宜姣姣,葉亞麗,王愛紅

(1延安大學醫(yī)學院醫(yī)學研究實驗中心，延安 716000；2子長市人民醫(yī)院檢驗科；3寶塔區(qū)婦幼保健計劃生育服務中心檢驗科；*通訊作者,E-mail:ydwangaihong@163.com)

卵巢癌是影響女性健康的常見癌癥。盡管診斷技術、新輔助放化療和手術治療取得了進步，但卵巢癌的5年生存率仍然很低[1-5]，因此，開發(fā)針對卵巢癌特異性信號轉導通路分子異常的新藥是非常必要的。據(jù)報道中藥治療在腫瘤的治療中具有改善患者生存質量、降低轉移復發(fā)率等優(yōu)勢[2-7]，因此，探究中藥成分在卵巢癌治療中的作用對卵巢癌的治療具有積極作用。

雙花母草素是一種從中藥中提取出的萘醌類物質，具有抗炎、抗菌和抗癌等廣泛的生物學特性[8-14]。Ralph等[9]研究發(fā)現(xiàn)雙花母草素處理可引起人類黑色素瘤SK-Mel 19、SK-Mel 28及SK-Mel103三種細胞系細胞的單雙DNA鏈斷裂，從而抑制細胞周期進程、復制和DNA修復，促進人類黑色素瘤細胞凋亡。Barbosa-Jobim等[11]研究發(fā)現(xiàn)雙花母草素抑制胃癌細胞ACP02的集落形成、遷移和侵襲能力，并且通過降低端粒酶及myc的活性發(fā)揮抗癌作用。這提示雙花母草素是一種很有前途的抗癌藥物。但是，雙花母草素對卵巢癌的作用未見有報道，基于此,本研究擬探究雙花母草素對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲及EMT的影響及其可能的調節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌SKOV3細胞購自北京北納生物公司細胞庫；FBS、RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素均購自以色列BI公司；胰島素及雙花母草素購自美國MCE公司；Transwell小室購自美國Merck公司;GAPDH、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用RPMI-1640+10%FBS+0.01 mg/ml胰島素+1%青鏈霉素培養(yǎng)基于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細胞，待細胞融合度達到85%～95%進行傳代及實驗。

1.2.2 CCK-8實驗測定細胞活力 取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的SKOV3細胞以5×103個/100 μl接入96孔板，37 ℃培養(yǎng)過夜；貼壁后將細胞分為6組，分別加入不同濃度(0，2.5，5，10，20，40 μmol/L)的雙花母草素處理48 h，隨后在每孔中加入10 μl CCK-8溶液，室溫下孵育30 min，并于酶標儀450 nm處測定其吸光度，根據(jù)測定的吸光度值計算6組SKOV3細胞的細胞活力。

1.2.3 細胞分組及處理 根據(jù)CCK-8預實驗結果，將實驗分為空白對照組、低劑量組和高劑量雙花母草素組。空白對照組不加任何藥物；低、高劑量組分別加入5 μmol/L和10 μmol/L雙花母草素處理48 h。

1.2.4 Transwell檢測細胞侵襲 各組人卵巢癌SKOV3制成濃度為2×104/ml的無血清細胞懸液。分別取200 μl各組細胞懸液加入Matrigel預處理的Transwell上室，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，PBS清洗未侵襲細胞，并用10%甲醇溶液固定30 min，5%結晶紫染液靜置染色20 min，PBS清洗后于顯微鏡下隨機選擇5個視野觀察拍照計數(shù)。實驗重復3次。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移 將人卵巢癌細胞SKOV3單細胞懸液(約2×105個)均勻地接種到6孔板(背后用記號筆均勻劃線)中培養(yǎng)過夜。然后用槍頭垂直于背后的橫線劃痕。PBS清洗后加入各組無血清培養(yǎng)基、拍照。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后再次拍照，計算遷移距離。

1.2.6 免疫印跡實驗(Western blotting)檢測蛋白的表達 采用Western blotting實驗檢測EMT相關蛋白以及β-catenin的表達，SKOV3細胞5，10 μmol/L干擾處理48 h后，空白對照組、低劑量組和高劑量組SKOV3細胞經(jīng)冰凍PBS洗滌后加入蛋白裂解緩沖液提取，用Bradford法測定蛋白濃度后，變性并電泳分離。電泳后，蛋白質轉移到PVDF膜并于4 ℃過夜孵育E-cadherin(1 ∶500)、N-cadherin(1 ∶500)、β-catenin(1 ∶500)一抗。洗滌后，孵育二抗1 h，并用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)觀察信號，計算目的蛋白相對于GAPDH的表達量。

2 實驗結果

2.1 雙花母草素對SKOV3細胞活性的影響

CCK-8檢測雙花母草素處對SKOV3細胞活性的影響，結果顯示不同濃度雙花母草素(0，2.5，5，10，20，40 μmol/L)處理48 h，細胞活力分別是(100±4.00)%，(85.6±3.48)%，(71.6±4.68)%，(62.5±4.60)%，(31.8±2.35)%，(18.9±1.58)%，與0 μmol/L比較，差異具有統(tǒng)計學意義(見圖1)。這提示雙花母草素可抑制SKOV3細胞的增殖，基于雙花母草素濃度為10 μmol/L時，細胞的增殖能力為其半數(shù)，所以以5，10 μmol/L進行后續(xù)的實驗。

2.2 雙花母草素對SKOV3細胞侵襲的影響

采用Transwell進行細胞侵襲實驗，結果顯示，與對照組相比，低劑量組和高劑量組侵襲的細胞數(shù)量均減少，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.001)；與低劑量組相比，高劑量組的侵襲能力亦下降(P<0.01，見圖2)。

與對照組(0 μmol/L)相比,**P<0.01圖1 CCK-8法檢測SKOV3細胞的活力 (n=3)Figure 1 Viability of SKOV3 cells detected by CCK-8 (n=3)

2.3 雙花母草素對SKOV3細胞遷移的影響

采用細胞劃痕進行細胞遷移實驗，結果顯示，與對照組相比，低劑量組和高劑量組遷移的距離減少，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，與低劑量組相比，高劑量組的遷移距離更少(P<0.01，見圖3)。

2.4 雙花母草素對SKOV3細胞EMT相關蛋白的影響

Western blotting檢測EMT相關蛋白的表達，結果顯示，與對照組相比，低劑量組和高劑量組細胞的E-cadherin蛋白表達均上升，N-cadherin蛋白表達均下降，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001，見圖4)。與低劑量組相比，高劑量處理組E-cadherin蛋白表達亦上升，N-cadherin蛋白表達亦下降，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖4)。

與對照組相比，**P<0.01，***P<0.001；與低劑量組相比，##P<0.01圖2 Transwell檢測雙花母草素對SKOV3細胞侵襲的影響 (n=3)Figure 2 Effect of biflorin on the invasion of SKOV3 cells by Transwell assay (n=3)

與對照組相比，***P<0.001；與低劑量組相比，##P<0.01圖3 細胞劃痕實驗檢測雙花母草素對SKOV3細胞遷移能力的影響 (n=3)Figure 3 Effect of biflorin on cell migration by cell scratch assay (n=3)

與對照組相比，***P<0.001；與低劑量組相比，##P<0.01圖4 Western blotting檢測雙花母草素對SKOV3細胞EMT相關蛋白的影響 (n=3)Figure 4 Effect of biflorin on EMT-related proteins in SKOV3 cells by Western blotting (n=3)

2.5 雙花母草素對SKOV3細胞β-catenin蛋白的影響

Western blotting檢測β-catenin蛋白的表達，結果顯示，與對照組相比，低劑量組和高劑量組β-catenin蛋白表達均下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.001，見圖5)。與低劑量組相比，高劑量組β-catenin蛋白表達下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖5)。

與對照組相比，**P<0.01，***P<0.001；與低劑量組相比，##P<0.01圖5 Western blotting檢測雙花母草素對SKOV3細胞β-catenin蛋白的影響 (n=3)Figure 5 Effect of biflorin on β-catenin protein in SKOV3 cells by Western blotting (n=3)

3 討論

近年來，中藥在腫瘤的治療中發(fā)揮了重要的作用，許多重要成分表現(xiàn)出良好的抑癌作用和較小的副作用。雙花母草素是一種可從草蔻等多種中藥中提取的萘醌類物質，具有抗炎、抗腫瘤的活性。Montenegro等[15]研究發(fā)現(xiàn)雙花母草素以劑量依賴的方式通過AKT通路抑制黑色素瘤細胞MDA-MB-435的侵襲。Vasconcellos等[16]研究發(fā)現(xiàn)雙花母草素對小鼠紅細胞和海膽卵發(fā)育均無明顯抑制作用，但對B16、MCF-7和HCT-8等幾種腫瘤細胞生長均有明顯抑制作用，且表現(xiàn)出強烈的抗氧化活性。因此，我們探究了雙花母草素對卵巢癌的生物學作用，CCK-8結果顯示雙花母草素濃度依賴性地抑制卵巢癌細胞的增殖，Transwell及細胞劃痕實驗結果顯示雙花母草素濃度依賴性地抑制卵巢癌細胞的侵襲與遷移。

上皮-間質轉化(EMT)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，EMT促進癌癥轉移和復發(fā)[17-19]，上皮細胞標志物的下調或缺失往往伴隨著間質細胞標志物的上調。E-cadherin通常抑制侵襲，而N-cadherin在體外促進侵襲和轉移。目前的研究未對雙花母草素調節(jié)腫瘤侵襲遷移的機制進行研究，因此本研究探究了雙花母草素對EMT標記物E-cadherin及N-cadherin的影響，Western blotting結果顯示，雙花母草素的干預增加了E-cadherin的表達，降低了N-cadherin的表達，這提示雙花母草素可通過調節(jié)EMT過程抑制卵巢癌的侵襲與遷移。

Wnt/β-catenin通路在卵巢癌的進程中發(fā)揮重要調節(jié)作用，同時Wnt/β-catenin信號通路已被證明可參與EMT過程[20,21]。我們采用Western blotting檢測Wnt/β-catenin信號通路的核心分子β-catenin的表達，進一步確定雙花母草素抑制EMT和轉移是否與Wnt/β-catenin信號通路相關。結果顯示雙花母草素可抑制β-Catenin的表達，因此，雙花母草素可能通過Wnt/β-catenin通路介導的EMT觸發(fā)卵巢癌細胞遷移、侵襲及增殖。雙花母草素調節(jié)卵巢癌的具體方式還有待我們將進一步深入探討。