朱江，王占偉，龍悅，于慶生

中國(guó)人群慢性HBV感染的總體感染率為6.1%，約占全世界HBV病例的1/3[1]。HBV感染導(dǎo)致的代償性肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌，導(dǎo)致每人約90萬例死亡年[2-3]。HBV感染急性加重的情況并不罕見，每年的累積發(fā)病率為10～30%[4]。慢加急性肝功能衰竭(ACLF)是終末期肝病的常見模式，慢性乙型肝炎感染患者經(jīng)常發(fā)生這種疾病，隨著疾病的快速發(fā)展，造成很大的疾病負(fù)擔(dān)。由于治療選擇有限，結(jié)果通常較差。在ACLF患者中使用肝移植，但是此過程成本高昂，成功率也各不相同。早期干預(yù)可以提高生存率，這增加了對(duì)早期診斷和預(yù)后標(biāo)志物的新需求。促炎蛋白半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspase)-1是裂解IL-1β和IL-18的前體，產(chǎn)生相應(yīng)的成熟細(xì)胞因子并引起細(xì)胞凋亡，并向細(xì)胞外部釋放胞質(zhì)內(nèi)容物，從而引起炎癥[5]。因此，caspase-1是驅(qū)動(dòng)宿主對(duì)感染，損傷和疾病反應(yīng)的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)。Caspase-1在體內(nèi)或體外各種肝病的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用，不僅作為炎癥介質(zhì)，而且作為肝細(xì)胞凋亡介質(zhì)[6]。caspase-1的激活與Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和TNF-α誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷密切相關(guān)，而caspase-1活性的抑制基本上抑制了Fas誘導(dǎo)的死亡[7]。研究表明IL-18也可以通過caspase-1非依賴性途徑從FasL刺激的巨噬細(xì)胞中分泌，并導(dǎo)致小鼠急性肝損傷[8]。本研究擬探討Caspase-1在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血漿中的表達(dá)水平及其預(yù)后意義，為ACLF的早期診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017年1月至2019年11月，本院收治HBV-ACLF患者130例為病例組，HBV-ACLF的診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)《慢性乙型肝炎防治指南(2015版)》，根據(jù)該指南將130例HBV-ACLF患者分為分為HBV-ACLF早期組52例、HBV-ACLF中期組44例、HBV-ACLF晚期組34例；根據(jù)預(yù)后情況分為生存組101例、死亡組29例。同期選擇本院健康體檢人群130例為對(duì)照組。該研究得到本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得每位患者的書面知情同意。

病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[9]；②患者均為乙型肝炎表面抗原陽性(HBsAg)持續(xù)6個(gè)月；③HBV DNA載量升高且肝功能異常。

病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎；②肝細(xì)胞癌，酒精性肝病，代償性肝硬化；③藥物性肝損傷。

1.2 方法

1.2.1 各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定

病例組及對(duì)照組清晨空腹及肱靜脈抽血，分離血清，貝克曼AU-680全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)庫爾特公司)以及CA-7000全自動(dòng)凝血分析儀(希森美康)測(cè)定白蛋白(Albumin，ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)、HBV-DNA、總膽紅素(total bilirubin，TBil)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(Triglyceride，TG)、凝血酶原時(shí)間(Prothrombin time，PT)、凝血酶原活動(dòng)度(prothrombin activityprothrombin time activity，PTA)；終末期肝病模型(Model for end-stage liver disease，MELD)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)HBV-ACLF患者疾病嚴(yán)重程度。

使用TRIzol試劑從血漿中分離總RNA，然后使用Prime Script First Strand cDNA Synthesis Kit將總共1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由上海生工科技合成，序列見表1，反應(yīng)體系見表2。定量PCR儀器檢查caspase-1水平(SLAN-96P，上海宏石全自動(dòng)熒光定量PCR儀)，反應(yīng)條件是50 ℃ 2分鐘，95 ℃ 5分鐘，然后95 ℃ 15秒，和60 ℃ 30秒，40個(gè)循環(huán)，然后是55 ℃下41個(gè)循環(huán)4秒。用2-ΔΔCt方法以GAPDH基因?yàn)閷?duì)照計(jì)算mRNA水平。

表1 GAPDH、caspase-1引物序列

表2 RT-PCR反應(yīng)體系

1.2.2 隨訪

研究對(duì)象入組時(shí)均無肝硬化、腹水、肝腎綜合癥、上消化道出血、糖尿病、肝性腦病、電解質(zhì)紊亂發(fā)生。每位研究對(duì)象的隨訪起始日期為確診為HBV-ACLF后第1天，隨訪截止日期為確診為HBV-ACLF后第365天；本研究的結(jié)束時(shí)間為截止日期為2020年12月31日。隨訪內(nèi)容為：肝硬化[9]、肝腎綜合癥[9]、上消化道出血[9]、糖尿病[10]、肝性腦病[9]、電解質(zhì)紊亂、死亡的發(fā)生情況；若有上述事件發(fā)生即為發(fā)生不良預(yù)后結(jié)局。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組、病例組一般臨床資料比較

表3可見，與對(duì)照組比較，病例組ALT、AST、HBV-DNA、TBIL、PT、TC、TG水平升高，PTA、ALB、MELD水平降低(P<0.05)；而兩組性別、年齡、病等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 對(duì)照組、病例組一般臨床資料情況比較

2.2 不同組別Caspase-1表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，病例組Caspase-1表達(dá)升高(P<0.05)；生存組比較，死亡組HBV-ACLF患者Caspase-1表達(dá)升高(P<0.05)；與早期組比較，中期組、晚期組HBV-ACLF患者Caspase-1表達(dá)升高，隨著HBV-ACLF患者病情嚴(yán)重程度的增加，HBV-ACLF患者Caspase-1表達(dá)逐漸升高(P<0.05)(表4)。

表4 不同組別Caspase-1表達(dá)水平比較

2.3 Caspase-1與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

Caspase-1與AST、ALT、TBIL、HBV-DNA、PT、MELD、TC、TG、PTA正相關(guān)，與PTA、ALB、MELD負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

2.4 不同Caspase-1水平HBV-ACLF患者比較

表5可見，當(dāng)血漿Caspase-1水平≥9.58(均數(shù))時(shí)，HBV-ACLF患者肝硬化、肝腎綜合癥、上消化道出血、糖尿病、肝性腦病、電解質(zhì)紊亂、死亡發(fā)生率高于血漿Caspase-1<9.58的HBV-ACLF患者(P<0.05)。

表5 不同Caspase-1水平HBV-ACLF患者不良預(yù)后結(jié)局比較 [n(%)]

2.5 HBV-ACLF患者救治結(jié)局單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，當(dāng)年齡≥46歲、ALB<22.34 g/L、ALT≥380.82 U/L、AST≥447.74 U/L、HBV-DNA≥7.79 copies/mL、MELD≥27.36分、Caspase-1≥2.48時(shí)， HBV-ACLF患者不良救治結(jié)局比例更高(P<0.05)(表6)。

表6 不同特征HBV-ACLF患者救治結(jié)局比較 [n(%)]

2.6 HBV-ACLF患者救治結(jié)局多因素Cox回歸分析

表7可見，以HBV-ACLF患者是否死亡為應(yīng)變量(是=1，否=0)，單因素分析有意義因素為自變量進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高水平Caspase-1、HBV-DNA、MELD均為HBV-ACLF患者死亡的危險(xiǎn)因素(HR=2.484、1.947、2.086，P<0.05)。

表7 HBV-ACLF患者發(fā)生不良預(yù)后結(jié)局事件Cox回歸分析

3 討論

Caspase-1與許多疾病狀況相關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病、精神病、癌癥、哮喘甚至傷口愈合。Caspase-1是一種多功能蛋白，可以與細(xì)胞膜上的鈣黏著蛋白結(jié)合以調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附或可以轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，在該細(xì)胞中它起轉(zhuǎn)錄共激活因子的作用并調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)基因。在肝病中，已確定Caspase-1的激活是肝癌進(jìn)展的主要因素。先前的研究已經(jīng)證明，HBV X(HBx)蛋白和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)可以作為致病因子，參與Caspase-1的調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)，從而促進(jìn)HBV誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，病例組Caspase-1表達(dá)水平升高；與生存組比較，死亡組Caspase-1表達(dá)水平升高；與早期組比較，中期組、晚期組Caspase-1表達(dá)水平升高，隨著HBV-ACLF患者病情嚴(yán)重程度的增加，Caspase-1表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05)。這說明，HBV-ACLF患者血漿Caspase-1表達(dá)水平升高，且與疾病嚴(yán)重程度有相關(guān)性。

先前的研究報(bào)道，從急性和慢性肝炎、乙肝相關(guān)肝硬化、ACLF、肝細(xì)胞癌，肝損傷的嚴(yán)重程度逐漸升高。從急性和慢性肝炎、乙肝相關(guān)肝硬化、ACLF、肝細(xì)胞癌，血清Caspase-1水平也逐漸升高，并且在乙肝相關(guān)肝硬化、ACLF、肝細(xì)胞癌期，Caspase-1與ALT或AST呈正相關(guān)[11]。我們推測(cè)，血清Caspase-1升高與CHB、ACLF、和HBLC期肝細(xì)胞壞死有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，Caspase-1與AST、ALT、TBIL、HBV-DNA、PT、MELD、TC、TG、 ALB、PTA相關(guān)(P<0.05)。這與上述研究一致。在瞬時(shí)HBV感染細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)了較高的細(xì)胞內(nèi)Caspase-1水平，但其在細(xì)胞外上清液中的水平并未改變，這與其在臨床樣品中的分布不一致。通常，HBV對(duì)感染的肝細(xì)胞無致病性，但在HBV感染期間造成肝損害的罪魁禍?zhǔn)字饕菍?duì)病毒感染的肝細(xì)胞的適應(yīng)性免疫攻擊[12]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，通過LDH釋放測(cè)定和FACS在短暫的體外HBV感染細(xì)胞模型中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡，因?yàn)樵摷?xì)胞模型只是一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)，并且缺乏HBV誘導(dǎo)的免疫攻擊[13]。因此，體外HBV感染細(xì)胞模型中完整的細(xì)胞膜可能不利于Caspase-1釋放到細(xì)胞外空間。這也間接說明，細(xì)胞外高水平的Caspase-1對(duì)肝細(xì)胞有損壞作用。

預(yù)后分析顯示，當(dāng)血漿Caspase-1水平≥9.58時(shí)，HBV-ACLF患者肝硬化、肝腎綜合癥、上消化道出血、糖尿病、肝性腦病、電解質(zhì)紊亂、死亡發(fā)生率明顯升高(P<0.05)；高水平Caspase-1、HBV-DNA、MELD均為HBV-ACLF患者死亡的危險(xiǎn)因素。這提示，高水平血漿Caspase-1是HBV-ACLF患者預(yù)后不良的威脅因素。近期研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-1是自然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可以用作抗感染治療各種炎性疾病的治療靶標(biāo)[14]。HBV感染可發(fā)展為無癥狀攜帶者狀態(tài)或發(fā)展為 ACLF，并且Caspase-1在HBV相關(guān)肝病的不同階段起著復(fù)雜的作用[15-18]。Caspase-1誘導(dǎo)包括IL-1β和IL-18在內(nèi)的促炎性細(xì)胞因子成熟，從而參與先天性免疫反應(yīng)和肝組織動(dòng)態(tài)平衡。HBeAg抑制Caspase-1的活化和促炎細(xì)胞因子如IL-18的產(chǎn)生，從而抑制機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)慢性HBV感染狀態(tài)[19]。肝纖維化也可由Caspase-1直接或間接調(diào)節(jié)，直接調(diào)節(jié)方式主要通過Caspase-1在肝星狀細(xì)胞(HSCs)中的表達(dá)來促進(jìn)肝纖維化，而誘導(dǎo)IL-1β和IL-18調(diào)節(jié)肝纖維化的間接途徑[20-21]。對(duì)于肝癌，Caspase-1在肝癌組織中顯著上調(diào)，并且Caspase-1的水平越高，癌癥進(jìn)展越快。對(duì)于肝癌的預(yù)后，研究表明，caspase-1的高表達(dá)與肝癌切除后患者的生存呈負(fù)相關(guān)。這與本研究中的預(yù)后結(jié)果一致。

綜上所述，HBV-ACLF患者血漿Caspase-1表達(dá)水平升高，且與疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后有一定相關(guān)性。