PVT1基因敲除的影響，下調PVT1基因表達后，miR-124表達相應上調，而TGFβ2對LECs中EMT標志物表達的影響得以改善。因此，我們認為TGFβ2通過PVT1依賴性機制誘導LECs發(fā)生EMT。

在分子機制方面，LncRNAs通過與miRNAs相互作用，調節(jié)miRNA下游靶基因的表達，發(fā)揮其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。研究顯示，PVT1能與miR-214[9]、miR-26b[10]等相互作用，進而調節(jié)細胞下游TGFβ1信號轉導，影響腫瘤細胞的侵襲和遷移。本研究雙熒光素酶報告基因實驗和免疫共沉淀實驗證實，PVT1可通過吸附miR-124進而影響miR-124下游通路Jagged1/Notch軸的激活。miR-124屬于腫瘤抑制分子，研究顯示其在癌癥[11-12]、腎間質纖維化[13]等疾病中可以抑制細胞EMT進程。此外，miR-124可以通過調節(jié)STAT3抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的活性和侵襲[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，ASC眼前囊膜組織中miR-124表達下降，說明其參與了繼發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病，并且miR-124在TGFβ2誘導的LECs-EMT中起著重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)多種miR-124靶基因與纖維化有關，包括ColⅠ[15]、結締組織生長因子[16]、Smad4[17]等。在本研究中，我們確定了其另一個靶基因Jagged-1，miR-124可直接與Jagged-1的3’-UTR相互作用，從而負向調節(jié)Jagged-1的表達。此外，miR-124也可影響Notch-1、Notch-2和Notch-3受體表達，這意味著miR-124除了直接抑制Jagged-1信號傳遞外，還可抑制下游Notch受體的表達，進而影響LECs纖維化進程。Notch信號在胚胎發(fā)育[18]、腫瘤轉移[19]和各種纖維化疾病[20]中起關鍵作用。因此阻斷Jagged-1信號傳導，可以整體逆轉TGFβ2誘導的LECs-EMT進程。

綜上，TGFβ2通過一種LncRNA PVT1依賴機制誘導LECs發(fā)生EMT。其機制之一是LncRNA PVT1通過“海綿吸附”miR-124負性調節(jié)其表達，進而誘導下游Jagged-1/Notch信號通路激活。因此，PVT1/miR-124/Jagged-1/Notch軸參與了TGFβ2誘導的LECs-EMT進程，而LncRNA PVT1有望成為治療ASC或PCO的潛在靶點。