郭艷杰,張 亭，王佳馨，楊長(zhǎng)娥，李 濤

(1西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院心臟內(nèi)科，西安 710100；2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化病醫(yī)院超聲診療中心；*通訊作者,E-mail:yuanhang-004@163.com)

目前，心血管疾病是人類死亡的主要原因之一[1]。急性心肌梗死(myocardial infarction, MI)后有藥物治療、微創(chuàng)介入及外科手術(shù)等多種治療策略可供選擇，但是MI后心力衰竭的發(fā)生率和患病率仍不斷增加。盡管近年來(lái)藥理學(xué)研究方面已經(jīng)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步(如β受體阻斷劑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制劑等)，但MI患者的死亡率仍很高，5年死亡率為30%～70%[2]。MI后的心臟保護(hù)研究仍然迫切。

厚樸是一種用于治療心臟病和中風(fēng)等多種心血管疾病的傳統(tǒng)中藥。和厚樸酚(honokiol, HK)作為厚樸的活性成分，已經(jīng)被證明可以通過(guò)抗氧化和抗炎作用減輕腦缺血再灌注損傷[3]。已經(jīng)有研究報(bào)道和厚樸酚有降低大鼠在MI后發(fā)生心律失常的風(fēng)險(xiǎn)[4-6]。但和厚樸酚能否改善MI后心臟功能尚未有研究報(bào)道。綜合文獻(xiàn)中關(guān)于和厚樸酚保護(hù)心腦血管的作用及其具有抗炎抗氧化等作用的報(bào)道，我們推測(cè)和厚樸酚可能對(duì)MI后心臟具有保護(hù)作用。因此，本研究探究和厚樸酚對(duì)MI小鼠心臟功能的影響，了解其是否對(duì)MI后心臟具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠購(gòu)買并飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK-2017-0021)。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

和厚樸酚(純度>99.0%)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技公司，異氟烷(純度>99.9%)購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司，Masson染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，TUNEL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司，DAPI購(gòu)自美國(guó)Sigma公司?？笲-cell lymphoma/leukemia-2抗體、抗BCL2 associated X抗體和抗GAPDH抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自中杉金橋公司。引物訂購(gòu)于北京擎科生物科技有限公司。小動(dòng)物超聲機(jī)購(gòu)自加拿大Fujifilm公司，Western blot電泳、轉(zhuǎn)膜及成像系統(tǒng)均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司。

1.3 小鼠MI模型建立及實(shí)驗(yàn)分組

小鼠隨機(jī)分為兩組:一組進(jìn)行MI手術(shù)(n=20),一組進(jìn)行假手術(shù)(n=10)。MI手術(shù)組小鼠用2%異氟醚麻醉，固定后從左側(cè)第三和第四肋間開胸暴露心臟，用6-0絲線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，前壁變白提示冠狀動(dòng)脈結(jié)扎成功，術(shù)后將MI小鼠隨機(jī)分為MI組和MI+HK組。假手術(shù)組(sham組)進(jìn)行完全相同的手術(shù)操作，但是不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。MI+HK組于術(shù)后立即腹腔注射和厚樸酚(0.24 mg/kg)，每天1次，持續(xù)給藥28 d。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

所有實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及觀察指標(biāo)均在假手術(shù)或MI手術(shù)后28 d時(shí)完成。

1.4.1 小動(dòng)物心臟超聲檢測(cè)心臟功能 每組各8只小鼠用2%異氟醚麻醉，調(diào)整異氟烷劑量，保持小鼠心率在400～450次/min之間，小鼠固定于操作臺(tái)上之后，通過(guò)VisualSonic VeVo 2100成像系統(tǒng)的經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖進(jìn)行評(píng)估，記錄M型左室舒張末期內(nèi)徑和收縮末期內(nèi)徑，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)。

1.4.2 Miller導(dǎo)管檢測(cè)小鼠心臟功能 每組各4只小鼠用2%異氟醚麻醉后，從左側(cè)頸部暴露左頸動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾分別夾住近心和遠(yuǎn)心端，用顯微剪剪出一個(gè)三角形切口，將Miller導(dǎo)管插入頸動(dòng)脈，放松近心端夾子，將導(dǎo)管緩慢送入左心室，待信號(hào)穩(wěn)定幾分鐘后，記錄左心室舒張末壓力(LVEDP)、左心室收縮末內(nèi)徑(LVESD)和舒張末內(nèi)徑(LVEDD)，計(jì)算左心室內(nèi)壓力上升的最大速率(dP/dtmax)。

1.4.3 心臟質(zhì)量與脛骨長(zhǎng)度比值計(jì)算 異氟烷麻醉小鼠后從頸部抽取血液。剪開小鼠胸部皮膚及肋骨，從主動(dòng)脈根部逆灌生理鹽水沖洗干凈殘余的血液后，吸干水分，對(duì)心臟進(jìn)行稱量并記錄心臟質(zhì)量；分離小鼠脛骨并測(cè)量其長(zhǎng)度。每組各6只小鼠，計(jì)算心臟質(zhì)量與脛骨長(zhǎng)度比值(HW/TL)。

1.4.4 Masson染色檢測(cè)心臟纖維化 異氟烷麻醉小鼠后從頸部抽取血液。剪開小鼠胸部皮膚及肋骨，從主動(dòng)脈根部逆灌生理鹽水沖洗干凈殘余的血液后將心臟置于4%多聚甲醛過(guò)夜。經(jīng)過(guò)石蠟包埋、切片、脫蠟后，進(jìn)行Masson染色，用ImageJ軟件測(cè)量纖維化，以占左心室總面積的百分比計(jì)算。

1.4.5 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 異氟烷麻醉小鼠后從頸部抽取血液，剪開小鼠胸部皮膚及肋骨，從主動(dòng)脈根部逆灌生理鹽水沖洗干凈殘余的血液后，取心臟組織進(jìn)行4%多聚甲醛固定、石蠟包埋和切片，脫蠟后，按照試劑盒說(shuō)明書，進(jìn)行TUNEL試染色，使用Image J軟件計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。

1.4.6 蛋白質(zhì)免疫印記檢測(cè)Bcl-2和Bax的表達(dá)量 取小鼠心臟從左心室提取總蛋白，蛋白樣品的濃度用BCA法進(jìn)行檢測(cè)定量，通過(guò)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離提取和定量的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF上，用含5%脫脂奶粉和0.1%吐溫-20的封閉液室溫下對(duì)PVDF膜封閉2 h，隨后，將PVDF膜與適當(dāng)?shù)囊豢箍贵w(抗Bcl-2抗體和抗Bax抗體均按照1 ∶1 000進(jìn)行稀釋，抗GAPDH抗體按照1 ∶2 000進(jìn)行稀釋)在4 ℃下孵育過(guò)夜，室溫條件下用相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合二抗孵育PVDF膜，滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑，用ChemiDocTMXRS進(jìn)行成像，使用與成像儀配套的Image Lab 5.0軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4.7 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)纖維化相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄量 異氟烷麻醉小鼠后取心臟組織，用PBS沖洗后，左心室切下一小塊組織，放入含有Trizol試劑的Ep管中，參照RNA提取說(shuō)明書，從樣本中提取總RNA，測(cè)定濃度后，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀定量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 和厚樸酚改善小鼠MI后心臟功能

小鼠MI手術(shù)后28 d，通過(guò)小動(dòng)物超聲和Miller導(dǎo)管對(duì)小鼠心臟功能進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果見圖1。與sham組相比，MI組小鼠的LVEF顯著降低，LVEDP顯著升高，dP/dtmax顯著降低(均P<0.001)；與MI組相比，MI+HK組小鼠的LVEF顯著升高(P<0.05)，LVEDP顯著降低(P<0.001)，dP/dtmax顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明MI小鼠經(jīng)過(guò)給予和厚樸酚處理后，心臟功能有顯著的改善，和厚樸酚具有MI后心臟保護(hù)作用。

與sham組相比，***P<0.001；與MI組相比，#P<0.05，###P<0.001圖1 和厚樸酚對(duì)MI小鼠心臟功能的影響 (n=8或n=4)Figure 1 Effects of honokiol on cardiac function in MI mice (n=8 or n=4)

2.2 和厚樸酚減輕小鼠MI后心室重構(gòu)

MI術(shù)后28 d，與sham組相比，MI組小鼠HW/TL顯著升高(P<0.01)，LVESD和LVEDD也顯著增加(均P<0.001，見圖2)，這提示MI術(shù)后小鼠的心臟出現(xiàn)顯著的肥厚以及左心室擴(kuò)大；與MI組相比，MI+HK組小鼠的HW/TL、LVESD和LVEDD均有所降低(P<0.05，見圖2)，這表明MI引起的肥厚和擴(kuò)大得到了一定程度的抑制。以上結(jié)果表明和厚樸酚減輕了心肌梗死后小鼠心室重構(gòu)。

2.3 和厚樸酚減輕小鼠MI區(qū)遠(yuǎn)端纖維化

MI術(shù)后28 d，對(duì)小鼠心臟進(jìn)行固定并行Masson染色。梗死遠(yuǎn)端區(qū)域Masson染色典型圖顯示，MI組梗死遠(yuǎn)端區(qū)域膠原沉積顯著，而經(jīng)過(guò)和厚樸酚治療后，膠原沉積有所減輕(見圖3)。采用Image J對(duì)梗死遠(yuǎn)端區(qū)域進(jìn)行纖維化定量計(jì)算，與sham組相比，MI組小鼠的梗死遠(yuǎn)端纖維化指數(shù)顯著增加(P<0.001)；而和厚樸酚治療后，心梗小鼠梗死遠(yuǎn)端纖維化指數(shù)從(20.65±0.98)%下降到(10.53±0.87)%(P<0.001，見圖3)。這表明和厚樸酚減少了MI后小鼠左心室的膠原沉積，抑制了左心室的不良重構(gòu)。

2.4 和厚樸酚降低梗死邊緣區(qū)域心肌細(xì)胞的凋亡

MI發(fā)生后，梗死區(qū)域心肌細(xì)胞大量死亡，而梗死邊緣區(qū)域的心肌細(xì)胞也會(huì)持續(xù)凋亡。術(shù)后心臟細(xì)胞的凋亡情況通過(guò)TUNEL染色進(jìn)行定量檢測(cè)。TUNEL染色典型圖見圖4。與sham組相比，MI后小鼠心臟梗死邊緣組織心肌細(xì)胞有明顯的凋亡(P<0.001)，而經(jīng)過(guò)和厚樸酚治療后，心肌細(xì)胞的凋亡受到了抑制，凋亡比例由(7.52±0.15)%下降到(3.54±0.09)%(P<0.001，見圖4)。

與sham組相比，**P<0.01，***P<0.001；與MI組相比，#P<0.05圖2 和厚樸酚對(duì)小鼠心肌梗死后心室重構(gòu)的影響 (n=6或n=8)Figure 2 Effects of honokiol on ventricular remodeling in MI mice (n=6 or n=8)

與sham組相比，***P<0.001；與MI組相比，###P<0.001圖3 和厚樸酚對(duì)小鼠心臟梗死區(qū)遠(yuǎn)端纖維化的影響 (Masson染色×40，n=6)Figure 3 Effect of honokiol on fibrosis in the remote region after MI (Masson staining×40，n=6)

圖4 和厚樸酚對(duì)梗死邊緣區(qū)域心肌細(xì)胞的凋亡的影響 (TUNEL染色，n=8)Figure 4 Effect of honokiol on the apoptosis of cardiomyocytes in the border region (TUNEL staining，n=8)

2.5 和厚樸酚降低MI小鼠心臟纖維化及凋亡分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)

進(jìn)一步研究表明，與sham組相比，MI小鼠心臟纖維化關(guān)鍵分子Tgfb1、Col1a1和Acta2的轉(zhuǎn)錄量在心梗后分別上升到3.57倍，2.05倍和3.01倍(均P<0.001)；而經(jīng)過(guò)治療后，與MI組相比，和厚樸酚組小鼠心臟中前述3種纖維化相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄量分別下降23.25%，23.41%和26.57%，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖5)。此外，與MI組相比，和厚樸酚組小鼠梗死心臟中的凋亡相關(guān)分子Bax/Bcl-2的比值也顯著降低(P<0.05，見圖5)。

與sham組相比，***P<0.001；與MI組相比，#P<0.05，##P<0.01圖5 和厚樸酚對(duì)MI小鼠心臟纖維化及凋亡分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響 (n=4)Figure 5 Effects of honokiol on the transcription and expression of cardiac fibrosis and apoptosis molecules in MI mice (n=4)

3 討論

隨著科技的進(jìn)步，急性MI后患者有藥物、溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療以及冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等多種治療策略可供選擇，但是急性MI患者的1年病死率仍有28%[1]。所以，研究MI后的心臟保護(hù)研究依舊迫切。本研究發(fā)現(xiàn)中藥有效成分—和厚樸酚對(duì)MI后心臟功能具有保護(hù)作用，有望為MI的防治提供新的治療策略。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥中，厚樸可以用于消除胸悶和腹部緊繃，促進(jìn)血液循環(huán)。厚樸含有生物堿、皂苷以及酚類等多種活性物質(zhì)[7]。和厚樸酚是一種木脂素，與厚樸酚、4-O-甲基和厚樸酚和倒卵醇一起被認(rèn)為是木蘭植物中的主要生物活性化合物之一[8]。研究表明，和厚樸酚具有抗氧化、抗炎、腎臟保護(hù)、肝臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)、抗肥胖、抗糖尿病和抗癌等多種功能和活性[3,9-11]。此外，和厚樸酚可以輕易地穿過(guò)血腦屏障和血腦脊液屏障，成為具有高生物利用度的有效候選藥物。已經(jīng)有研究報(bào)道和厚樸酚具有心血管保護(hù)作用[12]，但是目前尚未有關(guān)于和厚樸酚在MI后心臟保護(hù)中的作用的報(bào)道。在本研究中和厚樸酚對(duì)MI小鼠心臟功能的保護(hù)作用得到了證實(shí)：通過(guò)給予和厚樸酚，MI小鼠的心臟功能得到了改善，具體表現(xiàn)在左心室射血分?jǐn)?shù)的提高、左心室收縮末壓力的下降以及等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率的提高。

和厚樸酚的生物活性與激活胞內(nèi)多種信號(hào)通路相關(guān)。和厚樸酚通過(guò)激活SIRT1/Nrf2信號(hào)通路改善I型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷[6]。在此過(guò)程中，和厚樸酚激活SIRT1，增強(qiáng)Nrf2核易位，增加抗氧化能力，減少細(xì)胞凋亡[6,13]。此外，和厚樸酚在腦缺血或腦缺血發(fā)作后至少有5 h的治療時(shí)間窗，這可能部分是由于突觸后密度蛋白95(PSD95)與神經(jīng)一氧化氮合成酶(nNOS)相互作用而破壞NO的生成，從而抑制神經(jīng)毒性NO的生成相關(guān)[4]。和厚樸酚可以擴(kuò)張血管，這可能是其通過(guò)抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[14,15]，和厚樸酚能夠通過(guò)抑制RhoA的激活和隨后肌球蛋白磷酸酶靶向亞單位1(MYPT1)的磷酸化，抑制U46619和氟化鈉引起的血管收縮[15]。長(zhǎng)期服用和厚樸酚可通過(guò)增加NO生成降低自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的收縮壓[14]。隨著NO的釋放，和厚樸酚可以抑制血小板聚集，從而抑制動(dòng)脈的血栓形成[16]。對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化，和厚樸酚通過(guò)抑制ERK/NF-κB途徑有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶的表達(dá)[17]。在心血管疾病方面，和厚樸酚可以減輕心肌缺血/再灌注損傷，降低血壓，并產(chǎn)生抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。本研究中在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和厚樸酚減輕MI小鼠心臟與脛骨長(zhǎng)度比值的下降、收縮末內(nèi)徑和舒張末內(nèi)徑，即心室重構(gòu)的減輕。病理學(xué)角度和厚樸酚減輕了梗死遠(yuǎn)端心肌間質(zhì)纖維化指數(shù)以及減少梗死邊緣組織心肌細(xì)胞的凋亡。胞內(nèi)分子方面和厚樸酚抑制心肌梗死小鼠心臟纖維化關(guān)鍵分子Tgfb1、Col1a1和Acta2的轉(zhuǎn)錄以及促凋亡分子Bax的表達(dá)，促進(jìn)了抗凋亡分子Bcl-2的表達(dá)。但是，和厚樸酚對(duì)小鼠MI心臟的保護(hù)作用的完整分子機(jī)制還不明確。本研究證實(shí)，和厚樸酚能夠改善MI后小鼠的心臟功能，降低梗死心臟遠(yuǎn)端區(qū)域的間質(zhì)纖維化，減少梗死邊緣區(qū)域心肌細(xì)胞的凋亡。綜上所述，本研究結(jié)果表明和厚樸酚對(duì)梗死后小鼠心臟具有保護(hù)作用：和厚樸酚能夠改善MI后小鼠的心臟功能，減輕心臟的肥厚和纖維化沉積，抑制梗死邊緣區(qū)域心肌細(xì)胞的凋亡。本研究證實(shí)了HK對(duì)心肌梗死后小鼠心臟的保護(hù)作用，但是未能對(duì)其內(nèi)在的分子機(jī)制進(jìn)行闡明，這是本研究的局限性。在未來(lái)的研究中，結(jié)合在體動(dòng)物和離體細(xì)胞對(duì)HK保護(hù)心梗后小鼠心臟進(jìn)行進(jìn)一步探討，全面揭示內(nèi)在分子機(jī)制，有望為和厚樸酚這一傳統(tǒng)中藥的有效成分成為改善MI患者心功能的潛在臨床新藥物提供理論基礎(chǔ)。