馬 佳，趙 琳，黃永清

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.中衛(wèi)市人民醫(yī)院口腔科，寧夏 中衛(wèi) 755099)

成釉細(xì)胞瘤(AB)為最常見的牙源性上皮腫瘤，目前臨床外科手術(shù)為AB唯一的治療手段，手術(shù)可導(dǎo)致患者牙列缺損、喪失或病理性骨折，對患者身心造成極大的傷害及負(fù)擔(dān)[1]。因此，闡述該腫瘤的發(fā)病機(jī)制尋找早期的診斷方式具有一定的臨床意義。微小RNA(miR)-592過表達(dá)在體外顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲，并在體內(nèi)抑制腫瘤生長[2]；miR-21可通過參與調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[3-4]。miR-21、miR-592在AB中的研究還不明確，本研究試圖探討AB患者石蠟組織中的表達(dá)差異，分析它們在AB中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步尋找AB的分子標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料：收集2015年6月～2020年1月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬總醫(yī)院口腔頜面外科AB的患者，術(shù)中術(shù)后病理診斷為AB，光學(xué)顯微鏡下標(biāo)記AB組與自身瘤旁組織(對照組)各20例。患者均經(jīng)過影像學(xué)、病理學(xué)及其他各項(xiàng)檢查確診，排除其他腫瘤病史、遺傳病史，排除患者接受過放療、化療，排除無法滿足提供腫瘤及瘤旁組織的樣本且miRNA濃度<200 μg/ml。所有患者均有完整的臨床資料和病理資料，本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2方法

1.2.1主要試劑:石蠟包埋組織切片miRNA提取試劑盒購自天根生化有限公司，PrimeScriptTMRT試劑購自Takara，QuantiNova SYBR Green PCR Kit購自Qiagene,miR-21、miR-592、U6引物購自生工生物有限公司。

1.2.2引物序列:利用miRNA序列數(shù)據(jù)庫找到人類miR-21、miR-592序列，由生工合成反轉(zhuǎn)錄引物和PCR上下游引物。miR-21莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3′，上游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′,下游引物5′-GCGCGTAGCTTATCAGACTGA-3′；miR-592莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA CACATCA-3′，上游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′,下游引物5′-CGCGTTGTGTCAATATGCGA-3′；U6莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT GGATACGACAAAATA-3′，上游引物5′-ATCCAGTGCAGG GTCCGAGG-3′,下游引物5′-AGAGAAGATTAGCATGGCCC CTG-3′。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄CDNA(complementary DNA，互補(bǔ)DNA)鏈的合成:根據(jù)FFPE(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，甲醛溶液固定后的石蠟組織)提取miRNA試劑盒DP502說明書提取miRNA。分光光度儀測量RNA濃度和質(zhì)量，-80℃保存；按照 TAKARA 說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系, 以500 μmol/L計(jì)算加入RNA的體積，配置莖環(huán)原液，總體系為10 μl,全程置于冰上。 42℃ 15 min、85℃ 5 min、4℃ 1 min合成 cDNA,-20℃保存。

1.2.4熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測:2×QuantiNova SYBR PCR混合液10 μl、QN ROX參考染色劑0.1 μl、引物A、B各1.4 μl、cDNA 2.0 μl、無酶水5.1 μl,反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)條件為95℃ 5 min預(yù)變性，95℃ 5 s、60℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)后采集熒光信號(hào)，熔解曲線由儀器自動(dòng)設(shè)置。

2 結(jié)果

2.1AB組與對照組miR-21表達(dá)水平比較:AB組與對照組中miR-21平均表達(dá)量值分別為：19.50±0.48，21.78±0.17，以對照組miR-21相對表達(dá)量為1，AB組miR-21表達(dá)水平是對照組的23.72倍，且基因表達(dá)上調(diào)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注：與對照組比較，①P<0.01圖1 miR-21在AB組與對照組的表達(dá)

2.2AB組與對照組miR-592表達(dá)水平比較:AB組與對照組中miR-592平均表達(dá)量值分別為：24.27±0.38，29.86±0.86，以對照組miR-592相對表達(dá)量為1，AB組miR-592基因表達(dá)水平是對照組的2.58倍，且基因表達(dá)上調(diào)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：與對照組比較,①P<0.01圖2 miR-592在AB組與對照組的表達(dá)

2.3AB組miR-21、miR-592在不同年齡、性別分組間表達(dá)水平比較：miR-21、miR-592與AB組0～30歲、31～60歲、>60歲、男女分組表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 AB組不同年齡、性別患者與miR-21、miR-592表達(dá)量的比較

2.4miR-21、miR-592及內(nèi)參U6表達(dá)：miR-21、592及U6的qRT-PCR顯示其擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)S型，有明確的基線期、平臺(tái)期、指數(shù)期；qRT-PCR熔解曲線均為單峰；說明實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的目的基因特異性強(qiáng)。見圖3～4。

圖3 miR-21及U6 qRT-PCR熔解曲線及擴(kuò)增曲線

圖4 miR-592及U6 qRT-PCR熔解曲線及擴(kuò)增曲線

3 討論

AB多發(fā)生于青壯年，以下頜體及下頜角為常見，可使頜骨膨大，吸收頜骨外側(cè)骨板，因具有侵襲性AB被視為“臨界瘤”。miRNA參與生命體的增殖、分化、生長及凋亡等多種過程，發(fā)揮著類似癌基因和抑癌基因的功能[5]。

miR-21在多種腫瘤中被證實(shí)表達(dá)上調(diào)，且為PTEN的靶基因[6-7]，在骨肉瘤中，PTEN與MMP-2呈負(fù)相關(guān)[8]；轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是miR-592的直接靶基因。目前研究表明在AB中TGF-β1與MMP-2呈正相關(guān)，且可以通過上調(diào)MMP-2從而促進(jìn)AB的發(fā)生、發(fā)展[9]。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)AB中MMP-2的miRNA顯著高于正常牙囊組織，復(fù)發(fā)性AB的MMP-2與膜1型金屬蛋白酶(MT1-MMP)mRNA(信使RNA)顯著高于原發(fā)性AB，MMP在AB中被證實(shí)與AB的高度局部侵襲性有密切關(guān)系。在本研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-21、miR-592在AB組與對照組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其表達(dá)水平顯著上調(diào)，這與miR-21、miR-592在其他腫瘤中表達(dá)水平研究結(jié)果一致，推測miR-21、miR-592的表達(dá)上調(diào)可能與AB的侵襲性有關(guān)，而患者一般情況分組間沒有差異。

本研究中采用了從FFPE提取miRNA，一般情況下FFPE中miRNA是可穩(wěn)定存在，有學(xué)者將匹配好7對的FFPE和新鮮冰凍組織進(jìn)行 miRNA濃度檢測，相關(guān)指數(shù)為0.847～0.948[10]；FFPE的優(yōu)點(diǎn)：提取的miRNA與冰凍組織樣本相同，可提供可信的表達(dá)譜[11-12]。本研究中，F(xiàn)FPE組織提取的miR-21、miR-592顯示出正常的熔解曲線和擴(kuò)增曲線，也證明了FFPE組織中提供的miRNA表達(dá)譜可信。