李永樂(lè),楊 恒,汪 淵,郝志強(qiáng),王敬珅,錢 彪

(1.石河子大學(xué)，新疆 石河子 832000；2.東營(yíng)市人民醫(yī)院，山東 東營(yíng) 257000；3.聊城市第二人民醫(yī)院，山東 聊城 252000；4.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江西 贛州 341000)

腎結(jié)石作為泌尿系統(tǒng)的常見(jiàn)病與多發(fā)病，嚴(yán)重影響人們的工作及生活，有流行病學(xué)研究顯示，泌尿系結(jié)石的患病率及發(fā)病率逐年遞增[1]，其中原因包括醫(yī)療診治技術(shù)的提高和人民生活水平及生活方式的改變，而且，晶體的聚集及生長(zhǎng)誘導(dǎo)腎損傷病理形成和晶體物質(zhì)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的刺激有直接的關(guān)聯(lián)，在有些晶體物質(zhì)的刺激下，腎小管細(xì)胞對(duì)其做出氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，更容易加速腎結(jié)石的形成與發(fā)展。近幾年發(fā)展過(guò)程中，很多研究表明腎結(jié)石患者發(fā)生代謝性疾病的可能性相應(yīng)增加，即部分代謝性疾病的發(fā)生和結(jié)石有直接的關(guān)聯(lián)。機(jī)體的微炎性反應(yīng)狀態(tài)、氧化應(yīng)激激活的發(fā)生也會(huì)對(duì)腎結(jié)石的發(fā)生產(chǎn)生影響，腎臟疾病的發(fā)病率上升。腎小管上皮細(xì)胞在晶體物質(zhì)的刺激作用下，會(huì)分泌一些物質(zhì)，其中最主要的物質(zhì)就是骨橋蛋白(OPN)。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，OPN是結(jié)石基質(zhì)蛋白的主要成分，是一種存在于人體鈣化腎結(jié)石中的糖蛋白，OPN作為草酸鈣結(jié)石中含量最為豐富的蛋白之一，與腎結(jié)石的聚集形成有一定的相關(guān)性[2]。OPH可進(jìn)一步誘導(dǎo)炎性細(xì)胞如單核-巨噬細(xì)胞遷移到病變部位，從而加重結(jié)晶部位的炎性反應(yīng)，引起惡性循環(huán)。通過(guò)研究已知結(jié)晶的形成是一種生物礦化的過(guò)程，骨OPH參與這一過(guò)程并發(fā)揮重要作用。

OPN是草酸鈣結(jié)石基質(zhì)的重要成分[3]，可能通過(guò)促進(jìn)晶體黏附及介導(dǎo)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡促進(jìn)結(jié)石的形成[4]。對(duì)OPN與腎結(jié)石形成機(jī)制的研究，有助于為腎結(jié)石尋找新的預(yù)防及治療靶點(diǎn)，李征等研究[5]表明，血清OPN水平及尿液滲透壓升高可導(dǎo)致兒童腎結(jié)石的發(fā)生。OPN作為腎結(jié)石中的一種重要基質(zhì)蛋白，其通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)草酸鈣晶體黏附于腎小管上皮[6]，且OPN的強(qiáng)陰離子活性，使其能容易與尿液中的Ca2+結(jié)合，成為草酸鈣晶體聚集的促進(jìn)劑，導(dǎo)致鈣鹽沉積，誘發(fā)腎結(jié)石的形成[7]。

Igor Tamm和Frank Horsfall首先從正常人尿液中分離純化出一種能抑制病毒誘導(dǎo)血凝的黏液糖蛋白并命名為Tamm-Horsfall蛋白(THP)[8]，THP又稱為尿調(diào)節(jié)蛋白，是腎臟髓袢升支粗段和遠(yuǎn)側(cè)曲管所合成并分泌的一種蛋白，經(jīng)后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，這種蛋白不僅對(duì)T細(xì)胞增殖和單核細(xì)胞毒性具有體外免疫抑制的作用[8]，人們還推測(cè)出THP的其他生理作用，主要有參與介導(dǎo)鹽和水潴留、從而預(yù)防高血壓、預(yù)防腎結(jié)石形成、預(yù)防尿路感染以及可能在腎臟損傷中的作用。它自身的物理結(jié)構(gòu)決定它在酸性介質(zhì)中常以凝膠的形式存在，即尿液中透明管型的主要組成成分。

THP在尿中的排泄量較少，且受多種疾病的影響，如泌尿系梗阻、腎小管間質(zhì)性腎炎、腎移植排斥反應(yīng)等有著重要關(guān)系，當(dāng)尿液及血清中檢測(cè)到高濃度的THP及抗THP抗體時(shí)常見(jiàn)于泌尿系梗阻及腎移植排斥反應(yīng)[9]。THP可與中性粒細(xì)胞膜表面的整合素結(jié)合，導(dǎo)致腎小管間質(zhì)細(xì)胞中炎性細(xì)胞聚集，這些炎性細(xì)胞產(chǎn)生的炎性反應(yīng)因子和蛋白酶，可引起細(xì)胞組織損傷和細(xì)胞的吞噬作用[10-11]。當(dāng)腎小管管腔內(nèi)壓力增高或腎小管上皮細(xì)胞損傷時(shí)，分泌的THP經(jīng)過(guò)破損的腎小管漏入腎小管管腔內(nèi)，導(dǎo)致管腔內(nèi)THP大量堆積，形成THP 管型，是造成腎功能衰竭的因素之一。酸性尿液、鈣離子、造影劑等都會(huì)造成THP的聚集[12]。上述研究表明 THP與腎小管損傷、炎性反應(yīng)和鈣鹽晶體形成有著密切的聯(lián)系。也有體外試驗(yàn)表明，高滲狀態(tài)、酸性條件(H+)和THP本身濃度的增加會(huì)促進(jìn)THP的聚集，從而引起凝膠的形成，繼而就會(huì)形成透明的管型甚至腎結(jié)石。因此，THP不僅能促進(jìn)草酸鈣晶體形成，且在某些病理?xiàng)l件下參與了尿石癥的發(fā)病機(jī)制[13]。

國(guó)內(nèi)外均有研究表明，THP在代謝性疾病合并腎結(jié)石疾病中，有重要參考價(jià)值與意義。隋艷斐等研究[14]發(fā)現(xiàn)：糖尿病腎病中，可以將THP、α1-MG、β2-MG作為患者腎臟早期受損的重要指標(biāo)。而在原發(fā)性高血壓合并腎結(jié)石的形成過(guò)程中，也有相關(guān)研究表明：THP為膀胱黏膜層中含量最多的且具有保護(hù)功能的尿糖蛋白，但是THP也是腎小管鑄型的主要成分，THP聚集已被認(rèn)為是引起腎小管梗阻的急性腎功能衰竭發(fā)病機(jī)制的因素。本研究試圖通過(guò)納米細(xì)菌建立腎結(jié)石模型，動(dòng)態(tài)觀察納米細(xì)菌腎結(jié)石的形成過(guò)程中OPN、THP的表達(dá)及與腎結(jié)石的相關(guān)性研究。

1 材料與方法

1.1材料：新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)Wistar雄性大鼠[合格證號(hào)：SCXK(新)2013-0001]，常規(guī)飼養(yǎng)6周后，篩選出90只體重約為(200±20) g的大鼠，基本飼料(石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，10%中性福爾馬林(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科贈(zèng))，四環(huán)素(四川科倫藥業(yè))，TG(Biofroxx)，電轉(zhuǎn)液、PBS(國(guó)藥化學(xué)試劑公司)，蛋白marker(10～250 kD)(海利克思)，PVDF膜(0.45 μm)、ECL底物液(美國(guó)羅氏公司)，兔多抗GAPDH(37 kD)、羊多抗OPN(25 kD)、兔多抗THP(121 kD)、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記兔抗羊二抗(Cell Signaling Technology)。

1.2方法：參考本課題組之前用納米細(xì)菌建立腎結(jié)石模型的方法建立模型后隨機(jī)分組：納米細(xì)菌組(NB組)：Wistar大鼠尾靜脈注射納米細(xì)菌懸液1.2 ml+2 ml生理鹽水灌胃；抗納米細(xì)菌組(NBT組)：Wistar大鼠尾靜脈注射納米細(xì)菌懸液1.2 ml+2 ml四環(huán)素溶液灌胃；對(duì)照組(NC組)：Wistar大鼠尾靜脈注射生理鹽水1.2 ml+2 ml生理鹽水灌胃，基本飼料標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)1周后，每周每組隨機(jī)抽取3只大鼠，無(wú)菌采集腎臟標(biāo)本后處死，共計(jì)10周。運(yùn)用Western印跡檢測(cè)大鼠腎臟組織中OPN、THP的表達(dá)量并分析結(jié)果。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用ImageJ測(cè)量目的條帶灰度值，相同時(shí)間段的組間比較用One-way ANOVA-LSD方差分析，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠腎臟組織中OPN表達(dá)量結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果取各組大鼠腎臟，采用Western印跡檢測(cè)其OPN蛋白表達(dá)含量。以第8周為例，試驗(yàn)結(jié)果較好，可見(jiàn)條帶清晰，內(nèi)參穩(wěn)定，X線片上，NB組、NBT組、NC組均可見(jiàn)清晰地黑色條帶，表明三組大鼠中均有OPN蛋白表達(dá)，但其表達(dá)量有所差別，NBT組OPN蛋白含量最高，NC組次之，NB組大鼠腎臟組織中OPN蛋白表達(dá)最低，對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果顯示NB組、NBT組和NC組三組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：與NC組比較，①P<0.05;與NBT組比較，②P<0.05圖1 三組大鼠腎臟組織中OPN蛋白表達(dá)對(duì)比

2.2各組大鼠腎臟組織中THP表達(dá)量結(jié)果:以第8周為例檢測(cè)三組大鼠腎臟THP蛋白的表達(dá)含量，X線片上，NB組條帶顏色較淺，NBT組、NC組均可見(jiàn)清晰地黑色條帶，由此可見(jiàn)三組大鼠中TH蛋白表達(dá)量有所不同，NB組大鼠腎臟組織中THP含量最低，NC組THP表達(dá)居中，NBT組大鼠腎小管上皮細(xì)胞THP分泌最多，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果，NB組、NBT組和NC組三組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注：與NC組比較，①P<0.05;與NBT組比較，②P<0.05圖2 三組大鼠腎臟組織中THP蛋白表達(dá)對(duì)比

2.3OPN、THP相關(guān)性分析結(jié)果:對(duì)兩種蛋白利用Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，所研究的兩種蛋白OPN與THP聯(lián)系緊密，增長(zhǎng)趨勢(shì)具有一致性，二者極強(qiáng)相關(guān)(r=0.951，P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 OPN與THP的相關(guān)性分析

3 討論

腎結(jié)石是泌尿系統(tǒng)結(jié)石的主要組成部分之一，由于結(jié)石易復(fù)發(fā)、病情反復(fù)且并發(fā)癥多，已成為很多患者嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。目前腎結(jié)石的形成機(jī)制仍不清楚，既往觀點(diǎn)認(rèn)為腎結(jié)石的形成過(guò)程包括尿液過(guò)飽和、晶體核心形成、晶體成長(zhǎng)及聚集，然而目前越來(lái)越多的研究者強(qiáng)調(diào)腎小管上皮細(xì)胞與結(jié)石晶體間的相互影響[15]。有研究表明，聯(lián)合分析尿液中OPN與THP的含量，可作為腎結(jié)石早期診斷的標(biāo)志物[16]，研究顯示，體外鈣刺激大鼠腎臟上皮細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞OPN基因表達(dá)上調(diào)，OPN分泌增加[17]。而OPN的過(guò)度表達(dá)，能刺激機(jī)體分泌前列腺素，單核細(xì)胞趨化蛋白-1等一系列多種炎性因子，在局部產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而誘發(fā)炎性反應(yīng)，造成晶體的沉積與鈣化[18]。張杰[19]通過(guò)體外構(gòu)建人腎小管上皮細(xì)胞結(jié)晶腎損傷模型證實(shí)LncRNA MALATI通過(guò)吸附miR-127-Sp調(diào)控OPN并影響細(xì)胞增殖及黏附活性進(jìn)而參與草酸鈉結(jié)晶腎損傷的發(fā)生過(guò)程，能為晶體刺激腎臟細(xì)胞導(dǎo)致腎臟損傷提供有力證據(jù)，另一方面Yamate等[20]也證實(shí)在腎結(jié)石形成的早期階段，OPN具有促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶在細(xì)胞上沉積和黏附的作用，通過(guò)減低OPN表達(dá)可抑制草酸鈣晶體的沉積。因此，結(jié)石形成早期階段，OPN可能促進(jìn)了NRK與草酸鈣結(jié)晶體的結(jié)合過(guò)程。

OPN作為腎結(jié)石的主要基質(zhì)蛋白，一方面可促進(jìn)晶體聚集、黏附、沉積，從而加速結(jié)石的形成，另一方面它的過(guò)度表達(dá)可誘發(fā)集體產(chǎn)生眾多炎性反應(yīng)因子，引起腎臟慢性炎性反應(yīng)，進(jìn)一步造成晶體的沉積。腎臟慢性炎性反應(yīng)的誘發(fā)，可引起腎臟功能的損傷，從而導(dǎo)致電解質(zhì)代謝紊亂，進(jìn)而誘發(fā)晶體的過(guò)飽和、沉積；大量晶體聚集和黏附，長(zhǎng)期導(dǎo)致結(jié)石的形成，結(jié)石形成又會(huì)引起腎臟慢性炎性反應(yīng)，如此循環(huán)，加快結(jié)石的形成和腎臟的損傷。

THP是人體尿液中的一種特異性陰離子蛋白，主要由腎小管上皮細(xì)胞分泌，混合于尿液中作為代謝廢物經(jīng)尿道排出體外[21]。有報(bào)道稱，THP蛋白是草酸鈣晶體形成的抑制劑，是預(yù)防腎結(jié)石和腎集合系統(tǒng)感染的首道防線[22]。尿液THP、NGAL、血清Cys C與β2-MG可作為CKD患者早期評(píng)價(jià)GFR的敏感指標(biāo)，聯(lián)合NGAL、THP作聯(lián)合預(yù)測(cè)因子可提高早期診斷腎損害的靈敏度及特異性，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)CKD患者腎小管損傷并評(píng)估其損害程度有重要的臨床意義[23]。所以THP可以在腎臟早期損傷中作為重要觀察指標(biāo)，正常生理情況下，THP蛋白可對(duì)腎小管上皮細(xì)胞起到保護(hù)作用，其強(qiáng)烈的抗氧化作用，可有效減少氧自由基和過(guò)氧化物的產(chǎn)生，削弱腎臟組織局部氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕腎小管上皮細(xì)胞的損傷，降低結(jié)石的形成，而在腎結(jié)石患者尿液中，這種抑制作用卻很弱，難以起到防治腎結(jié)石形成的作用[24]。

OPN與THP兩種蛋白均與腎結(jié)石的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，研究表明，通過(guò)結(jié)合分析尿液中OPN與THP的含量，可作為腎結(jié)石早期診斷的標(biāo)志物，且特異性高、敏感度好[16]。

綜上所述，OPN與THP均參與腎結(jié)石的形成與發(fā)展，且在腎結(jié)石患者中都有較高表達(dá)，OPN通過(guò)加速晶體黏附及聚集并參與體內(nèi)氧化應(yīng)激、誘發(fā)慢性炎性反應(yīng)，從而引起腎結(jié)石的形成與發(fā)展；THP作為腎臟分泌的糖蛋白，生理?xiàng)l件下可參與體內(nèi)水鹽，預(yù)防高血壓、腎結(jié)石的形成等，但在某些病理?xiàng)l件下大量THP產(chǎn)生、潴留可引起腎臟管型析出，進(jìn)而引起腎結(jié)石的形成。本研究結(jié)果顯示OPN、THP蛋白在三組大鼠中均有表達(dá)，因?yàn)镺PN、THP蛋白作為尿液中正常的成分而存在，因此即使對(duì)照組無(wú)誘石因素的存在，依然可以檢測(cè)到一定表達(dá)，但是三組表達(dá)量卻差異明顯，其中NBT組大鼠腎臟組織中表達(dá)最高，NB組含量最低，可能是因?yàn)樗沫h(huán)素的抗菌作用，大鼠機(jī)體自身反饋調(diào)節(jié)，抑石物質(zhì)表達(dá)增加，而NB組由于納米細(xì)菌對(duì)大鼠腎臟組織的損害，使OPN、THP表達(dá)減少，腎臟組織局部炎性反應(yīng)明顯。

根據(jù)Pearson系數(shù)等級(jí)劃分，相關(guān)系數(shù)在0.8～1.0之間為極強(qiáng)相關(guān)，在0.6～0.8之間為強(qiáng)相關(guān)，代表腎臟局部炎性反應(yīng)程度的兩種蛋白OPN與THP聯(lián)系緊密，增長(zhǎng)趨勢(shì)具有一致性，二者極強(qiáng)相關(guān)(r=0.951，P<0.01)。

綜上所述，OPN、THP兩種大分子蛋白屬于尿液中的正常成分，二者作為抑石物質(zhì)而發(fā)揮其功能。尿液中OPN的作用是通過(guò)抑制草酸鈣結(jié)晶的聚集、減小結(jié)晶體積、降低晶體黏附性等方面，從而有效抑制結(jié)石的形成。THP則通過(guò)抑制鈣鹽成核生長(zhǎng)、競(jìng)爭(zhēng)性與鈣離子結(jié)合等方式抑制結(jié)石形成。納米細(xì)菌對(duì)大鼠腎臟的影響可能是：使腎臟抑石成分分泌不足，達(dá)不到抑制結(jié)石形成的有效濃度，因此NB組大鼠腎臟組織中OPN、THP含量較低，由此可見(jiàn)體內(nèi)抑石物質(zhì)的缺乏是腎結(jié)石的主要形成原因之一。

OPN和THP在尿液中的早期可檢測(cè)性可以在早期腎結(jié)石患者的形成所致腎損傷提供參考依據(jù)，OPN和THP的實(shí)時(shí)檢測(cè)可為人們?cè)陬A(yù)防腎結(jié)石的形成與發(fā)展中起到重要作用，這也將為如何利用OPN和THP防治腎結(jié)石及腎臟慢性損傷提供新的思路。