李 敏，蔣成義

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，蚌埠 233004；*通訊作者,E-mail:jiangchengyi1975@163.com)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種來源于鼻咽上皮細胞的鱗狀細胞癌，具有高度惡性、局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移的特點，大多數(shù)患者在診斷時已出現(xiàn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，甚至遠處轉(zhuǎn)移[1]。目前，放射治療是鼻咽癌患者的首選治療方法，但由于轉(zhuǎn)移和復發(fā)的存在，鼻咽癌患者的5年生存率仍較低[2]。因此，迫切需要尋找新的治療靶點為鼻咽癌的診斷和治療提供新的方向。

Tribbles假激酶3(Tribbles homolo 3，TRIB3)是Tribbles偽激酶家族的成員之一，與腫瘤、代謝性疾病等疾病關系密切。TRIB3包含一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域，但缺乏ATP結(jié)合袋和催化殘基，無激酶活性[3]。TRIB3作為信號轉(zhuǎn)導介質(zhì)和支架蛋白，在正常生理和疾病生物學中發(fā)揮著重要作用，影響細胞的增殖、分化、周期和死亡等[4]。大量研究證明，TRIB3在多種腫瘤中表達異常，如肺癌[5]、乳腺癌[6]、結(jié)直腸癌[7]、白血病[8]等，不同靶點與TRIB3相互作用或者激活不同信號通路，在不同的腫瘤或腫瘤的不同狀態(tài)中發(fā)揮著不同的作用。TRIB3已被證明可以激活MAPK信號通路，促進腎細胞癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[9]。多項研究也證明，TRBI3過表達可明顯激活ERK和JNK通路，促進肺腺癌的發(fā)生發(fā)展[10]。然而，TRIB3在調(diào)控鼻咽癌進展中的作用機制仍不清楚。

β-catenin信號通路具有多種細胞功能，但在大多數(shù)腫瘤中，處于高度失調(diào)狀態(tài)。研究證實，β-catenin信號通路在人結(jié)直腸癌[11]、肝癌[12]等腫瘤的發(fā)生中被激活，并抑制下游蛋白質(zhì)復合物，包括AXIN、GSK-3等，使β-catenin在胞內(nèi)表達失控，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。β-catenin介導的信號傳導途徑還是導致癌癥干細胞進展的重要途徑，并且其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中被激活[13]。因此，充分了解β-catenin信號通路的作用機制，有利于鼻咽癌治療的發(fā)展。

通過查找基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，TRIB3在頭頸部腫瘤中異常表達。我們猜測TRIB3的異常表達可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有關，有可能成為治療鼻咽癌的新靶標。因此，本研究觀察TRIB3對鼻咽癌增殖和侵襲遷移的影響，旨在探討TRIB3在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中作用機制，為推進其靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人鼻咽癌細胞HNE-1和5-8F購自中南大學湘雅醫(yī)學院，人鼻咽癌細胞CNE-2Z和人正常鼻咽細胞(N69)購自美國ATCC公司，sh-TRIB3、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA提取試劑盒購自上海吉瑪公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，胎牛血清(FBS)、Materigel膠購自浙江天杭生物科技股份有限公司，Lipofectamin2000購自美國Thermo Scientific公司，一抗TRIB3購自美國Affinity公司，一抗β-catenin、GSK-3β、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-actin及兔二抗均購于美國Abbkine科技有限公司，Transwell小室及BCA蛋白測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本收集 樣本收集來自于蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，從接受手術干預的鼻咽癌患者隊列中收集了8例鼻咽癌活檢組織和健康癌旁組織。本研究中涉及人體樣本的所有程序均按照赫爾辛基宣言進行，通過蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會的審查，并且征得8例鼻咽癌患者個人的知情同意。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人鼻咽癌細胞HNE-1、CNE-2Z和5-8F培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/L鏈霉素)中，放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時，將對數(shù)生長期的CNE-2Z和HNE-1細胞接種于6孔板，當細胞密度為50%～60%時，根據(jù)Lipofectamine2000說明書操作，分別將shRNA NC和shRNA TRIB3(shRNA 1，2，3)加至CNE-2Z和HNE-1細胞的6孔板中，命名為NC組和shRNA1組、shRNA2組、shRNA3組。轉(zhuǎn)染6～8 h后，更換培養(yǎng)基。后續(xù)實驗驗證找出轉(zhuǎn)染效率最高的shRNA組后，轉(zhuǎn)染后分組為NC組和sh-TRIB3組。

1.2.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測TRIB3的相對表達量 將鼻咽癌細胞用PBS清洗并用胰酶消化，再使用Trizol法分別提取總RNA。檢測濃度與純度后，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書，以GAPDH為內(nèi)參檢測TRIB3 mRNA的相對表達量，并檢測轉(zhuǎn)染效率。使用2-ΔΔCt方法分析TRIB3 mRNA的相對表達量。

1.2.4 CCK-8實驗檢測增殖能力 取轉(zhuǎn)染后生長狀態(tài)良好的HNE-1細胞、CNE-2Z細胞以5 000/孔的細胞密度接種于96孔板中，在0，24，48，72 h分別向各孔中加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，在酶標儀上測定450 nm波長處各孔吸光度(OD)值，OD值越高，代表活細胞數(shù)越多，細胞增殖能力越強。

1.2.5 集落克隆實驗檢測增殖能力 取轉(zhuǎn)染后生長狀態(tài)良好的HNE-1細胞、CNE-2Z細胞以100個細胞/孔的密度接種在6孔板中，用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基于37 ℃和5%CO2下培養(yǎng)14 d，觀察細胞形成集落的情況，并拍照記錄。

1.2.6 Transwell小室實驗檢測侵襲遷移能力 遷移實驗不鋪Materigel膠，侵襲實驗需要將Materigel膠與RPMI-1640培養(yǎng)基(不含10%胎牛血清)按1 ∶8的比例稀釋，以每個小室50 μl鋪于小室底部，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h使其處于半凝固狀態(tài)。細胞以1.5×105細胞/孔的密度在無血清培養(yǎng)基中接種于上室，下室加入600 μl RPMI-1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)。細胞被允許在24 h和48 h內(nèi)遷移。細胞用4%甲醛固定20 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡下觀察穿過濾膜的細胞數(shù)量。

1.2.7 劃痕實驗檢測遷移能力 將兩株鼻咽癌細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至80%～90%。用無菌10 μl移液管針尖制造線狀創(chuàng)面。0 h和24 h后采集遷移照片，每組隨機選取5個區(qū)域。創(chuàng)面愈合率(%)=[(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度]×100%。

1.2.8 免疫印跡(Western blot)實驗檢測相關蛋白含量 用添加蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細胞，再用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。等量的蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。隨后，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h，與一抗(TRIB3 1 ∶2 000，Snail 1 ∶2 000，E-cadherin 1 ∶1 000，N-cadherin 1 ∶1 000，Vimentin 1 ∶2 000，GSK-3 β1 ∶1 000，p-GSK-3β1 ∶1 000，β-catenin 1 ∶1 000，p-β-catenin 1 ∶1 000，β-actin 1 ∶2 000)在4 ℃下孵育過夜，用含0.1% Tween-20(TBST)的Tris緩沖鹽水清洗，二抗(兔抗1 ∶10 000)室溫孵育2 h。沖洗后，用Western blot底物(Pierce，美國)制備膜。β-actin作為內(nèi)源性對照。使用ImageJ軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 TRIB3在鼻咽癌細胞中的表達水平

與癌旁組織相比，鼻咽癌組織中TRIB3表達高度上調(diào)(P<0.05，見圖1)。與正常鼻咽上皮細胞(N69)相比，TRIB3在鼻咽癌細胞系CNE-2Z、HNE-1和5-8F中呈高表達狀態(tài)(P<0.05，見圖1)。因此，我們將使用CNE-2Z和HNE-1兩株細胞進行后續(xù)實驗。使用sh-TRIB3轉(zhuǎn)染各株細胞后，sh-TRIB3組細胞中的TRIB3 mRNA的表達水平明顯低于NC組(P<0.05，見圖2)。其中，shRNA2的轉(zhuǎn)染效率最高，后續(xù)實驗均用shRNA2進行細胞轉(zhuǎn)染。Western blot實驗結(jié)果顯示，sh-TRIB3組細胞中的TRIB3蛋白的表達水平明顯低于NC組(P<0.05，見圖3)。

2.2 下調(diào)TRIB3使鼻咽癌細胞增殖活性降低

CCK-8檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，sh-TRIB3組鼻咽癌細胞活力的調(diào)控作用顯著降低(P<0.05，見圖4)。集落克隆實驗結(jié)果顯示，與NC組相比，sh-TRIB3組HNE-1細胞和CNE-2Z細胞的集落克隆能力顯著降低(P<0.05，見圖5)。實驗結(jié)果顯示，TRIB3敲低后顯著降低了NPC的增殖能力。

圖1 TRIB3在鼻咽癌組織中的表達水平Figure 1 Expression level of TRIB3 in NPC tissues and cells

與NC組比較，*P<0.05,***P<0.001圖2 轉(zhuǎn)染shRNA后鼻咽癌細胞中TRIB3 mRNA的相對表達Figure 2 Relative expression of TRIB3 mRNA in nasopharyngeal carcinoma cells transfected with shRNA

A.HNE-1細胞中TRIB3蛋白表達B.CNE-2Z中TRIB3蛋白表達與NC組比較，*P<0.05圖3 轉(zhuǎn)染shRNA后鼻咽癌細胞中TRIB3蛋白的相對表達量Figure 3 Relative expression of TRIB3 protein in nasopharyngeal carcinoma cells transfected with siRNA

與NC組比較，*P<0.05,**P<0.01圖4 CCK-8分析敲低TRIB3后鼻咽癌細胞的增殖能力Figure 4 Effect of TRIB3 knockdown on the proliferation ability of NPC by CCK-8 assay

2.3 下調(diào)TRIB3使鼻咽癌細胞遷移、侵襲能力降低

Transwell小室實驗結(jié)果顯示，與NC組相比，sh-TRIB3組的遷移、侵襲能力明顯降低(P<0.05,見圖6)。劃痕實驗結(jié)果顯示，與NC組相比，sh-TRIB3組的遷移能力顯著降低(P<0.05,見圖7)。實驗結(jié)果顯示，敲低TRIB3可顯著抑制了NPC的遷移和侵襲能力。

與NC組比較，*P<0.05,**P<0.01圖5 集落克隆實驗分析敲低TRIB3后鼻咽癌細胞的增殖能力Figure 5 Effect of TRIB3 knockdown on proliferation of NPC by colony-forming test

與NC組比較，*P<0.05,**P<0.01圖6 敲低TRIB3可降低鼻咽癌細胞的遷移和侵襲能力Figure 6 Knockdown of TRIB3 reduces the migration and invasion of NPC

與NC組比較，*P<0.05,**P<0.01圖7 劃痕試驗顯示敲低TRIB3抑制了鼻咽癌的遷移能力 (×40)Figure 7 Knockdown of TRIB3 inhibits the migration ability of NPC by wound healing assay (×40)

2.4 TRIB3介導鼻咽癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程

通過Western blot實驗檢測EMT通路相關蛋白Snail、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的相對表達量。在HNE-1和CNE-2Z細胞中，與NC組相比，sh-TRIB3組E-cadherin水平升高，Snail、N-cadherin和Vimentin水平下調(diào)(均P<0.05,見圖8)。實驗結(jié)果表明，TRIB3介導了鼻咽癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，并且促進了此過程的發(fā)展。

2.5 TRIB3通過激活β-catenin信號通路促進鼻咽癌細胞的發(fā)展

通過Western blot實驗檢測β-catenin信號通路相關蛋白GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin和p-β-catenin的相對表達量。在HNE-1和CNE-2Z細胞中，與NC組相比，sh-TRIB3組p-GSK-3β和β-catenin蛋白表達水平明顯低于NC組；而GSK-3β和p-β-catenin蛋白表達水平明顯高于NC組(P<0.05，見圖9)。實驗結(jié)果提示，TRIB3可激活β-catenin信號通路，從而促進鼻咽癌的發(fā)展。

3 討論

鼻咽癌是華南及東南亞地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病與EB病毒感染、遺傳、種族、環(huán)境等因素密切相關[14]。探究鼻咽癌發(fā)病的具體作用機制可以為鼻咽癌的診斷和治療提供新的思路。本研究發(fā)現(xiàn)，TRIB3在鼻咽癌細胞中呈高表達狀態(tài)，并且通過激活β-catenin信號通路發(fā)揮其促癌的作用。

Tribbles家族最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中，有3種Tribbles異構(gòu)體，包括TRIB1,TRIB2和TRIB3，它們都是果蠅Tribbles蛋白的同源物[15]。TRIB3可以通過參與細胞內(nèi)信號傳導或者與功能蛋白相互作用來促進腫瘤的發(fā)展。近年來，大量研究已經(jīng)證實TRIB3在多種腫瘤中表達上調(diào)，并且促進了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。在胃癌組織中，TRIB3的表達明顯高于癌旁非腫瘤組織[16]。TRIB3在子宮內(nèi)膜癌中的表達水平高于正常子宮內(nèi)膜，其通過抑制AKT信號通路誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡，抑制增殖、遷移和侵襲[17]。盡管如此，TRIB3在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中甚少被報道。本研究表明，與正常鼻咽上皮細胞相比，TRIB3在鼻咽癌譜系中表達上調(diào)，并且能促進鼻咽癌的增殖和侵襲遷移。當TRIB3被抑制時，這種促癌作用就被抑制了。為了進一步探究TRIB3在鼻咽癌中的作用，本研究進行了大量體外實驗。首先通過PCR實驗和Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，與正常鼻咽上皮組織相比，TRIB3在鼻咽癌組織中高表達。其次，將鼻咽癌細胞分為NC組和sh-TRIB3組，通過細胞克隆實驗、CCK-8實驗、劃痕實驗以及Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TRIB3后可以抑制鼻咽癌細胞的增殖和侵襲遷移能力。結(jié)果提示TRIB3在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了至關重要的作用，并且可以促進鼻咽癌細胞的惡性生物學行為，但其與患者預后的相關性有待進一步研究證實。

與NC組比較，*P<0.05,**P<0.01圖8 Western blot實驗檢測敲低TRIB3對鼻咽癌細胞中EMT相關蛋白相對表達量的影響Figure 8 Effect of TRIB3 knockdown on relative expression of EMT-related proteins in NPC by Western blot

與NC組比較，*P<0.05,**P<0.01圖9 Western blot實驗檢測敲低TRIB3對鼻咽癌細胞中β-catenin信號通路相關蛋白相對表達量的影響Figure 9 Effect of TRIB3 knockdown on relative expression of β-catenin signaling pathway-related proteins in NPC by Western blot

β-catenin是一種多功能蛋白，是β-catenin信號通路中重要的信號轉(zhuǎn)導因子，游離的β-catenin可進入細胞核并調(diào)控基因表達，β-catenin的異常表達可誘導腫瘤發(fā)生[18,19]。β-catenin信號蛋白的過表達可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而β-catenin信號通路可以加速腫瘤細胞浸潤和遠處轉(zhuǎn)移[20]。多項研究表明β-catenin在膽管癌中過表達，激活了β-catenin信號通路，促進膽管癌細胞的EMT過程[21]。本研究通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，敲低TRIB3后，β-catenin信號通路相關蛋白p-GSK-3β和β-catenin蛋白表達降低，而GSK-3β和p-β-catenin蛋白表達增加，這表明TRIB3可以通過激活β-catenin信號通路來促進鼻咽癌的發(fā)展。

綜上所述，敲低TRIB3可以抑制β-catenin信號通路的激活，從而抑制鼻咽癌細胞的增殖和侵襲遷移，為鼻咽癌的診斷和靶向治療提供了新的方向。本研究未設置TRIB3過表達組，只設置了敲低TRIB3的實驗組，具有一定不足之處，后續(xù)研究將增加過表達組進行后續(xù)實驗。而且本項目僅在體外研究TRIB3通過調(diào)控β-catenin信號通路對鼻咽癌產(chǎn)生的影響，缺少相應的體內(nèi)實驗。同時，TRIB3調(diào)控β-catenin信號通路所涉及到的各種分子機制在不同鼻咽癌細胞中的具體作用途徑還需進一步探究，從而為鼻咽癌提供更有效的診斷和治療。