王 麗，黃永陽(yáng)，張 義，綦 彬，萬(wàn) 龍，杜炎平，陳才盛

(黃岡市中心醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，湖北 黃岡 438000)

血小板反應(yīng)蛋白家族是一類具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的鈣相關(guān)糖蛋白，主要位于細(xì)胞膜表面，由于其特殊的三聚體結(jié)構(gòu)，血小板反應(yīng)蛋白可通過(guò)與各種靶蛋白的相互作用，廣泛參與多種生理及病理活動(dòng)過(guò)程，如血管生成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞骨架組成和細(xì)胞外基質(zhì)反應(yīng)[1-2]。血小板反應(yīng)蛋白1(thrombospondin-1,THBS1)作為血小板反應(yīng)蛋白家族最早確定的成員，由16 393個(gè)堿基組成，包括22個(gè)外顯子，由包括血小板、巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等在內(nèi)的多種細(xì)胞分泌，暫存于細(xì)胞外基質(zhì)中，可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的釋放[3]。有研究表明，THBS1在炎癥疾病、組織纖維化、組織損傷、多項(xiàng)腫瘤及血管形成過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[4-5]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是具有自我更新和多向分化潛力的細(xì)胞，具有組織修復(fù)功能，并且可作為免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑。鑒于其免疫抑制特性、組織修復(fù)能力和各種生物因子的分泌能力，目前基于BMSCs的療法已在多種疾病的臨床前研究和臨床試驗(yàn)中開展，包括心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、器官損傷、器官移植、慢性炎癥和自身免疫性疾病等[6-7]。變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)作為一種常見(jiàn)的慢性可逆性鼻腔炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為陣發(fā)性反復(fù)打噴嚏、流鼻涕或鼻塞，癥狀通常連續(xù)出現(xiàn)2 d或更長(zhǎng)時(shí)間，通常會(huì)導(dǎo)致嗅覺(jué)功能嚴(yán)重受損[8]。AR參與全身炎癥過(guò)程，并與哮喘、鼻竇炎和過(guò)敏性結(jié)膜炎等炎癥性疾病有關(guān)，對(duì)患者的睡眠、學(xué)習(xí)、工作和社交生活均會(huì)造成嚴(yán)重影響，并導(dǎo)致更高的社會(huì)醫(yī)療成本。AR治療的關(guān)鍵在于防止體內(nèi)進(jìn)一步的炎癥病變并促進(jìn)組織功能的恢復(fù)。BMSCs移植被認(rèn)為是一種有潛力的AR治療方法。本研究通過(guò)以THBS1基因編輯的BMSCs移植治療AR小鼠，觀察該作用下小鼠鼻黏膜屏障功能及炎癥反應(yīng)變化，以期為AR的治療尋找新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

65只SPF級(jí)健康BALB/c小鼠，10周齡，雌雄各半，體質(zhì)量18～25 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018，飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體屏障飼養(yǎng)室內(nèi)，溫度22～24 ℃，相對(duì)濕度(50±5)%，12 h/12 h明暗周期交替，期間喂食鼠糧，自由飲水。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(KY20210519108)。

1.2 主要材料與試劑

卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和氫氧化鋁(美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清、青霉素/鏈霉素混合液、L-谷胺酰胺、DMEM培養(yǎng)液及胰蛋白酶(美國(guó)HyClone公司)，RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(日本Takara公司)，茜素紅染液、油紅O染液、BCA蛋白測(cè)定試劑盒及ECL超敏發(fā)光液(上海碧云天生物研究所)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，HE染色試劑盒和PAS染色試劑盒(北京索萊寶科技公司)，免疫熒光染色試劑盒(武漢博士德生物公司)，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CD34、CD45、CD73、CD90及CD105抗體，兔抗THBS1、Claudin-1、CK-5、β-tubulin單克隆抗體和兔抗Occludin、GAPDH多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG及熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(北京康為世紀(jì))。含THBS基因—綠色熒光蛋白EGFP標(biāo)記的慢病毒載體以及空載體—綠色熒光蛋白EGFP標(biāo)記的慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建、完成包裝及滴度測(cè)定。

1.3 BMSCs分離與鑒定

將5只BALB/c小鼠以脫臼法處死，無(wú)菌環(huán)境下取其股骨和脛骨，PBS清洗，斷開股骨暴露骨髓腔，用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素及2 mmol/L L-谷胺酰胺的DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗，并收集沖洗液置于干凈離心管，以4 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌，加入新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以1×106/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間每2 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，常規(guī)傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)情況。取第5代呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的BMSCs，消化后取細(xì)胞懸液，分別加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CD34、CD45、CD73、CD90及CD105抗體，經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)。分別使用成骨完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)21 d，以成脂分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d，誘導(dǎo)結(jié)束后，通過(guò)茜素紅染色和油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞成骨與成脂分化能力。

1.4 THBS1基因修飾BMSCs構(gòu)建

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的BMSCs，以5×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。次日，在培養(yǎng)孔細(xì)胞中添加含THBS1基因—綠色熒光蛋白EGFP標(biāo)記的慢病毒液或空載體—綠色熒光蛋白EGFP標(biāo)記的慢病毒液感染BMSCs，分別記為THBS1-BMSCs組、NC-BMSCs組，同時(shí)添加感染增強(qiáng)液以提高效果，復(fù)感染指數(shù)MOI=10，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h后，更換為含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，以正常培養(yǎng)的BMSCs作為對(duì)照組。48 h后用熒光顯微鏡觀察感染后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白EGFP表達(dá)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)RNAiso Plus試劑說(shuō)明書提取感染后細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD值，確定RNA樣品的質(zhì)量濃度。以總RNA為底物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定THBS1 mRNA水平，根據(jù)定量試劑盒說(shuō)明書操作，以GAPDH為內(nèi)參基因，擴(kuò)增條件：第1階段，95 ℃ 3 min(1個(gè)循環(huán))；第2階段，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，95 ℃ 15 s(42個(gè)循環(huán))?；蛞镄蛄校篢HBS1上游引物5’-AGCCGCCACATCAAACACATA-3’，下游引物5’-CGCTGGATTCTCAAGTCGTT-3’；GAPDH上游引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’,下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。擴(kuò)增結(jié)束后，采用2-△△Ct法計(jì)算THBS1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 Western blot

RIPA緩沖液預(yù)冷處理后，加入到感染后細(xì)胞或研磨后的鼻黏膜組織中，提取總蛋白，以BCA法測(cè)定濃度。取等量蛋白樣品與5×Loading buffer混合，沸水浴煮沸10 min，上樣至10% SDS-PAGE凝膠孔內(nèi)，80 V恒壓電泳20 min后，將電壓調(diào)為110 V電泳60 min，恒壓100 V，冰上2 h轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，膜上滴加兔抗THBS1單克隆抗體、兔抗Claudin-1單克隆抗體和兔抗Occludin多克隆抗體，均按1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過(guò)夜；次日，TBST洗膜，加入對(duì)應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，以1∶5 000稀釋，室溫孵育1 h。TBST再次洗膜，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃膜拍照，Image-ProPlus軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.7 動(dòng)物模型構(gòu)建與分組處理

60只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、BMSCs組、THBS1-BMSCs組，每組15只。除對(duì)照組外，其余3組小鼠構(gòu)建AR模型。AR造模：取適應(yīng)性飼養(yǎng)后的BALB/c小鼠，參考文獻(xiàn)[9]建立AR實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，首先進(jìn)行基礎(chǔ)致敏，以1 mL生理鹽水溶解0.3 mg OVA與30 mg氫氧化鋁，混勻制備混懸液，進(jìn)行小鼠腹腔注射，隔日注射1次，共注射8次，開始注射時(shí)記為1 d，16 d后結(jié)束，對(duì)照組小鼠同時(shí)注射等量生理鹽水；基礎(chǔ)致敏后，進(jìn)行激發(fā)，配制10 mg/100 L OVA，以微量進(jìn)樣器從小鼠雙側(cè)鼻腔滴入，每天1次，連續(xù)7 d，對(duì)照組同時(shí)滴入等量生理鹽水，22 d后結(jié)束。激發(fā)后第22～25天，用酒精擦拭鼠尾靜脈消毒，對(duì)照組和模型組小鼠均尾靜脈注射0.1 mL PBS，BMSCs組小鼠尾靜脈注射0.1 mL BMSCs(含5×105個(gè)細(xì)胞)，THBS1-BMSCs組小鼠尾靜脈注射0.1 mL經(jīng)THBS1基因編輯的BMSCs(含5×105個(gè)細(xì)胞)。

1.8 生物學(xué)癥狀評(píng)分

造模后觀察各組小鼠活動(dòng)、攝食及飲水等情況，對(duì)其流涕、撓鼻及噴嚏情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各項(xiàng)疊加量化計(jì)分：噴嚏，1～3個(gè)記1分，4～10個(gè)記2分，11個(gè)以上記3分；流鼻涕，流至前鼻孔記1分，流出超過(guò)前鼻孔記2分，流至面部記3分；撓鼻，1～5次記1分，6～15次記2分，16次以上記3分。評(píng)分總分大于5分即為造模成功[10]。給藥后統(tǒng)計(jì)各組小鼠撓鼻與噴嚏次數(shù)，并進(jìn)行比較。

1.9 ELISA測(cè)定血清炎癥因子水平

通過(guò)眼眶采集各組小鼠血液，置于室溫下2 h，以4 000 r/min離心15 min，收獲血清棄去余物，在-80 ℃冰箱中保存。使用特異性ELISA試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清IFN-γ、IgE、TNF-α、IL-4及IL-6的含量，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.10 HE染色和PAS染色觀察鼻黏膜病理形態(tài)學(xué)

處死小鼠后取鼻中隔黏膜，用4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(厚度4 μm)，進(jìn)行HE染色，中性樹膠封固切片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域，在光鏡下觀察組織病理學(xué)改變，采集圖像儲(chǔ)存，計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果以平均值表示。

將制備的鼻黏膜組織切片脫蠟至水，浸入阿利新藍(lán)染液處理15 min，蒸餾水清洗，置于過(guò)碘酸溶液中氧化5 min，以SchiffReagent浸染10 min，流水沖洗后，酸性分化液分化，氨水返藍(lán)，經(jīng)梯度乙醇脫水與二甲苯透明后，中性樹膠封固，在光鏡下觀察統(tǒng)計(jì)杯狀細(xì)胞數(shù)目，采集圖像儲(chǔ)存，同樣隨機(jī)選擇5個(gè)視野，結(jié)果以平均值表示。

1.11 免疫熒光染色檢測(cè)鼻黏膜CK-5與β-tubulin蛋白表達(dá)

將鼻黏膜組織復(fù)溫并晾干，使用預(yù)冷的丙酮固定10 min，PBS清洗，組化筆在組織周圍畫圈，滴加蛋白酶K液于圈內(nèi)，37 ℃孵育30 min后，在圈內(nèi)滴入適量破膜工作液，常溫孵育30 min，PBS清洗，3%BSA封閉30 min。棄去封閉液后，在切片上滴加稀釋后的兔抗CK-5與β-tubulin單克隆抗體(1∶200)，4 ℃隔夜孵育。次日，棄去原液，加入熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶200)，室溫孵育2 h，DAPI避光染核10 min，中性樹膠封固，在熒光顯微鏡下觀察組織染色情況并采集圖像儲(chǔ)存，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算各蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMSCs鑒定

通過(guò)倒置顯微鏡觀察分離培養(yǎng)的細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，大小一致，呈網(wǎng)狀或放射狀，見(jiàn)圖1a。經(jīng)過(guò)茜素紅染色和油紅O染色后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯橘紅色鈣沉淀和紅色脂滴積累，見(jiàn)圖1b、c。流式細(xì)胞結(jié)果顯示，細(xì)胞表面抗原CD105、CD90和CD73均呈陽(yáng)性表達(dá)，而CD34和CD45均呈陰性表達(dá)，并具備良好的成骨與成脂分化能力，說(shuō)明成功分離到BMSCs，見(jiàn)圖1d。

a：倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；b：茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞成骨分化能力；c：油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞成脂分化能力；d：流式細(xì)胞儀測(cè)定干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)

2.2 THBS1基因編輯BMSCs的效果測(cè)定

倒置熒光顯微鏡觀察到NC-BMSCs組和THBS1-BMSCs組細(xì)胞中均可見(jiàn)明顯的綠色熒光蛋白EGFP表達(dá)，感染率在90%以上，而對(duì)照組未見(jiàn)明顯的綠色熒光蛋白EGFP表達(dá)，見(jiàn)圖2a。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和NC-BMSCs組比較，THBS1-BMSCs組細(xì)胞中THBS1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2b、c。

表2 各組小鼠血清炎癥因子水平比較

2.3 各組小鼠生物學(xué)癥狀評(píng)分

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，造模后小鼠生物學(xué)癥狀評(píng)分大于5分，提示造模成功。與對(duì)照組比較，模型組小鼠出現(xiàn)連續(xù)性噴嚏，頻繁撓鼻，次數(shù)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，BMSCs組和THBS1-BMSCs組小鼠噴嚏和撓鼻次數(shù)顯著減少(P<0.05)；與BMSCs組比較，THBS1-BMSCs組小鼠的噴嚏和撓鼻次數(shù)均顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠噴嚏與撓鼻次數(shù)比較次)

2.4 各組小鼠血清炎癥因子水平比較

ELISA結(jié)果顯示，模型組小鼠血清IFN-γ含量顯著低于對(duì)照組，IgE、TNF-α、IL-4及IL-6含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；與模型組比較，BMSCs組和THBS1-BMSCs組小鼠血清IFN-γ含量顯著升高，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6含量均顯著降低(P<0.05)；與BMSCs組比較，THBS1-BMSCs組小鼠血清IFN-γ含量進(jìn)一步顯著升高，而IgE、TNF-α、IL-4、IL-6含量均顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.5 各組小鼠鼻黏膜病理形態(tài)學(xué)與炎癥反應(yīng)觀察

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠鼻黏膜結(jié)構(gòu)清晰完整，未見(jiàn)明顯上皮細(xì)胞脫落與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠鼻黏膜纖毛排列不規(guī)則，上皮細(xì)胞脫落且間質(zhì)水腫，有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，黏膜下腺體增生；與模型組比較，BMSCs組小鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞脫落明顯減少，層間間質(zhì)水腫減輕，嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)，腺體增生減輕，THBS1-BMSCs組小鼠鼻黏膜病變得到明顯改善，上皮細(xì)胞脫落不多，未見(jiàn)明顯嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)，腺體輕微增生。

PAS染色結(jié)果中深紫色為杯狀細(xì)胞，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠鼻黏膜上皮層未見(jiàn)明顯杯狀細(xì)胞，而模型組小鼠鼻黏膜上皮層可見(jiàn)大量杯狀細(xì)胞，數(shù)目較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，BMSCs組和THBS1-BMSCs組小鼠鼻黏膜上皮層杯狀細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)，THBS1-BMSCs組較BMSCs組進(jìn)一步顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2 THBS1基因編輯BMSCs結(jié)果

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與BMSCs組比較，P<0.05

2.6 各組小鼠鼻黏膜CK-5與β-tubulin蛋白表達(dá)比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示，模型組小鼠鼻黏膜CK-5與β-tubulin的熒光強(qiáng)度均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；與模型組比較，BMSCs組和THBS1-BMSCs組小鼠鼻黏膜CK-5與β-tubulin的熒光強(qiáng)度均顯著增強(qiáng)(P<0.05)；THBS1-BMSCs組小鼠鼻黏膜CK-5與β-tubulin的熒光強(qiáng)度顯著高于BMSCs組(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與BMSCs組比較，P<0.05

2.7 各組小鼠鼻黏膜Claudin-1與Occludin蛋白表達(dá)比較

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠鼻黏膜Claudin-1與Occludin蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，BMSCs組和THBS1-BMSCs組小鼠鼻黏膜Claudin-1與Occludin蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)；與BMSCs組比較，THBS1-BMSCs組小鼠鼻黏膜Claudin-1與Occludin蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

a:倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白EGFP表達(dá)；b:實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)THBS1 mRNA表達(dá)；c：Western blot檢測(cè)THBS1蛋白表達(dá) *：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與NC-BMSCs組比較，P<0.05

3 討論

流行病學(xué)研究表明，10%～40%的成年人與2%～25%的兒童患有AR，且AR的患病率在全球范圍內(nèi)不斷增加[11]。在病理學(xué)上，AR與過(guò)敏原特異性IgE介導(dǎo)的針對(duì)環(huán)境過(guò)敏原的免疫反應(yīng)有關(guān)，且經(jīng)過(guò)對(duì)鼻—支氣管系統(tǒng)功能研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)敏不是局限于某個(gè)特定器官，而是涉及整個(gè)呼吸道的疾病，并表現(xiàn)出廣泛的癥狀[8]。鼻炎已被確定為哮喘發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，尋找鼻炎的有效治療方法可預(yù)防或延緩哮喘發(fā)作。特應(yīng)性個(gè)體通過(guò)激活樹突細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞對(duì)過(guò)敏原敏感，樹突細(xì)胞位于鼻黏膜表面，通過(guò)捕獲過(guò)敏原并將過(guò)敏原肽呈遞給引流淋巴結(jié)中的T淋巴細(xì)胞，引起2型輔助性T淋巴細(xì)胞(T-helper lymphocyte type-2，Th2)過(guò)敏反應(yīng)。因此，Th2相關(guān)細(xì)胞因子的釋放增強(qiáng)了B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE，并促進(jìn)了鼻組織中嗜酸性粒細(xì)胞的募集。更確切地說(shuō)，IgE分子被釋放到血液中并與組織肥大細(xì)胞和循環(huán)嗜堿性粒細(xì)胞表面的高親和力受體結(jié)合，導(dǎo)致預(yù)先形成的介質(zhì)(如組胺)快速釋放，從而引發(fā)早期癥狀，如打噴嚏、鼻癢和流鼻涕。而脂質(zhì)介質(zhì)(如白三烯C4和前列腺素D2)的產(chǎn)生，通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞上黏附分子的表達(dá)促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的流入，引起鼻塞等晚期癥狀[12-13]。目前，常規(guī)藥物治療可以緩解過(guò)敏癥狀，但并不能干擾過(guò)敏反應(yīng)。此外，藥物治療后復(fù)發(fā)以及副作用產(chǎn)生都會(huì)影響AR的療效，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此，尋找更有效的AR治療策略意義重大。

近年來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)已被證實(shí)可抑制炎癥，是一種有前景的治療AR的療法。Desai等[14]證實(shí)，與過(guò)敏性哮喘中的MSCs相比，AR小鼠模型中的MSCs可促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生并向APCs呈遞過(guò)敏原，從而促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖；Fan等[15]研究表明，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的MSCs可激活CD4+、CD8+T細(xì)胞及Treg細(xì)胞，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子水平，提高AR患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞反應(yīng)，并可根據(jù)不同疾病階段發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)功能；Zhao等[16]證明在AR小鼠模型中靜脈注射BMSCs可明顯減輕過(guò)敏癥狀并減少嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，降低Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13等水平，升高Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平。本研究結(jié)果顯示，AR小鼠在尾靜脈注射BMSCs后，血清IFN-γ含量升高而IgE、TNF-α、IL-4、IL-6含量均下降，抑制了鼻黏膜組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與杯狀細(xì)胞增加的現(xiàn)象。目前，基因修飾和干細(xì)胞相結(jié)合的療法是一項(xiàng)研究熱點(diǎn)，經(jīng)過(guò)基因編輯的BMSCs輸送到機(jī)體后，不僅能夠發(fā)揮干細(xì)胞歸巢與修復(fù)的作用，還可以提高目的基因的表達(dá)，兩者協(xié)同進(jìn)而起到擴(kuò)大間充質(zhì)干細(xì)胞治療疾病的作用[17]。本研究結(jié)果顯示，相較于BMSCs單獨(dú)作用，經(jīng)THBS1基因編輯BMSCs治療的AR小鼠，其連續(xù)性噴嚏、頻繁撓鼻等癥狀進(jìn)一步緩解，血清IFN-γ含量升高，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6含量均下降，同時(shí)，鼻黏膜組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，杯狀細(xì)胞也明顯減少，由此說(shuō)明，THBS1基因編輯BMSCs對(duì)AR小鼠的改善作用優(yōu)于BMSCs單獨(dú)作用。

鼻黏膜上皮屏障作為機(jī)體免疫防御的第一道防線，能夠抵御外界多種病原菌、毒物等入侵及破壞，對(duì)于保護(hù)鼻黏膜內(nèi)部環(huán)境至關(guān)重要，與AR的發(fā)生、發(fā)展及好轉(zhuǎn)均密切相關(guān)[18-19]。鼻黏膜上皮細(xì)胞作為鼻黏膜屏障的主要組成部分，其基本功能是依賴于多種蛋白之間形成的復(fù)合物形成緊密連接的能力，從而在氣道腔和上皮下組織之間形成物理屏障。其中，Claudin-1與Occludin作為緊密連接蛋白，在細(xì)胞連接中發(fā)揮屏障及柵欄作用，是決定細(xì)胞旁通透性的關(guān)鍵因素，能夠顯示細(xì)胞形成緊密屏障的能力[20]。CK-5主要分布于上皮細(xì)胞，作為上皮細(xì)胞分化的標(biāo)志物，能夠與膜蛋白形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，主要功能是維持上皮組織的完整性及連續(xù)性，并在細(xì)胞形態(tài)和信號(hào)傳導(dǎo)中具有重要作用[21]。β-tubulin是細(xì)胞的一種骨架蛋白，參與多種重要的細(xì)胞功能，如維持結(jié)構(gòu)、運(yùn)輸途徑和細(xì)胞分裂等[22-23]。本研究結(jié)果顯示，AR小鼠鼻黏膜CK-5與β-tubulin熒光強(qiáng)度減弱，Claudin-1與Occludin蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，而經(jīng)BMSCs或THBS1基因編輯BMSCs治療的AR小鼠的鼻黏膜CK-5與β-tubulin熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，Claudin-1與Occludin蛋白表達(dá)水平也上調(diào)；此外，相較于BMSCs單獨(dú)作用，THBS1基因編輯BMSCs治療的AR小鼠鼻黏膜CK-5與β-tubulin熒光更強(qiáng)，Claudin-1與Occludin蛋白表達(dá)水平更高，由此表明，THBS1基因編輯BMSCs能夠增強(qiáng)鼻黏膜屏障功能，逆轉(zhuǎn)鼻黏膜的重塑。

綜上，THBS1基因編輯BMSCs可減輕AR小鼠流涕、打噴嚏等過(guò)敏癥狀，減少嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞過(guò)度增殖以及炎癥因子的釋放，增強(qiáng)鼻黏膜屏障功能，延緩AR進(jìn)展。然而，THBS1基因編輯BMSCs對(duì)于細(xì)胞間連接的其他組成部分以及具體機(jī)制，仍有待后續(xù)進(jìn)一步研究。