姚 波，宋文英，徐 釗，朱 婧

(陜西省人民醫(yī)院麻醉科，西安 710068；*通訊作者,E-mail:279986902@qq.com)

慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)常由阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome, OSAHS)引起[1,2]，各年齡段患者均可發(fā)生。OSAHS可損傷人體的各個系統(tǒng)，使其成為內(nèi)分泌、心血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)疾病發(fā)生的獨立危險因素[3-5]。其中CNS疾病以認知功能障礙為主[6,7]，給患者家庭及社會帶來嚴重的經(jīng)濟負擔。因此，探究其發(fā)病機制以及尋求有效的治療措施極其重要。丙泊酚作為一種應用于臨床超過30年的全身麻醉藥，除具有鎮(zhèn)靜催眠的功能，還可通過抗炎途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用[8]。有研究報道，丙泊酚可通過miR-106b/Pi3k/Akt信號通路抑制小膠質(zhì)細胞的激活[9]。同時丙泊酚還可通過上調(diào)miR-223-3p抑制海馬炎癥反應，最終改善老齡大鼠術后認知功能[10]。但丙泊酚在慢性缺氧誘發(fā)小鼠認知功能障礙中的作用機制仍不清楚。本研究旨在觀察丙泊酚對慢性缺氧小鼠海馬炎癥反應及認知功能的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性12周C57BL/6小鼠(23 g左右)60只購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號：2959112)。小鼠于無特定病原體(specific pathogen free, SPF)環(huán)境[溫度(22±1)℃，濕度50%±5%]中飼養(yǎng)，晝夜循環(huán)光照，自由攝食飲水，適應飼養(yǎng)環(huán)境1周。本研究動物實驗已獲倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器

RIPA細胞裂解液(北京普利來基因技術有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；腺苷A2A受體(adenosine A2Areceptor, A2AR)、谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1(glutamate transporter-1, GLT-1)、谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運體(glutamate-aspartate transporter, GLAST)及離子鈣結(jié)合銜接分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1, Iba1)抗體(英國Abcam公司)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；谷氨酸試劑盒(美國Sigma公司)。

空氣艙(美國BioSpherix公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；酶標儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.3 慢性間歇性缺氧模型建立與分組

參照已有報道建立小鼠慢性間歇性缺氧模型[11]。采用隨機數(shù)字表法將小鼠分成5組(n=12)：對照組、模型組、丙泊酚低劑量組(2 mg/kg，臨床用量)、丙泊酚中劑量組(10 mg/kg，5倍臨床用量)及丙泊酚高劑量組(20 mg/kg，10倍臨床用量)。對照組小鼠置于空氣艙內(nèi)并持續(xù)充入氧氣含量為21%的空氣，模型組小鼠所在空氣艙氧氣含量在21%與6%之間交替維持90 s，每天8 h，共14 d。造模完成后，丙泊酚組小鼠腹腔注射對應劑量丙泊酚，對照組和模型組注射與丙泊酚組等體積脂肪乳。

1.4 水迷宮測試

采用水迷宮實驗評估小鼠空間學習記憶能力[12]。實驗分為訓練及測試階段。訓練階段：水迷宮等分為4個象限，將平臺置于其中一個象限中間位置，小鼠隨機面朝池壁放入水中。記錄小鼠找到并爬上平臺的時間，如果60 s內(nèi)找不到平臺，記錄為60 s，引導小鼠至平臺并停留15 s。然后隨機進行剩余象限訓練，每次訓練間隔15 min，共5 d。測試階段：模型完成當天行定位航行測試，將小鼠放入水中，記錄找到平臺時間。定位航行測試結(jié)束后間隔24 h，去除平臺行空間探索測試，記錄小鼠60 s內(nèi)其穿越平臺的次數(shù)。

1.5 組織獲取

行為學測試后每組取6只小鼠在戊巴比妥(5 mg/100 g腹腔注射)麻醉下斷頭，于冰上取海馬組織，凍存于-80 ℃冰箱。每組另外取6只小鼠在戊巴比妥麻醉下，行生理鹽水及4%多聚甲醛灌流，取全腦置于4%多聚甲醛中。

1.6 Western blot檢測海馬組織中A2AR、GLT-1及GLAST蛋白表達

將小鼠海馬組織置于RIPA裂解液中于冰上裂解10 min，采用BCA法測定樣本總蛋白濃度。使用蛋白上樣緩沖液將樣本蛋白濃度配制為3 μg/μl，每孔上樣10 μl，隨后SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。室溫封閉1 h，A2AR(1 ∶1 000)、GLT-1(1 ∶1 000)及GLAST(1 ∶1 000)相應一抗孵育，4 ℃過夜。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)洗膜3次，每次6 min，后加入相應HRP標記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h。PBS洗膜3次后，采用ECL化學發(fā)光液進行顯影，并用Image J統(tǒng)計分析相應蛋白條帶灰度值。

1.7 免疫熒光染色小鼠海馬Iba1

將4%多聚甲醛中小鼠全腦置于30%蔗糖溶液中進行脫水，切片，然后PBS清洗腦片3次，每次5 min。經(jīng)10%山羊血清封閉后去除封閉液，加入Iba1(1 ∶200)抗體4 ℃過夜。PBS洗去一抗，Cy3標記的二抗(1 ∶500)37 ℃孵育1.5 h。熒光顯微鏡進行腦片掃描，采用Image J軟件進行小鼠海馬Iba1熒光強度定量分析。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測小鼠海馬中TNF-α和IL-1β含量

參照TNF-α和IL-1β試劑盒檢測說明書進行標準品稀釋，加入小鼠海馬組織裂解液后放置于37 ℃水浴鍋1 h后洗板拍干，加入雙蒸水和一抗工作液后置于37 ℃水浴鍋中30 min，洗板3次后加酶標抗體工作液并將反應板置于37 ℃ 10 min，最后加入底物工作液100 μl，避光放置15 min后加入終止液100 μl，使用酶標儀檢測450 nm處吸光度，記錄OD值并繪制標準曲線，根據(jù)檢測樣品OD值計算出TNF-α和IL-1β含量。

1.9 谷氨酸比色法試劑盒檢測小鼠海馬谷氨酸含量

參照試劑盒說明書進行實驗，簡述如下：將反應工作液1.5 ml加入到標準品及樣本中，渦旋混勻3 s后于340 nm測定OD值(記為A1)。各管加入酶試劑0.02 ml后渦旋混勻3 s，37 ℃孵育40 min后于340 nm處測定OD值(記為A2).根據(jù)說明書公式計算谷氨酸濃度。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠空間學習記憶比較

與對照組相比，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長，平臺穿越次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組相比，丙泊酚中、高劑量組小鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)，平臺穿越次數(shù)明顯增加(P<0.01)，且差異有統(tǒng)計學意義，但丙泊酚低劑量組小鼠逃避潛伏期、平臺穿越次數(shù)與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖1)。

2.2 各組小鼠海馬Iba1、TNF-α及IL-1β水平比較

與對照組相比，模型組小鼠海馬Iba1、TNF-α及IL-1β表達明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；與模型組相比，丙泊酚中、高劑量組小鼠海馬Iba1、TNF-α及IL-1β表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖2)。

與對照組相比，***P<0.001；與模型組相比，##P<0.01圖2 各組小鼠海馬Iba1及炎癥因子水平 (Iba1熒光染色)Figure 2 Levels of hippocampal Iba1, TNF-α and IL-1β contents in each group (Iba1 fluorescence staining)

2.3 各組小鼠海馬A2AR、谷氨酸轉(zhuǎn)運體及谷氨酸水平比較

與對照組相比，模型組小鼠海馬A2AR表達及谷氨酸含量明顯增多(P<0.001)，GLT-1表達明顯減少(P<0.01)，而GLAST表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組相比，丙泊酚中、高劑量組小鼠海馬A2AR表達及谷氨酸含量明顯減少(P<0.01)，GLT-1表達明顯增多(P<0.01)，而GLAST表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖3)。

3 討論

OSAHS是一種以睡眠時反復發(fā)作的上呼吸道阻塞為特征的呼吸系統(tǒng)常見病及多發(fā)病，成年及兒童均可發(fā)生[5]。OSAHS擾亂人體正常的睡眠節(jié)律繼而影響基本的生理過程，導致反復的睡眠暫停及低通氣，最終造成患者慢性間歇性低氧的發(fā)生[13]。最近的臨床研究報道，OSAHS導致患者智力缺陷、記憶、注意力、執(zhí)行功能、視覺空間和分析能力障礙[7]。動物實驗研究表明，OSAHS誘發(fā)認知障礙的機制與神經(jīng)元死亡、血腦屏障損傷、氧化應激及炎癥反應密切相關[14,15]。其中，炎癥反應是認知障礙發(fā)生的重要病理生理機制，抑制炎癥反應有效改善間歇性低氧引起的認知障礙[16]。因此，抑制炎癥反應是改善OSAHS誘發(fā)認知障礙的重要手段。

與對照組相比，**P<0.01，***P<0.001；與模型組相比，##P<0.01圖3 各組小鼠海馬A2AR、谷氨酸轉(zhuǎn)運體及谷氨酸水平比較Figure 3 Levels of hippocampal A2AR, GLT-1, GLAST and glutamate contents in each group

丙泊酚在臨床中常被用于全身麻醉及無痛內(nèi)鏡診治的鎮(zhèn)靜維持，隨著相關藥理作用研究的深入，丙泊酚被證實具有抗炎作用[8]。在術后認知功能障礙老齡大鼠模型中，丙泊酚通過上調(diào)miR-223-3p抑制海馬炎癥反應，改善大鼠術后認知功能。體外試驗中，丙泊酚可顯著抑制脂多糖誘導的小膠質(zhì)細胞激活，從而減少炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平的表達[9]。本研究通過模擬OSAHS反復低氧的過程構建慢性間歇性低氧小鼠模型，探究丙泊酚對慢性間歇性低氧小鼠認知功能的影響及其可能機制。結(jié)果顯示，14 d慢性間歇性低氧成功誘發(fā)小鼠認知功能的損傷，丙泊酚(10，20 mg/kg)明顯改善小鼠認知功能，同時抑制海馬小膠質(zhì)細胞的激活以及炎癥因子的表達，但低劑量丙泊酚2 mg/kg無明顯作用。提示丙泊酚可能通過抑制海馬炎癥反應繼而改善慢性間歇性低氧小鼠認知功能，此效應具有劑量依賴性。

A2AR作為腺苷親和力較強的受體之一，發(fā)揮著調(diào)控血腦屏障通透性及神經(jīng)炎癥等多種重要功能[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性間歇性低氧小鼠海馬A2AR表達增多，丙泊酚(10，20 mg/kg)能夠抑制A2AR蛋白水平。小膠質(zhì)細胞作為腦內(nèi)重要的免疫細胞，在CNS炎癥反應中發(fā)揮重要作用。既往研究表明，A2AR拮抗劑SCH58261能夠抑制脂多糖引起的海馬小膠質(zhì)細胞激活以及炎癥因子的釋放[18]。因此，我們推測丙泊酚可能通過A2AR抑制海馬炎癥反應，最終改善小鼠認知功能。

谷氨酸作為腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與神經(jīng)元再生、突觸可塑性形成及神經(jīng)元死亡等多種生理過程。盡管谷氨酸被證實與學習記憶密切相關，但過量的谷氨酸堆積可引起神經(jīng)元內(nèi)Ca+超載，誘發(fā)神經(jīng)元損傷，此過程也被稱為興奮性神經(jīng)毒性[19]。已有研究表明，A2AR激動劑CGS21680降低星形膠質(zhì)細胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達，從而抑制谷氨酸的重攝取[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性間歇性低氧小鼠海馬谷氨酸含量明顯增加，GLT-1明顯降低，而GLAST無明顯變化，以上研究結(jié)果提示GLT-1表達減少及谷氨酸聚集可能在慢性間歇性低氧小鼠認知功能障礙中發(fā)揮重要作用，但谷氨酸轉(zhuǎn)運體變化可能具有特異性(GLAST無變化)。丙泊酚(10，20 mg/kg)能夠明顯上調(diào)海馬GLT-1表達，降低谷氨酸含量。我們推測，丙泊酚除通過A2AR調(diào)控海馬炎癥反應，還可能通過上調(diào)GLT-1表達，降低谷氨酸堆積帶來的興奮性神經(jīng)毒性，最終改善小鼠認知功能。

綜上所述，丙泊酚能夠改善慢性間歇性低氧小鼠認知功能障礙，其作用機制可能與下調(diào)海馬A2AR表達，從而抑制炎癥反應與谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性密切相關。