李艷霞,高 華,李沛珊,陳思宇,朱正權(quán),楊新玲*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，烏魯木齊 830063；2新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科；4新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科；*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

帕金森病(Parkinson’s diseases，PD)是目前僅次于阿爾茲海默病的一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，在我國65歲以上人群的患病率為1 700/10萬，并隨年齡增長而升高，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)[2]。該病是年齡老化、遺傳缺陷和環(huán)境毒素相互作用的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，也無根本的防治措施[3]。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡已被證明與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括帕金森病[4]。帕金森病的主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性丟失、細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白等蛋白積聚和路易小體形成，蛋白積聚可誘發(fā)氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并介導(dǎo)多種信號途徑參與多巴胺(dopamine，DA)神經(jīng)元變性[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致了紋狀體DA神經(jīng)元的大量損失和基底神經(jīng)節(jié)的運(yùn)動控制功能障礙[6]。

康復(fù)與運(yùn)動療法對帕金森病運(yùn)動和非運(yùn)動癥狀改善乃至對延緩病程的進(jìn)展可能都有一定的幫助，特別是帕金森病患者多存在步態(tài)障礙、姿勢平衡障礙、語言和(或)吞咽障礙等軸性癥狀，可以從康復(fù)和運(yùn)動療法中獲益[7]。研究表明，有氧運(yùn)動可激活骨骼肌中的中央轉(zhuǎn)錄輔激活因子(PGC-1α)，使纖維連接蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域蛋白5(FNDC5)基因的表達(dá)上調(diào)[8]，骨骼肌釋放的全身因子FNDC5及其分泌形式鳶尾素(Irisin)增多，而FNDC5/Irisin可以通過血腦屏障，在神經(jīng)元分化和成熟過程中發(fā)揮積極的調(diào)節(jié)作用。

本實(shí)驗(yàn)主要探討技巧性有氧訓(xùn)練(skilled aerobic exercise,SAE)能否通過上調(diào)FNDC5表達(dá)，調(diào)節(jié)PD大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，減少多巴胺神經(jīng)元的凋亡，改善PD大鼠的運(yùn)動功能，本研究以PD大鼠模型為研究對象，采用技巧性有氧訓(xùn)練對PD大鼠進(jìn)行干預(yù)，評估PD大鼠的運(yùn)動功能、大鼠骨骼肌FNDC5的表達(dá)水平、血清Irisin含量、中腦組織酪氨酸羥化酶的表達(dá)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)情況，旨在了解運(yùn)動訓(xùn)練能否通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減少多巴胺神經(jīng)元的凋亡，從而改善PD大鼠的運(yùn)動功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

L-抗壞血酸(Sigma公司，美國)、免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋)、DAB顯色試劑盒(福州邁新生物)、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(武漢博士德生物)、6-OHDA(大連美侖生物)、阿撲嗎啡(Sigma公司，美國)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(北京全式金生物)、兔抗鼠GAPDH、Bip/Grp78、TH、CHOP、FNDC5、Irisin ELISA試劑盒(北京博奧森生物)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、假手術(shù)組+技巧運(yùn)動組、模型組+技巧運(yùn)動組，每組15只。

將30只大鼠使用水合氯醛將大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，然后將大鼠固定于大鼠立體定位儀上，剃除大鼠頭部毛發(fā)，用手術(shù)刀切開皮膚露出顱骨，選擇右側(cè)兩點(diǎn)：①黑紙致密部(SNC)，坐標(biāo)為前鹵后平均(5.3±0.1)mm，矢狀縫右側(cè)平均(1.5±0.1)mm，硬膜下平均(7.9±0.1)mm；②腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)，坐標(biāo)為前鹵后平均(4.8±0.1)mm，中線右側(cè)平均(0.9±0.1)mm，硬膜下平均(7.4±0.1)mm，用微量注射器吸取10 μl的6羥基多巴胺(6-hydroxydopa mine，6-OHDA)(使用含有1%抗壞血酸的生理鹽水溶解，濃度為2 μg/μl)，針頭垂直入顱，緩慢進(jìn)針，按上述兩點(diǎn)以1 μl/min的速度推注6-OHDA各5 μl，針頭停留1 min，防止回流，然后緩慢退針。針孔按壓止血后縫合頭皮，碘伏消毒。術(shù)后腹腔注射50 000 U的青霉素以預(yù)防感染。造模后隨機(jī)將其中15只分為模型組進(jìn)行28 d隨意運(yùn)動，15只分為模型+技巧運(yùn)動組進(jìn)行為期28 d的技巧性有氧訓(xùn)練。

將30只大鼠進(jìn)行麻醉、固定、坐標(biāo)定位，方法同模型組，用微量注射器注射含有1%抗壞血酸的生理鹽水10 μl(每點(diǎn)各注射5 μl)。造模后隨機(jī)將其中15只分為假手術(shù)組進(jìn)行28 d隨意運(yùn)動，15只分為假手術(shù)+技巧運(yùn)動組進(jìn)行為期28 d的技巧性有氧訓(xùn)練。

1.3 運(yùn)動訓(xùn)練

1.3.1 技巧性有氧訓(xùn)練 造模后第3天開始，假手術(shù)+技巧運(yùn)動組和模型組+技巧運(yùn)動組大鼠進(jìn)行技巧性有氧訓(xùn)練，輪徑34.4 cm，有不規(guī)則間距的梯級，梯級寬0.3 cm，通過OOOOXOX的模式(見圖1)，O表示有梯級，X表示缺失梯級(缺失間隔1.3 cm)。運(yùn)動訓(xùn)練為期28 d，每周連續(xù)5 d，間隔兩天不訓(xùn)練，20 min/d。開始訓(xùn)練時將大鼠放在規(guī)則的跑輪上(見圖2)，每次5 min，每日4次，間隔2 min。大鼠習(xí)慣了以2 m/min的起始速度訓(xùn)練，之后每天增加1 m/min或2 m/min，直至速度達(dá)到8 m/min。第14天開始將大鼠放置在不規(guī)則的跑輪上訓(xùn)練，仍以2 m/min的起始速度訓(xùn)練，逐漸提高轉(zhuǎn)輪速度，進(jìn)行適應(yīng)性挑戰(zhàn)訓(xùn)練，且不會造成大鼠的緊張狀態(tài)(監(jiān)測排便和排尿作為急性應(yīng)激反應(yīng)的跡象)。

圖1 不規(guī)則梯級跑輪Figure 1 Running wheel with irregular steps

圖2 規(guī)則梯級跑輪Figure 2 Running wheel with regular steps

1.3.2 隨意運(yùn)動 造模后第3天開始，將假手術(shù)組和模型組大鼠放在規(guī)則梯級的跑輪上跑步。運(yùn)動訓(xùn)練為期28 d，每周連續(xù)5 d，20 min/d。大鼠在跑輪上隨意運(yùn)動，不要求速度。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物的行為測試

1.4.1 圓柱體實(shí)驗(yàn) 假手術(shù)組、假手術(shù)+技巧運(yùn)動組、模型組和模型+技巧運(yùn)動組的大鼠分別于運(yùn)動第7，14，28天放置在一個透明的樹脂玻璃桶內(nèi)(直徑20 cm，高30 cm)。觀察并統(tǒng)計(jì)3 min內(nèi)大鼠左前肢與圓柱體的接觸次數(shù)，計(jì)算左前肢接觸圓柱體比率:

其中a為大鼠左前肢與圓柱體的接觸次數(shù)；b為雙側(cè)前肢與圓柱體交替接觸的次數(shù)；c為雙側(cè)前肢同時與圓柱體的接觸次數(shù)；d為右前肢與圓柱體的接觸次數(shù)。

1.4.2 APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn) 分別于運(yùn)動第7，14，28天給予大鼠腹腔注射0.05 mg/kg阿撲嗎啡，誘發(fā)大鼠向左側(cè)單項(xiàng)旋轉(zhuǎn)，記錄開始旋轉(zhuǎn)后30 min內(nèi)大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。

1.5 免疫組化檢測中腦黑質(zhì)部酪氨酸羥化酶(TH)表達(dá)

大鼠運(yùn)動28 d結(jié)束后，取中腦黑質(zhì)部組織經(jīng)固定、包埋、切片后，二甲苯浸泡脫蠟、水化、抗原修復(fù)，3%H2O2去離子水浸泡去除內(nèi)源性過氧化物酶，在稀釋的一抗(TH 1 ∶170)中在4 ℃冰箱中浸泡過夜，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫靜置孵育20 min。DAB顯色3～10 min，自來水終止顯色，蘇木精復(fù)染3 min，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍片。

1.6 Western blot法檢測中腦黑質(zhì)部Bip/Grp78、CHOP蛋白表達(dá)水平和大鼠左后肢股四頭肌組織中FNDC5表達(dá)水平

大鼠運(yùn)動28 d結(jié)束后，分別取各組大鼠的腦黑質(zhì)部組織和大鼠左后肢股四頭肌組織，每組3例樣本，樣本經(jīng)液氮研磨之后，取約100 mg樣本加入到預(yù)冷的1.5 ml離心管中，然后加入400 μl RIPA裂解液(RIPA ∶PMSF ∶廣譜磷酸酶抑制劑為100 ∶1 ∶1)，充分混勻，4 ℃放置60 min后，12 000 r/min，4 ℃，離心15 min收集上清。BCA法測定蛋白濃度。樣本加入適量5×SDS-PAGE loading buffer(含β-巰基乙醇)，100 ℃沸水加熱處理5 min，使蛋白充分變性后放入-80 ℃冰箱保存。按配方配制15%，12%，8%分離膠與5%濃縮膠。

加樣：預(yù)染蛋白marker 9 l，樣品每孔上樣蛋白50 g。電泳：80 V恒壓使溴酚藍(lán)至分離膠處，恒壓100 V，90 min，溴酚藍(lán)到達(dá)較底部時，停止電泳。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將PVDF膜在甲醇中浸泡10 s，蒸餾水中漂洗1 min，然后將聚丙烯酰胺凝膠、濾紙以及處理過的PVDF膜在Transfer Buffer中浸泡10 min，制備轉(zhuǎn)膜“三明治”，轉(zhuǎn)膜時采用恒壓轉(zhuǎn)膜，電壓100 V，Bip/Grp78、Actin使用0.45 μm PVDF膜，CHOP、FNDC5使用0.22 μm PVDF膜，CHOP、FNDC5、β-actin轉(zhuǎn)膜時間為60 min，Bip/Grp78轉(zhuǎn)膜時間為80 min。轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜水洗3次，5 min/次。

使用含5%脫脂奶粉的封閉液，封閉轉(zhuǎn)印膜1 h，然后TBST洗3次，5 min/次。加入用TBST稀釋一抗，β-actin(1 ∶1 000)、CHOP(1 ∶500)，Bip/Grp78(1 ∶500)、FNDC5(1 ∶500)。4 ℃搖床孵育過夜。1×TBST漂洗3次，5 min/次。加入適當(dāng)稀釋的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h。1×TBST漂洗3次，5 min/次。將DAB顯色液A液和B液混合，加2 ml至膜上，用ChemiScope mini化學(xué)發(fā)光儀檢測、拍照。使用Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 ELISA法檢測血清Irisin的含量

大鼠運(yùn)動28 d結(jié)束后，將大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后剪開腹壁，剝離出腹主動脈，每只大鼠抽取血液約3 ml至抗凝管中。放在冰上，盡快離心(5 000 r/min)10 min，吸出血清，嚴(yán)格按照Irisin ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。每組6只大鼠，每只3個復(fù)孔，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔。每孔加樣100 μl，在恒溫箱中37 ℃孵育90 min。加入生物素化抗體工作液，恒溫孵育1 h，充分洗板后每孔加入酶結(jié)合物工作液100 μl，恒溫孵育30 min。再加入90 μl底物溶液，繼續(xù)在恒溫箱內(nèi)避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μl，藍(lán)色迅速變?yōu)轭伾顪\不一的黃色。反應(yīng)終止后立即使用酶標(biāo)儀檢測在450 nm波長處各孔的吸光度值(OD值)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各指標(biāo)濃度。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 大鼠運(yùn)動行為的檢測

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠較假手術(shù)組左前肢接觸圓柱體的比率明顯下降(P<0.05)；經(jīng)28 d技巧性有氧訓(xùn)練，與模型組比較，模型組+技巧運(yùn)動組大鼠左前肢接觸圓柱體的比率明顯升高(P<0.05，見表1)。

表1 運(yùn)動訓(xùn)練7，14，28 d四組大鼠左前肢接觸圓柱體比率的比較

在大鼠的旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均明顯升高(P<0.05)；經(jīng)技巧性有氧訓(xùn)練14，28 d，與模型組比較，模型組+技巧運(yùn)動組大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯下降(P<0.05，見表2)。

表2 運(yùn)動訓(xùn)練7，14，28 d四組大鼠APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的比較圈)

2.2 技巧性有氧訓(xùn)練對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

運(yùn)動28 d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠中腦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Bip/Grp78、CHOP的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，模型+技巧運(yùn)動組大鼠中腦Bip/Grp78、CHOP的表達(dá)明顯下降(P<0.05，見圖3)。

與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05圖3 運(yùn)動28天四組Bip/Grp78和CHOP表達(dá)水平的比較Figure 3 Comparison of the expression level of Bip/Grp78 and CHOP after training for 28 d among four groups

2.3 技巧性有氧訓(xùn)練對骨骼肌的FNDC5蛋白和Irisin血清含量的影響

運(yùn)動28 d，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠骨骼肌的FNDC5蛋白表達(dá)和血清中Irisin的含量均明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，模型+技巧運(yùn)動組骨骼肌FNDC5蛋白表達(dá)和血清中Irisin的含量明顯升高(P<0.05，見表3和圖4)。

2.4 中腦TH蛋白免疫組化

與假手術(shù)組比較，假手術(shù)+技巧運(yùn)動組TH陽性的神經(jīng)元數(shù)量無明顯差異，模型組表達(dá)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量減少，TH蛋白的IHC評分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，模型+技巧運(yùn)動組表達(dá)TH陽性的神經(jīng)元數(shù)量增多，TH蛋白的IHC評分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5和表4)。

表3 運(yùn)動28 d四組血清Irisin含量的比較

與假手術(shù)組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05圖4 運(yùn)動28天四組大鼠骨骼肌FNDC5表達(dá)水平的比較Figure 4 Comparison of the expression of FNDC5 in rat skeleton muscle after training for 28 d among four groups

圖5 運(yùn)動28 d四組大鼠中腦TH的免疫組化染色結(jié)果比較Figure 5 Comparison of expression of TH in rat midbrain after training for 28 d by immunohistochemical staining among four groups

表4 運(yùn)動28 d四組大鼠中腦TH表達(dá)水平的比較

3 討論

目前，帕金森病的治療方法和手段包括藥物治療、手術(shù)治療、運(yùn)動療法、心理疏導(dǎo)及照料護(hù)理等[1]。藥物治療仍是PD的主要治療方法，而康復(fù)治療被認(rèn)為可以改善PD患者多種功能障礙，提高生活自理能力[9]。包括自行車或跑步等有氧訓(xùn)練和肌肉強(qiáng)化康復(fù)與運(yùn)動療法對帕金森病癥狀的改善乃至對延緩病程的進(jìn)展可能都有一定的幫助[10]。有積極的證據(jù)表明指導(dǎo)帕金森病患者進(jìn)行平衡和步態(tài)訓(xùn)練能有效減少跌倒[11]。運(yùn)動訓(xùn)練改善帕金森病患者的運(yùn)動功能及臨床癥狀，主要是通過改變基底神經(jīng)節(jié)的運(yùn)動環(huán)路和神經(jīng)可塑性[12-14]。

運(yùn)動方式和復(fù)雜性是帕金森病(PD)神經(jīng)康復(fù)預(yù)后的關(guān)鍵因素。運(yùn)動訓(xùn)練(exercise training,ET)包括運(yùn)動技能訓(xùn)練和有氧運(yùn)動，與簡單的非技巧性有氧運(yùn)動(non-skilled aerobic exercise, NSAE)相比，技巧性的有氧訓(xùn)練(skilled aerobic exercise，SAE)使動物能更好地恢復(fù)運(yùn)動缺陷，使前額皮質(zhì)前邊緣區(qū)、軀體感覺皮質(zhì)和小腦區(qū)的區(qū)域腦血流增加[15]。運(yùn)動訓(xùn)練(包括運(yùn)動技能訓(xùn)練和有氧運(yùn)動)被認(rèn)為可以協(xié)同改善PD患者運(yùn)動控制的隨意和不隨意部分。本實(shí)驗(yàn)研究顯示：SAE可使PD模型大鼠的患側(cè)前肢的運(yùn)動功能改善，且使APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少。

在本實(shí)驗(yàn)中SAE可增加PD大鼠骨骼肌中FNDC5的表達(dá)和血清中Irisin的含量。既往研究發(fā)現(xiàn)，通過Western blot和質(zhì)譜分析也發(fā)現(xiàn)人類腦脊液中Irisin的存在。在原始小鼠胚胎的成熟過程中，皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)或人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的過程中，F(xiàn)NDC5水平都有升高。在小鼠胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)前體形成過程中過表達(dá)FNDC5，使腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、GFAP和神經(jīng)元成熟的標(biāo)志物(Map2、β-tubulin Ⅲ和Neurocan)等增加[16]。通過過表達(dá)原代皮質(zhì)神經(jīng)元的FNDC5上調(diào)BDNF的表達(dá)，用RNAi敲低FNDC5下調(diào)BDNF的表達(dá)，證實(shí)了FNDC5是BDNF的重要調(diào)控因子。而BDNF是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，能增強(qiáng)神經(jīng)元的存活、遷移和樹突生長，調(diào)節(jié)突觸的可塑性和認(rèn)知功能，在神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)和功能維持，特別是神經(jīng)發(fā)生方面起重要作用，是運(yùn)動對大腦有益影響的重要調(diào)節(jié)因子[17]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，主要參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成以及合成后蛋白質(zhì)的折疊等。病理刺激(如氧化應(yīng)激、脂質(zhì)積聚等)會引起未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聚集，產(chǎn)生ERS，激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)來保護(hù)由ERS引起的損傷，嚴(yán)重的ERS可以啟動凋亡程序。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Bip/Grp78)和C/EBP同源蛋白(CHOP)是ER應(yīng)激的分子標(biāo)志物，它們的水平增加提示ER應(yīng)激誘導(dǎo)[18]。TH是多巴胺神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白，本研究表明了帕金森大鼠模型中腦組織TH表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低，ERS相關(guān)分子Bip/Grp78和CHOP的表達(dá)上調(diào)，起到促凋亡的作用。而28 d SAE后PD大鼠中腦組織TH表達(dá)較模型組明顯升高，Bip/Grp78和CHOP的表達(dá)有所下調(diào)。可能與SAE潛在地減少了多巴胺能神經(jīng)元變性，誘導(dǎo)PD模型動物在包括運(yùn)動皮層、基底神經(jīng)節(jié)、中腦、小腦、紅核的運(yùn)動區(qū)域內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能的適應(yīng)(可塑性)有關(guān)[13]。

因此，中長期的SAE可能通過上調(diào)PD大鼠骨骼肌中FNDC5的表達(dá)和血清中Irisin的含量，降低PD大鼠中腦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少多巴胺神經(jīng)元的凋亡，從而改善PD大鼠的運(yùn)動功能。但I(xiàn)risin如何作用于中腦DA神經(jīng)元，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用機(jī)制需要在今后的研究中進(jìn)一步探討。