劉 輝，張惠榮，馬雯晴，董麗麗，楊眷娣

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，新疆 石河子 832000)

德朗熱綜合征(CDLS)是一種累及多系統(tǒng)的罕見病，具有顯著遺傳異質(zhì)性，臨床表現(xiàn)輕重不一[1]，典型病例有特殊面容、嚴(yán)重生長遲滯及肢體畸形等特點。目前發(fā)現(xiàn)[2]，至少有7 個基因(NIPBL基因、錨蛋白重復(fù)域11基因、SMC3 基因、RAD21 基因、SMC1A 基因、溴結(jié)構(gòu)域蛋白4基因、組蛋白去乙?；?基因和)與 CDLS相關(guān)，其中最常見的為NIPBL基因，起到調(diào)控黏連蛋白的作用[3]。許多組織均有NIPBL的表達(dá)，其中在顱骨、前肢、鰓弓中表達(dá)最豐富，這與其出生后主要骨骼畸形高度一致[4]。有研究證實，CDLS患兒中骨骼畸形最主要的原因是NIPBL基因沉默[5]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是常見的“種子細(xì)胞”，是成骨前體細(xì)胞的主要來源，在一定的誘導(dǎo)條件下可以分化為成骨細(xì)胞[6]。前期課題組已成功驗證NIPBL基因突變小鼠肢芽中成骨標(biāo)志蛋白下調(diào)[7]，然而在成骨分化過程受到多種因子及信號通路的影響[8]，其中Wnt/β-catenin信號通路在成骨過程中發(fā)揮重要作用[9]。本研究主要探討NIPBL沉默的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)后Wnt/β-catenin信號通路中的p-β-catenin蛋白、β-catenin 蛋白以及Lrp-5 mRNA的表達(dá)情況，從NIPBL基因調(diào)控骨骼生長發(fā)育的角度揭示CdLS的發(fā)病機(jī)制，為臨床CDLS的治療和干預(yù)提供新的思路。

1 材料和方法

1.1材料和儀器：小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株采購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。主要儀器和試劑：DMEM培養(yǎng)基(低糖)、0.25%胰蛋白消化酶(Gibco/BRL)、胎牛血清(Hyclone公司)；TrizolTM (Invitrogen公司)；Rt-PCR相關(guān)試劑采購于賽默飛公司；慢病毒(上海吉瑪公司)；成骨誘導(dǎo)液、茜素紅染料(美國Sigma公司)；β-catenin及磷酸化β-catenin單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(美國Abcam公司)；上海生工設(shè)計合成所有引物；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(日本Nicon公司)；紫外分光光度計(美國Thermo公司)；羅氏LightCycler96實時熒光PCR儀器。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs，并置于5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，按1∶2進(jìn)行傳代，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前12 h，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(15×104個/孔)接種于6孔板中。用攜帶shRNA-NIPBL-/+、空載體慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，細(xì)胞中加入慢病毒(體積=感染復(fù)數(shù)×細(xì)胞數(shù)/慢病毒滴度)和5 μg/ml(polybrene)聚凝胺。培養(yǎng)12 h后用新鮮培養(yǎng)基換液。感染3 d后，用含2 μg/ml嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的篩選。接下來，每2天更換一次含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，直到對照細(xì)胞完全死亡。用綠色熒光蛋白(GFP)作為檢測感染效率的標(biāo)志物。在熒光顯微鏡下觀察直到GFP表達(dá)的病毒轉(zhuǎn)染效率達(dá)到85%以上，并擴(kuò)大培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測BMSCs的NIPBL mRNA水平：首先建立分組，即空白組、空載體組、NIPBL沉默組，用Trizol試劑從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中提取總RNA，按照說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參數(shù)設(shè)置如下：42℃，60 min，70℃，5 min，4℃。此外，使用特異引物將cDNA用作擴(kuò)增模板。見表1。根據(jù)制造商的說明，使用羅氏LightCycler96實時熒光PCR儀進(jìn)行qRT-PCR。實驗參數(shù)為：95℃保溫2 min，95℃ 5 s，60℃ 20 s，循環(huán)30次，熔解階段。用2-ΔΔCt法計算NIPBL mRNA的相對表達(dá)水平，以β-actin作為對照。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.2.4成骨誘導(dǎo)：胰酶消化三組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板并調(diào)整細(xì)胞密度為10×104/cm2繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)密度達(dá)60%時用改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，每間隔3 d全量換液，分別在第7天、第21天觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5茜素紅染色：成骨誘導(dǎo)第21天，移液器轉(zhuǎn)移走6孔板中的成骨誘導(dǎo)液，并用PBS清洗3次，多聚甲醛2 ml固定細(xì)胞30 min后用PBS再次清洗3次，茜素紅按1 ml/孔緩慢加入，靜置30 min后吸去茜素紅染料，PBS沖洗3次，顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。

1.2.6qRT-PCR檢測成骨誘導(dǎo)后Lrp-5 mRNA的表達(dá)：用Trizol試劑提取三組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞總RNA，按照說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參數(shù)設(shè)置如下：42℃，60 min，70℃，5 min，4℃。此外，使用特異引物將cDNA用作擴(kuò)增模板(表1)。根據(jù)制造商的說明，使用羅氏LightCycler96實時熒光PCR儀進(jìn)行qRT-PCR。實驗參數(shù)為：95℃保溫2 min，95℃ 5 s，60℃ 20 s循環(huán)30 s，循環(huán)40次，熔解階段。用2-ΔΔCt法計算Lrp-5 mRNA相對表達(dá)水平，以β-actin作為對照。

1.2.7Western印跡檢測β-catenin蛋白的表達(dá)：將空白組、空載體組、NIPBL沉默組分別在相同條件下成骨誘導(dǎo)21 d，用RIPA裂解緩沖液提取三組細(xì)胞的總蛋白，總蛋白濃度用BCA法進(jìn)行測定，使三組蛋白濃度一致。經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，用5%脫脂牛奶封閉的PVDF膜在5%BSA中室溫孵育2 h，Tris-HCl緩沖鹽+Tween(TBST)洗滌液漂洗4次。加入一抗，4℃孵育過夜，再漂洗4次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗體，室溫孵育2 h，漂洗4次。用化學(xué)發(fā)光檢測底物電化學(xué)發(fā)光(ECL)工作液顯色，采用Image J圖像分析系統(tǒng)對蛋白顯影圖進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH為內(nèi)參，分析并比較三組β-catenin蛋白、p-β-catenin蛋白相對表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析：使用Graphpad Prism9.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，若各組間計量資料方差齊性且服從正態(tài)分布，采用單因素方差分析；若不服從正態(tài)分布或方差不齊，則選用秩和檢驗，P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NIPBL基因沉默的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞模型的建立及驗證：分別用陰性空載體、NIPBL+/-慢病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，嘌呤霉素篩選后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。見圖1。

注：a：空載體陰性慢病毒(GFP-BMSCs)轉(zhuǎn)染BMSCs；b：NIPBL沉默組慢病毒(NIPBL-BMSCs)轉(zhuǎn)染BMSCs圖1 陰性空載體、NIPBL+/-慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs

qRT-PCR驗證NIPBL低表達(dá)，結(jié)果表明，BMSCs空白對照組和慢病毒陰性對照組NIPBL mRNA的表達(dá)量相當(dāng)，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。沉默組NIPBL mRNA的表達(dá)與BMSCs空白對照組和慢病毒陰性對照組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖2。

注：①P<0.001圖2 RT-PCR檢測BMSCs NIPBL mRNA水平

2.2三組小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)過程中形態(tài)學(xué)變化及誘導(dǎo)21 d鈣顆粒的比較：三組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d時細(xì)胞逐漸變?yōu)椴灰?guī)則形，層次增加，貼合緊密，可見少量細(xì)胞結(jié)節(jié)；成骨誘導(dǎo)第21天三組細(xì)胞形態(tài)呈逐漸趨于圓形，有“鵝卵石” 樣改變，但NIPBL沉默組細(xì)胞顆粒量較低；茜素紅染色后顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)NIPBL沉默組的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯低于空白組、陰性組。見圖3。

注：a空白組成骨誘導(dǎo)7 d、21 d及茜素紅染色；b空載體組成骨誘導(dǎo)7 d、21 d及茜素紅染色；c NIPBL沉默組成骨誘導(dǎo)7 d、21 d及茜素紅染色圖3 空白組、空載體組及NIPBL沉默組成骨誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)變化及茜素紅染色

2.3沉默NIPBL基因可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞β-catenin蛋白的磷酸化：NIPBL沉默組與空載體組、空白組比較，NIPBL沉默使磷酸化β-catenin水平顯著升高(P<0.001)。但β-catenin總蛋白表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖4。

注：①P<0.001圖4 三組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21 d時β-catenin、p-β-catenin蛋白的表達(dá)

2.4Wnt/β-catenin通路因子Lrp-5在三組間的表達(dá)情況：空白組和空載體組Lrp-5 mRNA的表達(dá)量相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NIPBL沉默組的mRNA的表達(dá)與BMSCs空白對照組和慢病毒陰性對照組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖5。

注：①P<0.001圖5 RT-PCR檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21 d時 Lrp-5 mRNA水平

3 討論

CDLS是一種累及多系統(tǒng)尤以骨骼發(fā)育障礙最為顯著的遺傳性疾病并且影響兒童性格形成及心理健康發(fā)展，常表現(xiàn)為注意力缺陷、焦慮、自閉等[10]。CDLS在胎兒期間就開始發(fā)病[11]，新生兒CDLS的患病率為1∶10 000～30 000，但這很可能是低估了，因為較輕的病例可能無法識別[12]，因此對疾病的治療往往出現(xiàn)滯后，而且需要長期多學(xué)科聯(lián)合協(xié)作治療，這將明顯增加家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

NIPBL突變是導(dǎo)致CDLS發(fā)病最為重要的機(jī)制，它通過影響Cohesin復(fù)合物在DNA上的附著和脫落，Cohesin復(fù)合物與染色質(zhì)相互作用來維持染色體以及蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)姐妹染色單體聚集和細(xì)胞遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用，最終影響基因組修復(fù)和基因表達(dá)[13-15]。Maninder Kaur等[16]應(yīng)用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)與輕度患者和對照組相比，重度CDLS患者的NIPBL的表達(dá)水平較低，并且突變類型較嚴(yán)重患者的NIPBL水平也同樣較低。前期本課題組已證實NIPBL+/-小鼠胚胎時期(E17.5 d～E18.5 d)要比野生型同胞小鼠身長縮短 18%～19%，但它們的胎盤尺寸大小無明顯差異；同時，通過測量小鼠長骨及指骨發(fā)現(xiàn)骨長度縮短，而且有不同程度的骨化滯后。在剔除NIPBL 基因的小鼠胚胎的肢芽內(nèi)軟骨細(xì)胞區(qū)域被嚴(yán)重破壞，這均說明小鼠骨骼發(fā)育異常主要是由于NIPBL 突變導(dǎo)致[17]。本研究則進(jìn)一步從細(xì)胞層面證實了NIPBL沉默的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力明顯降低，與成體形態(tài)學(xué)的研究結(jié)論一致。

Wnt通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化以及維持成體干細(xì)胞多能狀態(tài)，參與動物發(fā)育和維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡[18]，其中調(diào)節(jié)干細(xì)胞成骨分化是最為重要的作用之一[19]。β-catenin是Wnt/β-catenin通路的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，通過進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，從而使各種靶激活因子表達(dá)，如果沒有信號的刺激，β-catenin則通過磷酸化方式被降解[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)，NIPBL沉默會降低β-catenin蛋白的表達(dá)，增加β-catenin蛋白的磷酸化水平。同時Wnt/β-catenin通路的共受體Lrp-5 mRNA的表達(dá)量也下降。

綜上，NIPBL沉默使β-catenin蛋白水平降低，但是β-catenin磷酸化蛋白的積累和總蛋白的降低只能間接表明β-catenin被抑制，本研究缺少NIPBL沉默而使β-catenin核轉(zhuǎn)位的直接證據(jù)，β-catenin必須通過核轉(zhuǎn)位來調(diào)控下游信號，從而發(fā)揮作用[21]。同時，Wnt/β-catenin通路的共受體Lrp-5 表達(dá)也有明顯下降，因此本實驗只能說明沉默NIPBL介導(dǎo)Wnt/β-catenin通路降低β-catenin的穩(wěn)定性來抑制成骨形成。從NIPBL基因沉默導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常為切入點，為德朗熱綜合征找到可能的治療靶點，進(jìn)而為CDLS骨骼發(fā)育異常的預(yù)防、治療提供新的理論依據(jù)。