汪 濤，張振華，陳文兵，劉建軍，張彩霞，呂嘉華

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院眼科，江蘇 蘇州 215153；2.蘇州眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科，江蘇 蘇州 215006；3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，江蘇 蘇州 215006；4.上海復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科，上海 200031)

纖維化是一種慢性多器官疾病，其主要病變基礎(chǔ)為病理性上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)[1]。晶狀體纖維性疾病，如前囊下白內(nèi)障(anterior subcapsular cataract，ASC)和后囊膜混濁(posterior caular opacification，PCO)，是視力障礙的常見(jiàn)原因[2-3]，其細(xì)胞學(xué)機(jī)制都與晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)EMT有關(guān)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)誘導(dǎo)的LECsEMT被認(rèn)為是構(gòu)建晶狀體纖維性疾病體外模型的有效途徑，這為我們開(kāi)展相關(guān)研究提供了方便的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚4]。據(jù)報(bào)道，眾多非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)在調(diào)節(jié)EMT過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-7]。深入探索基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如LncRNAs/miRNAs/mRNAs，有助于了解晶狀體纖維化的進(jìn)展機(jī)制。本研究結(jié)合ASC患者的晶狀體前囊膜組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，篩選差異性表達(dá)最典型的LncRNA PVT1，探究其在LECs纖維化和白內(nèi)障進(jìn)展中的作用及潛在分子機(jī)制，以期證實(shí)針對(duì)LncRNA PVT1/miR-124/Jagged-1/Notch通路的藥物靶向在預(yù)防和治療ASC、PCO或其他器官纖維化方面的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本采集 共收集了18例捐贈(zèng)者(年齡40～58歲，男性15例，女性3例)的新鮮晶狀體標(biāo)本，其中9例來(lái)自白內(nèi)障手術(shù)患者(ASC患者，晶狀體混濁度LOCSⅢ分級(jí)4～6級(jí)，排除糖尿病葡萄膜炎病史者)，術(shù)中取出晶狀體囊膜后，用撕囊鉗分離前囊纖維化組織部分；另9例正常透明晶狀體組織來(lái)自健康人體的死后捐贈(zèng)眼(在死后8 h內(nèi)獲得，排除眼部疾病，LOCSⅢ分級(jí)1～2級(jí))，采用撕囊鉗沿晶狀體赤道區(qū)切開(kāi)晶狀體前囊膜，取晶狀體上皮組織。將晶狀體上皮組織塊置于含體積分?jǐn)?shù)1%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%非必需氨基酸、100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)上皮側(cè)面朝上。本研究獲南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020021)，所有實(shí)驗(yàn)及樣本采集符合《赫爾辛基宣言》。

1.1.2 細(xì)胞、主要藥物與試劑 人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所協(xié)和醫(yī)院)。TGFβ2、特異性Notch受體裂解抑制劑同義γ-分泌酶抑制劑Ⅸ(γ-Secretase Inhibitor Ⅸ，GSI-Ⅸ)、TGF-β/Smad抑制劑SB431542(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；miRNeasy Mini試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)。GenePORTER轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Genlantis公司)；pcDNA3.1質(zhì)粒(美國(guó)Invitrogen公司)；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒、PrimeScript RT Master Mix試劑盒、SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)。初級(jí)抗體：纖維蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅳ型膠原蛋白(collagen type Ⅳ，Col Ⅳ)、鈣黏附蛋白E(E-cadherin)、鈣黏附蛋白N(N-cadherin)、肌動(dòng)蛋白α(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3、Snail、Slug(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。EZ-Magna RIP RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒(美國(guó)Millipore公司)。

1.1.3 主要儀器 ND-1000紫外分光光度計(jì)(美國(guó)NanoDrop Technologies公司)；LSM510激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司)；LightCycler 480II實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(瑞士Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將SRA01/04細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)1%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%非必需氨基酸、100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素)中。為了研究下調(diào)LncRNA-PVT1表達(dá)對(duì)EMT及下游通路的影響，將SRA01/04細(xì)胞分為空白組、TGFβ2組、si-control組、si-PVT1組、si-PVT1+miR-NC組、si-PVT1+miR-124-inhibitor組?？瞻捉M細(xì)胞不作任何特殊處理。TGFβ2組用5 ng·mL-1TGFβ2作用48 h，si-control組、si-PVT1組、si-PVT1+miR-NC組、si-PVT1+miR-124-inhibitor組分別轉(zhuǎn)染PVT1小分子干擾RNA(siRNAs)的陰性對(duì)照序列、si-PVT1-1/si-PVT1-2、si-PVT1+miR-124 inhibitor陰性對(duì)照序列或miR-124 inhibitor序列后，用5 ng·mL-1TGFβ2作用48 h。為了研究TGFβ2對(duì)LncRNA PVT1表達(dá)的影響，將SRA01/04細(xì)胞分為空白組、TGFβ2組、GSI-Ⅸ+TGFβ2組和SB431542+TGFβ2組。GSI-Ⅸ+TGFβ2組和SB431542+TGFβ2組分別在TGFβ2作用前60 min加入GSI-Ⅸ(10 μmol·L-1)或SB431542(10 μmol·L-1)。

1.2.2 微陣列分析 使用TRIzol試劑和miRNeasy Mini試劑盒提取組織或細(xì)胞總RNA(每3份RNA合并成1份樣本)。利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣本的質(zhì)量和純度，通過(guò)凝膠電泳測(cè)定RNA完整性。利用Agilent Array平臺(tái)進(jìn)行微陣列分析，分別以健康眼和ASC眼、TGFβ2組和未經(jīng)TGFβ2處理的空白組SRA01/04細(xì)胞LncRNAs差異表達(dá)為目標(biāo)。從總RNA中去除rRNA后提純mRNA，然后采用隨機(jī)引物法擴(kuò)增樣本，并沿著整個(gè)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度轉(zhuǎn)錄成熒光cRNA。將標(biāo)記的cRNAs與Arraystar人LncRNA微陣列v3.0雜交。利用Agilent G2505C掃描儀掃描和特征提取軟件v11.0.1.1對(duì)采集的陣列圖像進(jìn)行分析，用GeneSpring GX v11.5.1軟件對(duì)微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析和可視化處理。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)基因表達(dá) 利用TRIzol試劑提取SRA01/04細(xì)胞總RNA，使用DNase I酶提純基因組DNA。合成cDNA，并在ABI Prism7000熱循環(huán)儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。循環(huán)條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；然后在95 ℃ 10 s和60 ℃ 45 s下進(jìn)行40次循環(huán)。采用RNU6B和GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 用100 μL裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，半干法電印跡到聚偏氟乙烯膜上。用體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂牛奶封閉細(xì)胞膜，并與不同的一抗(Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3、Snail、Slug、FN、Col Ⅳ、E-cadherin、N-cadherin、α-SMA)在4 ℃下孵育過(guò)夜。然后在室溫下與辣根過(guò)氧化物酶藕聯(lián)的二抗孵育1 h。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因分析 利用兩種靶向識(shí)別工具Pictar(http://pictar.mdc-berlin.de/)和TargetScan 4.2(http://www.targetscan.org/vert_42/)來(lái)尋找LncRNA PVT1和miR-124的潛在靶基因。用PCR法擴(kuò)增含有預(yù)測(cè)miR-124結(jié)合位點(diǎn)或相應(yīng)突變位點(diǎn)的Jagged-1和LncRNA PVT1的3’-UTR序列，并轉(zhuǎn)染至pMIR-RB-REPORT熒光素酶編碼區(qū)。在轉(zhuǎn)染前24 h先將293T細(xì)胞接種于96孔板中。次日用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將100 ng·mL-1報(bào)告質(zhì)粒和50 nmol·L-1的miR-124 mimics或?qū)φ招蛄泄厕D(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.6 RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation，RIP)法分析 裂解1×107個(gè)細(xì)胞，將100 μL細(xì)胞裂解混合物與含有抗Ago2結(jié)合磁珠的RIP緩沖液共孵育。用蛋白酶K緩沖液消化樣本，分離免疫沉淀RNA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 微陣列分析LncRNAs差異表達(dá)譜

利用人LncRNA微陣列分析，熱圖顯示健康眼、ASC眼前囊膜組織存在628個(gè)差異性表達(dá)的LncRNAs(變化倍數(shù)≥2.0，P<0.05)，其中287個(gè)LncRNAs表達(dá)上調(diào)，341個(gè)LncRNAs表達(dá)下調(diào)，其中PVT1上調(diào)最明顯(圖1a)。此外，在LECs樣本中，空白組、TGFβ2組存在371個(gè)差異性表達(dá)的LncRNAs(變化倍數(shù)≥2.0，P<0.05)，其中171個(gè)LncRNAs表達(dá)上調(diào)，200個(gè)LncRNAs表達(dá)下調(diào)，PVT1是上調(diào)最明顯(前五位)的LncRNAs之一(圖1b)。

a：健康眼和ASC眼差異性表達(dá)的聚類(lèi)分析熱圖和火山圖；b：空白組和TGFβ2組SAR01/04細(xì)胞差異性表達(dá)的聚類(lèi)分析熱圖和火山圖

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)前囊膜組織和細(xì)胞中LncRNA PVT1、miR-124 mRNA表達(dá)水平

ASC眼的前囊膜組織和TGFβ2組SAR01/04細(xì)胞中LncRNA PVT1 mRNA表達(dá)水平較健康眼或空白組細(xì)胞升高(P<0.05)，同時(shí)miR-124 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。經(jīng)Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析，在ASC眼的前囊膜組織或TGFβ2組SRA01/04細(xì)胞中LncRNA PVT1與miR-124表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。此外，分別用1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1TGFβ2作用于細(xì)胞48 h，LncRNA PVT1 mRNA表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05)；用5 ng·mL-1TGFβ2分別作用于細(xì)胞12 h、24 h、48 h，LncRNA PVT1 mRNA表達(dá)水平亦逐漸升高(P<0.05)，說(shuō)明TGFβ2可顯著誘導(dǎo)SRA01/04細(xì)胞LncRNA PVT1過(guò)表達(dá)，且呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性，見(jiàn)圖2。

a：前囊膜組織LncRNA PVT1 mRNA表達(dá)差異(n=9)；b：前囊膜組織miR-124 mRNA表達(dá)差異(n=9)；c：SRA1/04細(xì)胞中LncRNA PVT1 mRNA表達(dá)差異(n=8)；d：SRA1/04細(xì)胞中miR-124 mRNA表達(dá)差異(n=8)；e：前囊膜組織LncRNA PVT1 mRNA和miR-124 mRNA表達(dá)的關(guān)系；f：SRA1/04細(xì)胞LncRNA PVT1 mRNA和miR-124 mRNA表達(dá)的關(guān)系；g:不同濃度TGFβ2作用于SRA1/04細(xì)胞48 h；h:不同時(shí)間5 ng·mL-1 TGFβ2作用于SRA1/04細(xì)胞 *：P<0.05

2.3 Western blot法檢測(cè)SRA01/04細(xì)胞EMT標(biāo)記蛋白表達(dá)

與空白組相比，TGFβ2組上皮分化標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，同時(shí)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物FN蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。然而分別轉(zhuǎn)染si-PVT1-1和si-PVT1-2后，E-cadherin蛋白表達(dá)高于TGFβ2組和si-control組，同時(shí)FN蛋白表達(dá)低于TGFβ2組和si-control組，尤其以si-PVT1-2組變化最明顯(P<0.05)，見(jiàn)圖3a。故選擇轉(zhuǎn)染si-PVT1-2用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此外，與空白組相比，TGFβ2組和si-control組間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物FN、α-SMA、Col IV、Snail、Slug蛋白表達(dá)上調(diào)，而si-PVT1組和si-PVT1+miR-NC組上述蛋白表達(dá)低于TGFβ2組和si-control組，但si-PVT1+miR-124-inhibitor組可逆轉(zhuǎn)si-PVT1對(duì)上述蛋白表達(dá)的下調(diào)作用(P<0.05)，見(jiàn)圖3b。

a：FN、E-cadherin蛋白表達(dá)；b：FN、α-SMA、Col Ⅳ、Snal、Slug蛋白表達(dá) *：與空白組相比，P<0.05；#：與TGFβ2組相比，P<0.05；△：與si-control組相比，P<0.05；▲：與si-PVT1組相比，P<0.05；□：與si-PVT1+miR-NC組相比，P<0.05

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證LncRNA PVT1、miR-124、Jagged-1之間的靶向作用

與轉(zhuǎn)染miR-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-124 mimics能顯著降低PVT1、Jagged-1野生型(位點(diǎn)1、位點(diǎn)2)的熒光素酶活性(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

a：LncRNA PVT1與miR-124靶向結(jié)合關(guān)系；b：Jagged1與miR-124靶向結(jié)合關(guān)系 *：與miR-NC相比，P<0.05

2.5 RIP法分析LncRNA PVT1和miR-124的調(diào)控關(guān)系

結(jié)果證實(shí)，LncRNA PVT1和miR-124都特異性富集了Ago2抗體相關(guān)復(fù)合物(P<0.05)，見(jiàn)圖5，表明PVT1通過(guò)“海綿吸附”miR-124，負(fù)向調(diào)節(jié)miR-124的表達(dá)。

*：與IgG相比，P<0.05

2.6 Western blot法檢測(cè)SRA01/04細(xì)胞Jagged-1/Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)

與空白組相比，TGFβ2組Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而GSI-Ⅸ+TGFβ2組、SB431542+TGFβ2組Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表達(dá)則低于TGFβ2組(P<0.05)，見(jiàn)圖6a。此外，同樣在TGFβ2作用下，si-PVT1組Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表達(dá)則低于TGFβ2組和si-control組，同時(shí)si-PVT1+miR-124-inhibitor組可逆轉(zhuǎn)si-PVT1對(duì)上述蛋白表達(dá)的下調(diào)作用(P<0.05)，見(jiàn)圖6b。

a： TGFβ2對(duì)Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表達(dá)的影響；b：LncRNA PVT1對(duì)Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表達(dá)的影響 *：與空白組相比，P<0.05；#：與TGFβ2組相比，P<0.05；△：與si-control組相比，P<0.05；▲：與si-PVT1組相比，P<0.05；□：與si-PVT1+miR-NC組相比，P<0.05

3 討論

本研究首先基于微陣列數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)LncRNA PVT1在ACS前囊膜組織或TGFβ2誘導(dǎo)的LECs中明顯表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGFβ2可誘導(dǎo)LECs中上皮分化標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，同時(shí)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物FN蛋白表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明TGFβ2可促進(jìn)LECs向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。在機(jī)制分析實(shí)驗(yàn)中，TGFβ2可誘導(dǎo)SRA01/04細(xì)胞LncRNA PVT1過(guò)表達(dá)，這是一個(gè)呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性的過(guò)程；而PVT1可負(fù)性調(diào)節(jié)miR-124，進(jìn)而導(dǎo)致Jagged-1/Notch信號(hào)通路激活。因此，我們認(rèn)為PVT1/miR-124/Jagged-1/Notch軸可能是TGFβ2誘導(dǎo)LECs發(fā)生EMT的重要分子機(jī)制之一。

LncRNA是非編碼轉(zhuǎn)錄體，雖然缺乏蛋白質(zhì)編碼能力，但其在調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面起著關(guān)鍵作用[8]。LECs發(fā)生EMT是導(dǎo)致ASC或PCO等繼發(fā)性白內(nèi)障的重要原因，而TGFβ2被認(rèn)為是一個(gè)重要的誘因[2-4]。本研究結(jié)果顯示，TGFβ2以劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性的方式誘導(dǎo)SRA01/04細(xì)胞LncRNA PVT1表達(dá)上調(diào)，這一點(diǎn)在ASC眼的前囊膜組織中也得到證實(shí)，說(shuō)明LncRNA PVT1參與了ASC的病變過(guò)程。Western blot結(jié)果顯示，TGFβ2可抑制上皮分化標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物FN蛋白表達(dá)上調(diào)，且TGFβ2誘導(dǎo)LECs發(fā)生EMT的作用受到LncRNA PVT1基因敲除的影響，下調(diào)PVT1基因表達(dá)后，miR-124表達(dá)相應(yīng)上調(diào)，而TGFβ2對(duì)LECs中EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響得以改善。因此，我們認(rèn)為T(mén)GFβ2通過(guò)PVT1依賴(lài)性機(jī)制誘導(dǎo)LECs發(fā)生EMT。

在分子機(jī)制方面，LncRNAs通過(guò)與miRNAs相互作用，調(diào)節(jié)miRNA下游靶基因的表達(dá)，發(fā)揮其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。研究顯示，PVT1能與miR-214[9]、miR-26b[10]等相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞下游TGFβ1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PVT1可通過(guò)吸附miR-124進(jìn)而影響miR-124下游通路Jagged1/Notch軸的激活。miR-124屬于腫瘤抑制分子，研究顯示其在癌癥[11-12]、腎間質(zhì)纖維化[13]等疾病中可以抑制細(xì)胞EMT進(jìn)程。此外，miR-124可以通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的活性和侵襲[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，ASC眼前囊膜組織中miR-124表達(dá)下降，說(shuō)明其參與了繼發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病，并且miR-124在TGFβ2誘導(dǎo)的LECs-EMT中起著重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)多種miR-124靶基因與纖維化有關(guān)，包括ColⅠ[15]、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子[16]、Smad4[17]等。在本研究中，我們確定了其另一個(gè)靶基因Jagged-1，miR-124可直接與Jagged-1的3’-UTR相互作用，從而負(fù)向調(diào)節(jié)Jagged-1的表達(dá)。此外，miR-124也可影響Notch-1、Notch-2和Notch-3受體表達(dá)，這意味著miR-124除了直接抑制Jagged-1信號(hào)傳遞外，還可抑制下游Notch受體的表達(dá)，進(jìn)而影響LECs纖維化進(jìn)程。Notch信號(hào)在胚胎發(fā)育[18]、腫瘤轉(zhuǎn)移[19]和各種纖維化疾病[20]中起關(guān)鍵作用。因此阻斷Jagged-1信號(hào)傳導(dǎo)，可以整體逆轉(zhuǎn)TGFβ2誘導(dǎo)的LECs-EMT進(jìn)程。

綜上，TGFβ2通過(guò)一種LncRNA PVT1依賴(lài)機(jī)制誘導(dǎo)LECs發(fā)生EMT。其機(jī)制之一是LncRNA PVT1通過(guò)“海綿吸附”miR-124負(fù)性調(diào)節(jié)其表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)下游Jagged-1/Notch信號(hào)通路激活。因此，PVT1/miR-124/Jagged-1/Notch軸參與了TGFβ2誘導(dǎo)的LECs-EMT進(jìn)程，而LncRNA PVT1有望成為治療ASC或PCO的潛在靶點(diǎn)。