劉蕓娜 尚信池 張培軍 盧玉婷 劉佳 汪惠慶 閆子豪 李月紅

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 教育部動物產(chǎn)品與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130118； 2 吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢測中心，吉林長春 130000)

魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，隸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、耶爾森菌屬(Yersinia)，可以引起淡水魚和海水魚的耶爾森氏菌病。腸道紅口病(enteric red mouth，ERM)也稱為耶爾森氏菌敗血癥，患腸道紅口病的魚體表癥狀多數(shù)為腹部、下頜及嘴周出現(xiàn)大量出血點(diǎn)，肛門腺發(fā)炎、紅腫，剖檢呈大量腹水，肝臟壞死，腸道嚴(yán)重脹氣，腸壁薄而脆等。該病最早于20世紀(jì)50年代在美國發(fā)現(xiàn)，是一種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類尤其是鮭鱒魚類易感、嚴(yán)重危害漁業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的細(xì)菌性疾病[1-3]。魯氏耶爾森氏菌主要引起冷水性鮭鱒魚類發(fā)病，但近年來在我國相繼發(fā)現(xiàn)該病原體也可感染鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)等鯉科魚類[3-5]，而且最常見的是由血清型為01的病原體菌株引起的[6-7]。耶爾森氏菌病現(xiàn)在已經(jīng)廣布全球，這可能是因?yàn)樵谌蚧l(fā)展過程中，被感染動物的運(yùn)輸導(dǎo)致了疾病的傳播[8]。該病在我國北方很少發(fā)生，目前尚未見鰱、鳙大面積暴發(fā)該病的報道。但就全國來看，該病在地理分布上還是呈擴(kuò)增趨勢的。

為了進(jìn)一步闡明病原體的分類狀況，本試驗(yàn)從吉林省某養(yǎng)殖基地患病鳙魚的血液、器官和傷口中分離出細(xì)菌分離株，通過VITEK?MS全自動分析系統(tǒng)和16S rRNA基因的測序分析，鑒定并確認(rèn)了該菌，同時進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析和體外藥物敏感性測試。此外，還提供了有關(guān)受影響鳙魚的臨床病變以及腸道組織病理學(xué)的觀察結(jié)果。本研究旨在為水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病預(yù)防提供合理的技術(shù)指導(dǎo)，促進(jìn)淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)病鳙魚取自吉林省某養(yǎng)殖基地，體質(zhì)量為2 kg。健康鳙魚購自常盛魚苗孵化場，體質(zhì)量為20～30 g。

主要試劑：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(LB)、革蘭氏染色試劑盒購自上海銘睿生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Taq酶等購自TaKaRa公司。

主要儀器：法國梅里埃公司的VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)(進(jìn)行鑒定)，VITEK?MS全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，透射電子顯微鏡，YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱，SW-CJ-2FD型超凈工作臺，TG-16WS臺式高速離心機(jī)，Life Pro梯度PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 菌株的分離

無菌條件下，分別取病魚的腐爛肌肉和血液，加入無菌的生理鹽水制成勻漿，將勻漿稀釋至合適的稀釋度，取其中3個最適稀釋度的稀釋液200 μL并涂布于LB培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌群進(jìn)行純化培養(yǎng)，挑取單菌落，用體積分?jǐn)?shù)為80%的甘油對其進(jìn)行菌種的保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 革蘭氏染色觀察

取無菌潔凈載玻片，將分離的菌株轉(zhuǎn)移到載玻片上，用酒精燈干燥，使其固定，經(jīng)結(jié)晶紫染液初染，碘液媒染，酒精脫色，番紅染液復(fù)染后即可通過鏡檢觀察染色結(jié)果。

1.3.2 透射電子顯微鏡觀察

將細(xì)菌培養(yǎng)液以3 000 r/min離心10 min后進(jìn)行負(fù)染色電子顯微鏡檢查。使用1 mL注射器(取下針頭)提取0.1～0.2 mL細(xì)菌懸液，小心滴在銅網(wǎng)上，再用一塊無菌濾紙吸收銅網(wǎng)邊緣的殘留液體，然后靜置2 min(此時未完全干燥)。用1 mL注射器(取下針頭)將0.1～0.2 mL的染色液滴到帶有細(xì)胞的銅網(wǎng)上，靜置1～2 min，然后使用一小塊濾紙吸收銅網(wǎng)邊緣的染料溶液，自然干燥，5 min后用電子顯微鏡觀察。

1.3.3 生理生化鑒定

采用法國梅里埃公司的VITEK?MS全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進(jìn)行生理生化鑒定，鑒定板為革蘭氏陰性菌鑒定板，試驗(yàn)結(jié)束后觀察及分析結(jié)果。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用LB液體培養(yǎng)基沖洗收集純化的菌株，提交至庫美生物工程股份有限公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增和16S rRNA測定。16S rRNA基因的擴(kuò)增引物為27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’)和1492R(5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3’)，將菌株的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行比對，從中選取10株與該菌株基因序列最相似的菌株和5種水產(chǎn)常見病原菌，采用ClustalW軟件進(jìn)行多序列匹配分析，用MEGA 6.0軟件包中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過1 000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度[9]，并將PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)[10]。

1.4 回歸感染試驗(yàn)

取上述已鑒定的菌液500 μL，使用10 mL LB培養(yǎng)液(28 ℃，120 r/min)過夜培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)好的菌液離心后棄掉上清液，用生理鹽水分別稀釋至2.84×108、2.84×107、2.84×106、2.84×105cfu/mL，隨后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。將健康鳙魚分為5組，每組10尾魚，其中4個處理組(編號1～4)魚體分別使用上述4個濃度腹腔注射0.2 mL的魯氏耶爾森氏菌(JL9510)分離物，對照組則腹腔注射0.2 mL的生理鹽水。在攻毒試驗(yàn)的7 d里，試驗(yàn)魚均分別飼養(yǎng)在密閉的養(yǎng)殖箱中，水溫保持在18～20 ℃。所有魚按體質(zhì)量的1%投飼，隔天換水一次，清除糞便、殘飼等污物。試驗(yàn)期間，每天記錄試驗(yàn)魚的臨床體征，及時取出死魚，對死亡的標(biāo)本進(jìn)行微生物學(xué)分析，以確定由魯氏耶爾森菌引起的死亡率。

1.5 病理損傷研究

取發(fā)病鳙魚和健康鳙魚的腸道分別固定于4%的中性福爾馬林溶液中，采用蘇木精-伊紅染色法進(jìn)行組織病理學(xué)研究。

1.6 藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片的方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。使用LB培養(yǎng)液(28 ℃，過夜，120 r/min)培養(yǎng)細(xì)菌，在超凈工作臺上吸取200 μL菌液涂布于LB板，取藥敏紙片貼于該板上。將平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃下培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，判斷該菌株對氟苯尼考和環(huán)丙沙星兩種抗生素的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

發(fā)病鳙魚精神沉郁，游動遲緩，漂浮于水面，體表出現(xiàn)大量出血點(diǎn)及壞死灶(見圖1)。胸鰭基部及尾鰭基部肌肉出血明顯，口部出血明顯，頭部潰爛，肉眼可見骨條。肝臟腫大(見圖2)，背部腐爛嚴(yán)重(見圖1-d)。腸道嚴(yán)重充氣，腸壁組織炎癥明顯，呈半透明狀(圖2-b)。顯微鏡下檢查血液、黏液及潰瘍灶組織，未見寄生蟲和真菌。

2.2 病原菌的分離

從自然發(fā)病鳙魚的血液、肝、腎及體表潰爛處均分離到了1株優(yōu)勢菌株，編號為JL9510。在28 ℃下培養(yǎng)12 h后，可見菌株在LB平板上形成直徑約為1 mm的半透明菌落(見圖3)。鏡檢觀察，菌體呈短桿狀，革蘭氏染色后鏡檢結(jié)果見圖4，電鏡下檢查病魚血液中的細(xì)菌見圖5。經(jīng)VITEK?MS全自動快速微生物質(zhì)譜檢測，結(jié)果為魯氏耶爾森氏菌，置信度為99.9。

圖3 LB培養(yǎng)基上的白色透明菌落

圖4 革蘭氏染色顯微鏡下觀察分離純化的細(xì)菌結(jié)果(油鏡×20)

圖5 負(fù)染色電子顯微鏡檢查從患病鳙魚血液中發(fā)現(xiàn)的桿狀細(xì)菌(比例尺=2 μm)

2.3 回歸感染試驗(yàn)

回歸感染試驗(yàn)中，處理組4從試驗(yàn)第1天開始即有試驗(yàn)魚發(fā)病死亡，處理組2、3從第2天，處理組1從第3天開始有試驗(yàn)魚發(fā)病死亡，對照組則未出現(xiàn)死亡情況(見圖6)。經(jīng)寇氏法計算分析，LD50=8.99×106cfu/mL。病檢結(jié)果顯示，回歸感染發(fā)病魚的癥狀與自然發(fā)病魚的一致(見圖7)。在回歸感染發(fā)病鳙魚的肝臟和腸道處分離到與菌株JL9510表面形態(tài)一致的菌株，因此推斷該菌對鳙魚具有致病性。

圖6 回歸感染試驗(yàn)鳙魚的成活率

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)16S rRNA基因擴(kuò)增，得到1 406 bp的PCR產(chǎn)物，將庫美生物工程股份有限公司測序的結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對分析，用Mega 6.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。16S rRNA測序結(jié)果顯示，菌株JL9510與已知菌株JQ657818.1Yersiniaruckeri序列相似性達(dá)到99.98%，同源關(guān)系最近。通過系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，JL9510與菌株JQ657818.1Yersiniaruckeri聚為一支(見圖8～9)。

2.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)判定參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會的VET01-A4標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。通過試驗(yàn)測量抑菌直徑，發(fā)現(xiàn)菌株JL9510對氟苯尼考敏感，對環(huán)丙沙星耐藥(見表1)。

表1 魯氏耶爾森氏菌JL9510的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 腸道組織學(xué)觀察

通過組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，感染組鳙魚腸組織損傷明顯，腸腔中可見壞死脫落的腸道組織，黏膜層結(jié)構(gòu)大面積缺失，僅局部可見殘余的腸絨毛，黏膜下層水腫(見圖10)。

圖10 對照組和感染組鳙魚的腸組織切片

3 討論和分析

耶爾森氏菌是腸道紅口病(enteric red mouth，ERM)的病原體，該病幾乎波及所有的鮭鱒魚類，給鮭魚養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的影響。20世紀(jì)50年代，研究人員最初在愛達(dá)荷州哈格曼河谷(美國)的患病鱒魚中分離到了致病性耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)[11]。此次我國北方暴發(fā)的魯氏耶爾森氏菌病也導(dǎo)致大量鳙魚死亡，給養(yǎng)殖場帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。通過先進(jìn)的技術(shù)手段，魯氏耶爾森氏菌的致病機(jī)理已被闡明，溫度是涉及毒力基因調(diào)節(jié)的主要因素之一，毒力基因在溫度變化時被高度誘導(dǎo)。在其他因素保持不變的情況下，溫度16 ℃比12 ℃試驗(yàn)條件下魯氏耶爾森氏菌引起的鮭魚死亡率更高[12]。在本研究中，菌株JL9510可以在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中生長。

本試驗(yàn)通過多種鑒定手段，確定了患病鳙魚血液中的魯氏耶爾森氏菌。資料顯示，之前也有魯氏耶爾森氏菌引起水產(chǎn)動物感染發(fā)病的報道。本試驗(yàn)中，患病鳙魚有腸道充氣、腹腔嚴(yán)重積水等臨床癥狀；藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌對氟苯尼考敏感，這與方蘋等[4]的研究結(jié)果相似。病魚口腔充血、腸道充氣、腸壁充血和腹腔積水等現(xiàn)象，與已報道的魯氏耶爾森氏菌病相似[13]。目前尚無使用疫苗控制該疾病的可能性，但藥敏試驗(yàn)進(jìn)一步表明，與使用其他常規(guī)藥物相比，使用氟苯尼考可能會降低重新感染的機(jī)會[14-16]。為避免濫用藥物，在治療魚類細(xì)菌性疾病時，應(yīng)根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感的抗生素。本試驗(yàn)結(jié)果可用于對感染耶爾森氏菌的鳙魚進(jìn)行有效處理，為養(yǎng)殖安全用藥提供參考。

本試驗(yàn)中，被耶爾森氏菌感染的鳙魚主要表現(xiàn)出器官壞死、變性、出血和敗血癥。對其腸道進(jìn)行組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)致病菌嚴(yán)重破壞小腸絨毛，使腸壁變薄，影響腸道健康，這與其他宿主因耶爾森氏菌引起的臨床癥狀不同。耶爾森氏菌的地理分布和寄主范圍已顯著擴(kuò)大，目前影響幾乎所有養(yǎng)殖鮭魚。除北美外，在歐洲國家也發(fā)現(xiàn)了該病，鮭魚發(fā)病后死亡率一般為30%～40%[17]。在我國，鳙魚受到人們的普遍青睞，尤其近年來市場多樣化的需求使得鳙魚養(yǎng)殖量逐年增加，而耶爾森氏菌也能感染鳙魚，因此應(yīng)給予足夠的重視。在鳙魚育種過程中，應(yīng)加強(qiáng)對病原體的監(jiān)測，從養(yǎng)殖管理、水質(zhì)監(jiān)測等方面加強(qiáng)預(yù)防[18-19]，及時采取有效的防控措施并適當(dāng)使用藥物，避免魚體感染的進(jìn)一步擴(kuò)大。