許 朗，黃忠衛(wèi)，魯大鵬，韓 炎，周麗芝

(1.北京積水潭醫(yī)院口腔科，北京 100035；2.北京王府中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院口腔科，北京 102200；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院急診綜合治療中心，北京 100050；4.文安縣醫(yī)院口腔科，河北 廊坊 065800；5.河北省唐山市第八醫(yī)院口腔科，河北 唐山 063000)

口腔癌是臨床常見的惡性腫瘤，其中口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)約占90%[1]。盡管目前OSCC患者的預(yù)后獲得了極大改善，但其長期預(yù)后仍不容樂觀，5年生存率低于50%[2]。因此，有必要深入研究OSCC發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)在機制。研究表明，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)參與調(diào)節(jié)包括OSCC在內(nèi)的多種惡性腫瘤的生物學(xué)特征[3-5]；有研究發(fā)現(xiàn)，miR-663b在結(jié)直腸癌中表達上調(diào)，其能促進結(jié)直腸癌細胞的增殖而發(fā)揮致癌基因作用[6]；此外，miR-663b在骨肉瘤細胞中表達水平升高，干擾miR-663b表達可有效誘導(dǎo)骨肉瘤細胞凋亡[7]。然而，miR-663b在OSCC細胞中的作用目前仍不清楚。本研究旨在通過生物信息學(xué)分析和功能實驗探討miR-663b在OSCC發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)功能及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、實驗動物與試劑

人OSCC細胞系HSC-3、CAL-27(豐暉生物)，SPF級Nu/Nu品系裸鼠18只(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，體質(zhì)量15～20 g；本實驗根據(jù)實驗動物管理與保護的有關(guān)規(guī)定飼養(yǎng)動物并進行實驗。

miR-663b、醛脫氫酶6家族成員A1(aldehyde dehydrogenase 6 family member A1,ALDH6A1)過表達質(zhì)粒(上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)，ALDH6A1一抗(英國Abcam公司)，HRP標記的IgG二抗(美國BioRad公司)，DMEM培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)，NADPH/NADP+比值檢測試劑盒(美國Abbkine公司)，Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 利用基因表達匯編(gene expression omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫OSCC組織芯片(GSE45238、GSE28100、GSE98463)分析癌組織和正常對照樣本中的差異表達miRNA，并取交集；下載TCGA數(shù)據(jù)庫中頭頸癌表達數(shù)據(jù)和臨床信息，并挑選出OSCC患者，以miR-663b的表達水平均數(shù)分組，使用GSEA3.0軟件分析miR-663b表達水平與細胞增殖、氧化還原的關(guān)系。分析GSE138206、GSE74530共同下調(diào)的基因，并與miRWalk預(yù)測miR-663b的靶基因取交集。以ALDH6A1表達水平中位數(shù)分組，基因富集分析(genomic enrichment analysis，GSEA)ALDH6A1表達水平和細胞氧化還原以及細胞增殖的關(guān)系。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人OSCC細胞系HSC-3、CAL-27細胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長匯合率達85%以上后進行傳代培養(yǎng)。采用Lipofectamine 2000將miR-663b mimic及ALDH6A1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HSC-3、CAL-27細胞。miR-663b慢病毒表達載體由上海吉凱基因醫(yī)學(xué)構(gòu)建、包裝后轉(zhuǎn)染HSC-3細胞，用于構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型。

1.2.3 裸鼠皮下移植瘤實驗 18只裸鼠分為miR-NC組和miR-663b組，每組9只，取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-663b的HSC-3細胞約5×106個重懸于100 μL PBS中，分別注射到裸鼠腋下誘導(dǎo)OSCC皮下移植瘤模型；待成瘤后，每2 d使用標尺測量腫瘤體積，腫瘤體積(V)=0.5×瘤體長(L)×瘤體寬(W)2；監(jiān)測14 d后處死裸鼠，剝離瘤體，測量瘤體體積并稱重。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?根據(jù)靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫miRwalk預(yù)測的可能結(jié)合位點構(gòu)建ALDH6A1結(jié)合位點的野生型(WT)和突變型(MUT)3’UTR序列的熒光素酶報告基因載體pmiR-ALDH6A1-WT或pmiR-ALDH6A1-MUT。將上述構(gòu)建的質(zhì)粒載體和miR-663b或miR-NC共轉(zhuǎn)染至HSC-3細胞，培養(yǎng)48 h后，測定熒光素酶活性變化。

1.2.5 CCK-8檢測細胞增殖 轉(zhuǎn)染48 h后，將HSC-3、CAL-27細胞消化后以1 000 r/min離心5 min、PBS沖洗，使用DMEM培養(yǎng)基配成單細胞懸液后，以6 000個/孔的密度接種于96孔板，放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h后加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后測定450 nm處吸光度(OD)值。

1.2.6 細胞活性氧(ROS)檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，將HSC-3、CAL-27細胞以4×105/mL的密度接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，使用PBS更換細胞培養(yǎng)液，然后將細胞與10 μmol/L DCF-DA于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)20 min。使用Dynatech MR5000 plate reader分析每孔在488 nm處的吸光度。

1.2.7 細胞NADPH/NADP+檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，將HSC-3、CAL-27細胞以4×105/mL的密度接種于6孔板，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按照NADPH/NADP+比值檢測試劑盒說明書步驟檢測細胞中NADPH/NADP+比值。

1.2.8 克隆形成實驗 轉(zhuǎn)染48 h后，將HSC-3、CAL-27細胞使用DMEM培養(yǎng)基配成單細胞懸液，以100個/孔的密度接種于6孔板，放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2 d換液，2周后終止培養(yǎng)。分別使用中性甲醇固定、結(jié)晶紫染色后拍照，于低倍顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)。

1.2.9 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)分析 收集各組細胞后，采用TRIzol試劑提取總RNA，測定其濃度和純度后，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PCR儀進行擴增，選擇U6為內(nèi)參，根據(jù)試劑盒說明書步驟檢測miR-663b水平，以2-ΔΔCt法計算miR-663b水平。引物序列由上海生工合成，見表1。

表1 引物序列

1.2.10 Western blot檢測蛋白表達 BCA法定量提取蛋白樣品后，取40 μg蛋白，在100 V電壓條件下經(jīng)SDS-PAGE電泳50 min，300 mA轉(zhuǎn)膜1 h至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，以β-actin為內(nèi)參，加入ALDH6A1一抗于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次；最后加二抗室溫下孵育2 h，ECL法顯色，Image J分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-663b在OSCC細胞中的表達及與臨床病理特征的關(guān)系

利用GEO數(shù)據(jù)庫OSCC組織芯片(GSE45238、GSE28100、GSE98463)獲取癌組織和正常對照樣本中的差異表達基因并取交集發(fā)現(xiàn)，miR-663b表達上調(diào)。通過進一步GSEA發(fā)現(xiàn)，miR-663b生物學(xué)功能與調(diào)節(jié)細胞增殖、氧化還原反應(yīng)及ROS相關(guān)，見圖1。

a：GEO數(shù)據(jù)庫3個數(shù)據(jù)集GSE45238、GSE28100、GSE98463分析所得表達下調(diào)基因韋恩圖；b～d：miR-663b生物學(xué)功能GSEA結(jié)果

2.2 上調(diào)miR-663b對OSCC細胞增殖的影響

與轉(zhuǎn)染miR-NC mimic比較，HSC-3、CAL-27細胞轉(zhuǎn)染miR-663b mimic后，miR-663b水平、NADPH/NADP+比值上調(diào)(P<0.05)，ROS水平降低(P<0.05)；上調(diào)miR-663b促進HSC-3、CAL-27細胞的體外增殖和克隆形成能力(P<0.05)，見圖2。

a：qRT-PCR檢測HSC-3、CAL-27細胞中miR-663b的表達；b：轉(zhuǎn)染后細胞中NADPH/NADP+比值；c：轉(zhuǎn)染后DCF-DA熒光探針檢測細胞中ROS水平；d、e：CCK-8檢測細胞增殖；f：平板克隆形成實驗(結(jié)晶紫染色×20) *：與miR-NC組比較，P<0.05

2.3 上調(diào)miR-663b對OSCC裸鼠皮下移植瘤生長的影響

與miR-NC組比較，裸鼠體內(nèi)注射穩(wěn)定過表達miR-663b的HSC-3細胞后，每2 d測量的腫瘤體積明顯增加P<0.05)，監(jiān)測14 d后剝離的瘤體體積和質(zhì)量均明顯增加(P<0.05)，移植瘤組織中miR-663b表達顯著上調(diào)(P<0.05)，提示上調(diào)miR-663b顯著促進裸鼠皮下移植瘤的生長，見圖3。

a：裸鼠皮下移植瘤體積變化；b、c：處死裸鼠后取出的腫瘤體積和質(zhì)量；d：qRT-PCR檢測移植瘤組織中miR-663b水平 *：與miR-NC組比較，P<0.05

2.4 miR-663b與ALDH6A1的靶向關(guān)系

GEO 2R分析GSE138206、GSE74530數(shù)據(jù)中，下調(diào)的基因以及miRwalk預(yù)測miR-663b的靶基因，三者取交集。其中ALDH3A2、ALDH6A1、CYP4B1、DIO2被發(fā)現(xiàn)與氧化還原密切相關(guān)，進一步對這4個基因進行GSEA分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALDH6A1與細胞增殖和氧化還原均相關(guān)，因此選擇ALDH6A1進一步研究。miRwalk提示ALDH6A1 mRNA的3’UTR區(qū)與miR-663b存在直接結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炋崾?，共轉(zhuǎn)染miR-663b和野生型ALDH6A1 3’UTR報告基因載體后，熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)。此外，轉(zhuǎn)染miR-663b能顯著下調(diào)HSC-3、CAL-27細胞的ALDH6A1 mRNA和蛋白表達(P<0.05)，見圖4。

a：GSE138206、GSE74530數(shù)據(jù)集中表達下調(diào)的基因與miRwalk預(yù)測靶基因的韋恩圖；b～d：GSEA分析TCGA_OSCC數(shù)據(jù)中ALDH6A1表達水平與氧化還原和細胞增殖的關(guān)系；e：miRwalk預(yù)測的miR-663b與ALDH6A1的3’UTR的結(jié)合位點；f：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-663b與ALDH6A1的靶向關(guān)系；g、h：qRT-PCR和Western blot分別檢測HSC-3、CAL-27細胞ALDH6A1 mRNA和蛋白表達 *：P<0.05；#：P<0.01

2.5 miR-663b靶向ALDH6A1調(diào)節(jié)ROS而抑制OSCC細胞增殖

與轉(zhuǎn)染miR-NC mimic比較，HSC-3、CAL-27細胞轉(zhuǎn)染miR-663b mimic顯著下調(diào)HSC-3、CAL-27細胞的ALDH6A1蛋白表達和ROS水平(P<0.05)，升高NADPH/NADP+比值(P<0.05)，并促進其體外增殖和克隆形成能力(P<0.05)；與轉(zhuǎn)染miR-663b mimic比較，HSC-3、CAL-27細胞共轉(zhuǎn)染miR-663b mimic和ALDH6A1過表達質(zhì)粒后，顯著上調(diào)了ALDH6A1蛋白表達和ROS水平(P<0.05)，降低NADPH/NADP+比值(P<0.05)，并抑制其體外增殖和克隆形成能力(P<0.05)，見圖5。

a：Western blot檢測ALDH6A1蛋白表達；b：轉(zhuǎn)染后細胞中NADPH/NADP+比值；c：轉(zhuǎn)染后DCF-DA熒光探針檢測細胞中ROS水平；d、e：CCK-8檢測細胞增殖；f：平板克隆形成實驗(結(jié)晶紫染色×20) *：與miR-NC組比較，P<0.05；#：與miR-663b組比較，P<0.05

3 討論

miRNA為內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，其能通過與靶RNA的3’UTR區(qū)互補配對干擾目標蛋白的合成從而達到調(diào)控靶基因的目的。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA水平異常與眾多腫瘤的生物學(xué)特征具有明顯關(guān)聯(lián)，在不同類型腫瘤中miRNA可以發(fā)揮致癌因子或抑癌因子作用[8-9]。miR-663b是一種保守的miRNA，其在結(jié)直腸癌[6]、骨肉瘤[7]中作為致癌因子發(fā)揮作用。然而，miR-663b在OSCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及機制尚不完全清楚。本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫的組織芯片數(shù)據(jù)分析顯示，相比正常對照組織，miR-663b在OSCC組織細胞中表達均顯著上調(diào)，而在功能實驗中，上調(diào)miR-663b表達可明顯促進OSCC細胞體外增殖和克隆形成能力，且在體內(nèi)促進了裸鼠皮下移植瘤的生長，提示miR-663b在OSCC中同樣發(fā)揮致癌因子的作用。

miRNAs通過靶向其下游目的基因發(fā)揮調(diào)控作用，準確確認miR-663b的下游功能靶點有助于闡明miR-663b促進OSCC細胞體內(nèi)、外增殖的詳細分子機制。本研究通過GSEA發(fā)現(xiàn)，miR-663b生物學(xué)功能與調(diào)節(jié)細胞增殖、氧化還原反應(yīng)及ROS相關(guān)。進一步經(jīng)miRNA-mRNA預(yù)測數(shù)據(jù)庫miRwalk與雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C，ALDH6A1 mRNA的3’UTR區(qū)被證實與miR-663b存在靶向結(jié)合位點，且在OSCC細胞中上調(diào)miR-663b水平能有效抑制ALDH6A1蛋白表達。ALDH6A1為醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)家族成員之一，ALDH家族成員可利用NAD或NADP作為輔酶將醛氧化成相應(yīng)的羧酸NADH或NADPH，參與腫瘤的代謝通路[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，ALDH同工酶變異與肝細胞癌密切相關(guān)，ALDH6A1被鑒定為肝癌預(yù)后的預(yù)測因子[11]。此外，Lu等[12]研究指出，過表達ALDH6A1抑制腎透明細胞癌細胞增殖，并通過生物信息學(xué)分析認為ALDH6A1與腫瘤代謝有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ALDH6A1的表達與OSCC進展呈負相關(guān)，與Lu等[12]研究中ALDH6A1發(fā)揮抑癌作用的結(jié)果相符合。

細胞增殖及凋亡異常是腫瘤不受限生長的重要基礎(chǔ)[13]。NADH的增加是腫瘤細胞代謝重構(gòu)的顯著特征，而過表達ALDH6A1會損害腫瘤細胞代謝。既往研究顯示，ALDH水平增加會誘導(dǎo)NADPH/NADP+比值降低，從而破壞線粒體膜電位，而線粒體膜電位的破壞會導(dǎo)致ROS水平升高[14]。在OSCC中，ROS作為應(yīng)激和呼吸的副產(chǎn)物，其水平下降可能是導(dǎo)致宿主氧化還原狀態(tài)失衡的重要原因[15]。此外，在腫瘤進展過程中，ROS在腫瘤細胞生長方面發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)癌細胞中ROS水平可能是癌癥治療的潛在策略[16]。本研究中，上調(diào)ALDH6A1表達可顯著下調(diào)NADPH/NADP+比值，上調(diào)ROS水平，OSCC細胞的體外增殖被顯著抑制，這與Shin等[11]研究中ALDH6A1所表現(xiàn)的功能相一致，且與本研究中miR-663b在OSCC細胞增殖中的調(diào)控作用完全相反。以上數(shù)據(jù)表明，miR-663b對OSCC細胞增殖的調(diào)節(jié)作用是通過靶向抑制ALDH6A1表達進而調(diào)節(jié)ROS水平而實現(xiàn)的。

綜上所述，miR-663b在OSCC細胞中表達上調(diào)，并可通過靶向抑制ALDH6A1表達調(diào)節(jié)ROS水平，進而促進OSCC細胞增殖發(fā)揮致癌基因作用。miR-663b可能是OSCC的潛在治療靶點。