王書君，譚慧瓊，袁 杰

(1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570102；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 100037；3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830001)

急性心肌梗死是全球范圍內(nèi)常見的心血管疾病，及時開通梗死相關(guān)動脈，恢復(fù)缺血心肌的供血，是挽救垂死心肌及防止梗死范圍再次擴大的關(guān)鍵。但有研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血一段時間后恢復(fù)血流灌注會加重心肌結(jié)構(gòu)和功能的損傷，導(dǎo)致心功能下降和惡性心律失常，這一過程稱為心肌缺血再灌注(myocardial ischemia-reperfusion，MI/R)損傷[1-2]。目前，MI/R損傷仍是治療心肌缺血所面臨的主要難題。因此，如何在早期恢復(fù)冠脈血流的基礎(chǔ)上減少甚至消除MI/R損傷的發(fā)生具有重要的臨床意義。

熱休克蛋白A12B(heat shock protein A12B，HSPA12B)于2003年從動脈粥樣硬化病變中克隆出來，歸類為熱休克蛋白70(HSP70)家族的一員，包含非典型的ATPase結(jié)構(gòu)域[3]。與HSP70家族其他成員的普遍性表達不同，HSPA12B在內(nèi)皮細胞中特異性表達，能夠抵御多種有害因素。已有研究表明，HSPA12B能夠在心肌梗死和腦缺血后發(fā)揮對組織器官的保護作用[4-5]，還能夠改善膿毒癥引起的心臟功能障礙[6]，但相關(guān)的作用機制尚未明確。

為進一步確定HSPA12B在MI/R損傷中的具體作用及機制，本研究通過構(gòu)建MI/R大鼠模型并給予含HSPA12B的慢病毒液預(yù)先處理，觀察HSPA12B對MI/R心肌組織損傷及心肌組織內(nèi)環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表達的影響，并檢測線粒體自噬途徑的變化情況，旨在揭示HSPA12B調(diào)控MI/R損傷的作用機制，為MI/R損傷的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康SD大鼠，雄性，4周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自海南藥物研究所有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于無特定病原體屏障環(huán)境中，溫度(23±2)℃，相對濕度(50±5)%，12 h/12 h明暗周期交替，實驗期間自由飲水、攝食。本實驗獲得中國科學(xué)院阜外醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(K20211021208)。

1.2 主要試劑

空白慢病毒載體pLVX-NC和含HSPA12B慢病毒載體pLVX-HSPA12B的合成和包裝均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)特異性ELISA試劑盒購自上海慧穎生物公司，HE染色試劑盒購自北京索萊寶生物公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翌圣生物公司，免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，DAB顯色液、RIPA裂解液、考馬斯亮藍試劑盒和ECL發(fā)光試劑液購自上海碧云天生物研究所，兔抗人COX-2多克隆、兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta，LC3β)多克隆、兔抗人Parkin多克隆、兔抗人PINK1多克隆及兔抗鼠GAPDH多克隆等抗體均購自英國Abcam公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 分組與處理

將40只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為4組，每組10只。假手術(shù)組大鼠僅暴露心臟，不進行MI/R處理；模型組大鼠心肌內(nèi)注射0.9%氯化鈉注射液20 μL，7 d后構(gòu)建MI/R模型；pLVX-NC組大鼠心肌內(nèi)注射20 μL pLVX-NC慢病毒液，7 d后構(gòu)建MI/R模型；pLVX-HSPA12B組大鼠心肌內(nèi)注射20 μL pLVX-HSPA12B慢病毒液，7 d后構(gòu)建MI/R模型。注射操作如下：將大鼠消毒后麻醉，仰臥位固定，氣管插管并連接動物呼吸器進行機械通氣；在大鼠左胸第4和第5肋骨之間剪開皮膚，使心臟完全暴露，采用微量注射器分4點在各組大鼠心肌中注射相應(yīng)液體，留置注射針2 min，閉合胸腔，肌內(nèi)注射1.5 mL/kg硫酸慶大霉素抗感染，每日1次，持續(xù)3 d。

1.4 動物造模

參考文獻[7]方法構(gòu)建MI/R大鼠模型。將大鼠消毒后，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，然后固定在動物實驗臺上，氣管插管并連接動物呼吸器進行機械通氣。在大鼠左胸第4和第5肋骨間剪開皮膚，使心臟完全暴露，用絲線在冠狀動脈左前降支下約2 mm處進行結(jié)扎，以阻塞左冠狀動脈前降支，心電圖觀察ST段抬高0.1 mV左右，持續(xù)結(jié)扎40 min進行缺血處理，之后釋放結(jié)扎絲線，再灌注120 min，待ST段下降到缺血時的0.05 mV，即成功構(gòu)建大鼠MI/R模型。隨后立即閉合胸腔，縫合切口，消毒，肌內(nèi)注射1.5 mL/kg硫酸慶大霉素抗感染，每日1次，持續(xù)3 d。

1.5 ELISA檢測心肌損傷指標

處理結(jié)束后，各組大鼠經(jīng)尾靜脈采血2 mL，室溫靜置2 h，4 ℃低溫以4 000 r/min離心20 min，制備血清。將樣品加入各反應(yīng)孔，使用大鼠特異性ELISA試劑盒測定各組大鼠血清CK-MB和LDH含量。

1.6 HE染色觀察心肌組織病理學(xué)改變

采血后處死各組大鼠，無菌環(huán)境下解剖取各組大鼠心肌組織，清洗干凈，在4%多聚甲醛中固定，然后經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，制備厚度約為5 μm的切片。將切片脫蠟水化，蘇木素染色10 min，流水沖洗多余染液，1%酒精—鹽酸分化，水洗，反藍，伊紅染色1 min，再次經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，隨后中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化，并攝取圖片。

1.7 TUNEL染色檢測細胞凋亡情況

取制備的各組大鼠心肌組織切片，以梯度酒精脫水，二甲苯透明，PBS清洗，加入20 μg蛋白酶K溶液，室溫水解15 min，蒸餾水清洗；加入含2%過氧化氫的PBS，室溫反應(yīng)5 min，PBS清洗，棄掉組織周圍多余染液，滴加TdT試劑液，置于濕盒中37 ℃孵育60 min；終止反應(yīng)后，PBS清洗，使用新鮮配制的DAB溶液室溫顯色5 min，脫水透明，隨后中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5個200倍鏡視野進行觀察。陽性細胞呈褐色，計數(shù)視野下200個細胞與其中的陽性細胞數(shù)，計算各組大鼠心肌組織內(nèi)TUNEL染色陽性細胞率。

1.8 免疫組織化學(xué)染色檢測心肌組織中COX-2、LC3β表達

各組大鼠心肌組織切片以二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，檸檬酸鈉修復(fù)抗原，0.3%過氧化氫液室溫孵育10 min，PBS浸泡清洗，再以10%山羊血清進行封閉。結(jié)束后，分別滴加兔抗人COX-2(1∶100)、LC3β(1∶200)多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日，棄掉原液，PBS清洗，滴加對應(yīng)的二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h后采用DAB溶液室溫顯色，沖洗干凈，隨后蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡觀察組織內(nèi)著色情況。陽性染色為胞質(zhì)或胞核呈棕色至深褐色，隨機選擇5個視野，利用Image J軟件進行分析，計算各組大鼠心肌組織內(nèi)COX-2、LC3β陽性表達率。

1.9 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達

將各組大鼠心肌組織在無菌環(huán)境下剪碎，加入液氮研磨，添加適量RIPA裂解液，置于冰上裂解，以提取組織總蛋白，考馬斯亮藍法測定。取各組蛋白樣品，98 ℃水浴加熱，并制備10%SDS-PAGE，取等量的蛋白樣品進行上樣后，經(jīng)電泳分離蛋白，80 V恒壓電泳20 min，110 V再電泳60 min，恒壓100 V處理90 min，將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗工作液，4 ℃孵育過夜。次日，棄掉原液，TBST洗膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h，TBST再次洗膜，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Parkin及PINK1蛋白的相對表達水平。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清心肌損傷標志物水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清CK-MB和LDH的含量均明顯升高(P<0.05)；與模型組和pLVX-NC組比較，pLVX-HSPA12B組大鼠血清CK-MB和LDH的含量均明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清心肌損傷指標水平比較

2.2 各組大鼠心肌組織病理變化

假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，組織內(nèi)細胞排列較為整齊，心肌纖維緊密，無明顯的腫脹及紊亂現(xiàn)象；模型組和pLVX-NC組大鼠心肌纖維腫脹變大，出現(xiàn)斷裂，并伴大量炎性細胞浸潤；與模型組和pLVX-NC組比較，pLVX-HSPA12B組大鼠心肌組織病理損傷現(xiàn)象得到緩解，心肌纖維斷裂現(xiàn)象減少，心肌細胞排列較為整齊(圖1)。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)(HE染色×100)

2.3 各組大鼠心肌組織細胞凋亡情況

TUNEL染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織內(nèi)TUNEL陽性細胞率較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)，表明凋亡細胞增加；pLVX-HSPA12B組大鼠心肌組織內(nèi)TUNEL陽性細胞率較模型組和pLVX-NC組明顯下降(P<0.05)，表明凋亡細胞減少(圖2)。

a：TUNEL染色(×200)；b：TUNEL染色陽性細胞率 *：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與pLVX-NC組比較，P<0.05

2.4 各組大鼠心肌組織COX-2表達

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織內(nèi)染色加深，COX-2陽性表達率明顯升高(P<0.05)；與模型組和pLVX-NC組比較，pLVX-HSPA12B組大鼠心肌組織內(nèi)染色明顯變淺，COX-2陽性表達率明顯降低(P<0.05)，見圖3。

a：免疫組織化學(xué)染色(×100)；b：COX-2陽性表達率 *：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與pLVX-NC組比較，P<0.05

2.5 各組大鼠心肌細胞線粒體自噬水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織內(nèi)染色較少，且顏色變淺，LC3β陽性表達率明顯下降(P<0.05)；而相較于模型組和pLVX-NC組，pLVX-HSPA12B組大鼠心肌組織內(nèi)染色加深，LC3β陽性表達率明顯上升(P<0.05)，見圖4。

a：免疫組織化學(xué)染色(×100)；b：LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值；c:Parkin蛋白相對表達；d：PINK1蛋白相對表達 *：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與pLVX-NC組比較，P<0.05

2.6 各組大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白表達

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降(P<0.05)，Parkin、PINK1蛋白的表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)；與模型組和pLVX-NC組比較，pLVX-HSPA12B組大鼠心肌組織內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升(P<0.05)，Parkin、PINK1蛋白的表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖5。

a：各蛋白條帶；b：LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值；c:Parkin蛋白相對表達水平；d:PINK1蛋白相對表達水平 *：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與pLVX-NC組比較，P<0.05

3 討論

MI/R誘導(dǎo)的心肌細胞死亡是導(dǎo)致冠心病患者死亡的主要病理因素之一。MI/R會引發(fā)一系列復(fù)雜的炎癥反應(yīng)及嚴重的組織損傷和心律失常，阻止心臟收縮功能恢復(fù)，并導(dǎo)致缺血組織中細胞死亡[2,8]。目前，MI/R引發(fā)的一系列復(fù)雜性損傷已成為全球范圍內(nèi)致殘和致死的主要因素，也是心血管疾病患者死亡的主要原因[9]。而且沒有切實可行的解決方案能夠徹底避免MI/R損傷，迫切需要制定出針對治療MI/R損傷的新策略。因此，本研究通過使用含HSPA12B的慢病毒液預(yù)先處理大鼠后構(gòu)建MI/R模型，了解其對MI/R損傷的潛在作用機制，以期為MI/R的治療策略提供參考。

HSPA12B作為內(nèi)皮細胞中特異性表達的熱休克蛋白，參與內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，能夠促進血管生成，現(xiàn)已證明HSPA12B在一些疾病中發(fā)揮重要的治療作用。Zhao等[10]研究表明，HSPA12B過表達可通過eNOS依賴性機制促進缺血性中風(fēng)慢性期小鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)并提高其存活率；Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，HSPA12B可通過調(diào)節(jié)靶向黏附分子的miR-126表達來預(yù)防敗血癥誘導(dǎo)的嚴重心肌病，從而減少心肌中免疫細胞的積累；Thirunavukkarasu等[11]的研究指出，HSPA12B基因療法可以改善后肢缺血小鼠的運動功能，促進新生血管形成，并減少組織纖維化。本研究結(jié)果顯示，與模型組和pLVX-NC組比較，在經(jīng)HSPA12B預(yù)處理的MI/R大鼠模型中，血清中損傷標志物CK-MB和LDH的含量均下降，心肌組織損傷現(xiàn)象明顯減輕，進一步說明了HSPA12B對MI/R損傷具有良好的緩解作用。

COX是前列腺素生物合成的限速酶，其有COX-1和COX-2兩種異構(gòu)體。COX-1在許多組織中表達，主要在組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用；相比之下，COX-2作為一種誘導(dǎo)性酶，是各種炎癥過程的中心環(huán)節(jié)，負責(zé)在炎癥和傷口愈合部位產(chǎn)生前列腺素[12]。COX-2在炎癥血管中表達上調(diào)，并在動脈粥樣硬化、動脈瘤和動脈球囊損傷中對病程發(fā)展起到促進作用[13]。另外，Yin等[14]通過將主動脈血管內(nèi)皮細胞暴露在PM2.5環(huán)境中后發(fā)現(xiàn)，COX-2的表達水平明顯上調(diào)，而在暴露于PM2.5環(huán)境前用特定COX-2抑制劑處理血管內(nèi)皮細胞后，不僅完全阻止了細胞凋亡，而且還減輕了炎癥反應(yīng)。越來越多的研究表明，COX-2與心肌梗死疾病的進展有關(guān)，Abbate等[15]研究表明，COX-2在心肌梗死患者的心肌細胞中高表達，并與細胞凋亡呈正相關(guān)；賈丹等[16]指出，抑制COX-2活性能夠降低體外缺氧/復(fù)氧實驗?zāi)M的MI/R中促炎因子的轉(zhuǎn)錄，并對H9C2心肌細胞具有保護作用。鑒于此，本研究通過檢測各組MI/R大鼠心肌組織內(nèi)COX-2表達發(fā)現(xiàn)，與模型組和pLVX-NC組比較，經(jīng)HSPA12B預(yù)處理的MI/R大鼠心肌組織內(nèi)COX-2陽性表達率明顯降低。由此推測，HSPA12B可能通過介導(dǎo)COX-2在MI/R損傷中發(fā)揮作用。

終末分化心肌細胞的死亡是各種心臟疾病發(fā)生的主要原因，包括心力衰竭、心肌梗死及MI/R損傷。在心臟病發(fā)病過程中，細胞凋亡和壞死都能夠?qū)е滦募〖毎劳?，而心肌細胞死亡是MI/R損傷中心臟功能衰竭的核心特征[17]。心肌細胞死亡是不可逆的，并伴細胞膜電位的快速喪失，從而導(dǎo)致細胞腫脹、破裂、溶解及后續(xù)炎癥的發(fā)生。線粒體自噬指細胞降解自身線粒體的過程，該途徑可以清除MI/R損傷下心臟中功能失調(diào)的線粒體，以減輕病理損傷[18]。研究表明，心肌細胞中線粒體自噬的機制是由胞質(zhì)E3泛素連接酶Parkin和線粒體膜激酶PTEN誘導(dǎo)的推定激酶PINK1介導(dǎo)，PINK1在線粒體中選擇性穩(wěn)定，其內(nèi)膜上的電位降低，并將Parkin募集到線粒體以激活其E3泛素連接酶活性，導(dǎo)致線粒體自噬并通過自噬機制去除受損的線粒體[19]。此外，Parkin非依賴性線粒體自噬途徑由Bcl-2、BNIP3或BNIP3L介導(dǎo)，這些受體激活后可直接與LC3β結(jié)合，促進缺氧條件下的線粒體自噬發(fā)生。本研究經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，與模型組和pLVX-NC組比較，經(jīng)HSPA12B預(yù)處理的MI/R大鼠模型心肌組織內(nèi)LC3β陽性表達率上升，Parkin、PINK1蛋白的表達水平明顯上調(diào)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也升高。由此推測，HSPA12B作用下增加了MI/R大鼠心肌細胞線粒體自噬，從而發(fā)揮對心臟組織的保護作用。

綜上，大鼠MI/R損傷會導(dǎo)致COX-2表達升高，線粒體自噬功能降低，心肌組織損傷，而HSPA12B能夠抑制COX-2表達，并增加線粒體自噬，從而逆轉(zhuǎn)MI/R損傷。本研究從線粒體自噬入手，為探究以HSPA12B為靶點改善MI/R損傷提供了實驗依據(jù)。