趙宏偉，王 皓，陳子琪，鄭洪亮，劉化龍，韓笑,2，楊洛淼，辛威，王敬國

（1.東北農(nóng)業(yè)大學，寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點實驗室，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院佳木斯水稻研究所，黑龍江 佳木斯 154026）

水稻是重要糧食作物，具有較高產(chǎn)量潛力，對滿足我國糧食需求非常重要[1]。直播稻作為輕簡化栽培方式，免去育苗、移栽等操作，具有節(jié)約土地面積、降低勞動成本等優(yōu)點，占我國水稻播種面積10%以上[2]。由于直播稻長期處于淹水條件，播種期較早，對品種耐低氧和耐低溫能力要求較高，易受發(fā)芽期和芽期低溫冷害影響，常出現(xiàn)發(fā)芽率低、成苗率低和出苗不整齊現(xiàn)象，影響水稻直播技術(shù)應(yīng)用[3]。定位影響水稻發(fā)芽期和芽期耐冷性基因位點，對解析耐冷性遺傳基礎(chǔ)、開發(fā)特異分子標記、創(chuàng)制耐冷新種質(zhì)、保證水稻安全生產(chǎn)具有積極意義。

數(shù)量性狀個體間差異微小，呈連續(xù)變異，受環(huán)境因素影響較大[4]。楊梯豐等研究表明，水稻耐冷性受多個QTL控制，不同時期可能存在不同耐冷性QTL[5]。姚曉云等以龍稻5號和中優(yōu)早8為親本構(gòu)建RIL群體，在2、7、8、11、12號染色體上檢測到5個與發(fā)芽率相關(guān)QTL，表型貢獻率為6.41%~9.41%[6]。王琪等利用瀘恢99和沈農(nóng)265雜交衍生重組自交系群體，以發(fā)芽率為指標，檢測到2個與發(fā)芽期耐冷性相關(guān)QTL位點，其中qLTG-5表型貢獻率最大（14.07%）[7]。宋佳利用295個水稻品種組成的自然群體為試驗材料，在第4、6、8號染色體上共檢測到4個與相對發(fā)芽勢相關(guān)QTL，其中qLTGP4-1貢獻率最大（10.87%）[8]。任永梅利用IR36和J07-23為親本構(gòu)建回交重組自交系群體，在第1、2、3、5、6、7、9、11號染色體上，檢測到12個與平均發(fā)芽天數(shù)相關(guān)QTL[9]。楊洛淼等以粳稻品種空育131和東農(nóng)422為親本，構(gòu)建190個家系重組自交系群體，在6號和12號染色體上分別檢測到1個與發(fā)芽峰值和發(fā)芽系數(shù)相關(guān)QTL[10]。張露霞等以Asominori和IR24為親本構(gòu)建重組自交系群體，在第5、12號染色體上檢測到3個與芽期耐冷性相關(guān)QTL[11]。Luo等利用229個株系回交重組自交系，檢測到15個與低溫存活率和死亡率相關(guān)QTL，分別位于6、7、8、11、12號染色體上，可解釋5.99%~40.07%表型變異[12]。劉欣等以耐冷性差異明顯的藤坂5號和江西絲苗為親本，構(gòu)建137個株系F2代分離群體，在8號和11號染色體上檢測到2個與耐冷級別相關(guān)QTL[13]。Chen等利用Zhenshan97B和AAV002863構(gòu)建DH群體，以發(fā)芽率為指標，在1號和10號染色體上檢測到一對上位性QTL，占表型變異5.96%[14]。劉睿琦等利用五豐B和昌恢T025雜交衍生重組自交系群體，以芽期存活率為指標，檢測到12對上位性互作QTL，貢獻率為4.68%~4.76%[15]。

綜上，前人對水稻發(fā)芽期和芽期耐冷性研究已取得一定進展，主要以秈粳雜交衍生RIL群體為試驗材料，對粳粳雜交衍生RIL群體相關(guān)研究較少。本試驗以耐冷性較強粳稻品種空育131為母本和耐冷性較弱粳稻品種小白粳子為父本雜交衍生含有195個株系的RIL群體為試驗材料，結(jié)合遺傳圖譜，檢測發(fā)芽期和芽期耐冷性QTL，以期發(fā)現(xiàn)控制水稻發(fā)芽期和芽期耐冷性QTL，為解析耐冷性遺傳基礎(chǔ)、開發(fā)特異分子標記、創(chuàng)制耐冷新種質(zhì)提供依據(jù)，推動水稻直播生產(chǎn)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以粳稻品種空育131為母本，粳稻品種小白粳子為父本，通過“單粒傳”法雜交衍生含有195個株系RIL群體為試驗材料。

1.2 遺傳圖譜構(gòu)建

采用CTAB法提取RIL群體和親本DNA[16]，由博睿迪生物公司采用10K Array基因芯片進行分析，去除冗余標記，將基因型相同且連續(xù)的單核苷酸多態(tài)性標記記為一個Bin標記。使用QTL Ici-Mapping 4.2軟件MAP功能構(gòu)建遺傳圖譜。

1.3 發(fā)芽期耐冷性鑒定

采用高溫干燥方法打破RIL群體和親本休眠，1%次氯酸鈉浸種消毒30 min并用蒸餾水清洗2~3次，選取100粒飽滿種子置于墊有濾紙培養(yǎng)皿中，放入13℃恒溫培養(yǎng)箱中低溫處理，另選取100粒飽滿種子采用相同處理作為對照，設(shè)置3次重復。種子萌發(fā)標準參考Wang等方法[17]，記錄每日發(fā)芽數(shù)，直至連續(xù)3 d發(fā)芽數(shù)為0結(jié)束。參照周志彬等方法測定相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢、平均發(fā)芽天數(shù)和發(fā)芽系數(shù)[18]。

1.4 芽期耐冷性鑒定

從RIL群體和親本中分別選取100粒飽滿種子置于墊有濾紙培養(yǎng)皿中，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽，待芽長5~8 mm時，選取長勢一致種子48粒，參考陳子琪等方法播種[19]，放入3℃培養(yǎng)箱中低溫處理10 d，再放入26℃光照培養(yǎng)箱中恢復7 d，設(shè)置3次重復。采用韓龍植等方法測定成苗率[20]，采用姜樹坤等方法測定耐冷級別[21]。

1.5 QTL分析

利用QTL IciMapping4.2軟件進行QTL定位，以LOD值≥2.5作為判斷加性QTL是否存在的閾值，以LOD值≥5作為上位性QTL是否存在的閾值，采用McCouch方法作QTL命名[22]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0作單因素方差分析，使用Origin 2021繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

基于527個Bin標記，使用JoinMap 4.0構(gòu)建長度為1 875.57 cM連鎖圖譜，標記間距離平均值為3.56 cM。3號染色體標記數(shù)最少，1號染色體標記數(shù)最多，分別為24個和79個；12號染色體上標記間平均距離最短，僅為2.27 cM，3號染色體上標記間平均距離最長，為8.13 cM（見圖1和表1）。

表1 染色體標記信息Table 1 Bin markers locating on chromosomes

圖1 耐冷性相關(guān)QTL在染色體上分布情況Fig.1 Chromosome distribution of QTL related to cold tolerance

2.2 發(fā)芽期和芽期耐冷表型分析

親本空育131耐冷性強于小白粳子，二者在發(fā)芽期相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢、平均發(fā)芽天數(shù)、發(fā)芽系數(shù)、芽期成苗率、耐冷級別等指標上均差異顯著。RIL群體中各株系發(fā)芽期和芽期相關(guān)指標均呈連續(xù)分布，且存在明顯超親分離現(xiàn)象。耐冷級別變異系數(shù)最大（27.56%），發(fā)芽系數(shù)變異系數(shù)最?。?2.68%）。發(fā)芽期相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢、平均發(fā)芽天數(shù)和發(fā)芽系數(shù)及芽期成苗率、耐冷級別偏度和峰度絕對值大部分小于1，說明各指標表型數(shù)據(jù)基本符合正態(tài)分布規(guī)律（見表2和圖2）。

圖2 發(fā)芽期和芽期耐冷性分布Fig.2 Distribution of cold tolerance at germination and bud stages

表2 發(fā)芽期和芽期耐冷性在親本和RIL群體中分布情況Table 2 Distribution of cold tolerance in parents and RIL populations at germination and bud stages

2.3 發(fā)芽期和芽期耐冷性表型相關(guān)分析

發(fā)芽期和芽期耐冷性各性狀間相關(guān)分析表明：相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽系數(shù)間均呈極顯著正相關(guān)，與發(fā)芽天數(shù)呈極顯著負相關(guān)。成苗率和耐冷級別均與相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽系數(shù)呈負相關(guān)，與平均發(fā)芽天數(shù)呈正相關(guān)。成苗率與耐冷級別呈極顯著正相關(guān)（見圖3）。

圖3 發(fā)芽期和芽期耐冷性相關(guān)分析Fig.3 Correlation analysis of cold tolerance between germination and bud stages

2.4 發(fā)芽期和芽期耐冷性QTL定位

發(fā)芽期和芽期耐冷性相關(guān)分析結(jié)果如表3所示。檢測到7個與發(fā)芽期耐冷性相關(guān)QTL，分別控制芽期相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢、平均發(fā)芽天數(shù)和發(fā)芽系數(shù)，可解釋4.25%~8.30%表型變異。qRGR3和qGE6分別控制相對發(fā)芽率和發(fā)芽勢，可解釋8.30%和7.38%表型變異，增效等位基因均來源于空育131?？刂破骄l(fā)芽天數(shù)的4個QTL中，qAGD1和qAGD2增效等位基因來源于小白粳子，qAGD7和qAGD11增效等位基因來源于空育131，以上4個位點可解釋表型變異26.09%。與發(fā)芽系數(shù)相關(guān)qGC3可解釋表型變異7.03%，增效等位基因來源于空育131。

表3 水稻發(fā)芽期和芽期耐冷性相關(guān)QTLTable 3 QTL related to cold tolerance at germination and bud stages of rice

檢測到3個與芽期耐冷性相關(guān)QTL，分別控制水稻成苗率和耐冷級別，其中1個與成苗率有關(guān)，2個與耐冷級別有關(guān)?？刂蒲科诔擅缏蕅SSR7，其增效等位基因來源于空育131，可解釋8.38%表型變異。控制耐冷級別的qCTL3和qCTL7，可解釋14.1%表型變異，其增效等位基因均來源于空育131（見表3）。發(fā)芽期和芽期共檢測到10個耐冷性相關(guān)QTL，其中貢獻率大于7.00%有7個，說明水稻耐冷性由多個具有加性效應(yīng)QTL控制?？刂瞥擅缏实膓SSR7及控制耐冷級別的qCTL7均位于7號染色體C7_179537~C7_5442924區(qū)間，說明該區(qū)間同時調(diào)控芽期成苗率和耐冷性。

2.5 上位性QTL定位

檢測到1對與發(fā)芽期發(fā)芽系數(shù)相關(guān)上位性位點，表型貢獻率為14.26%，可使發(fā)芽系數(shù)降低0.29。檢測到3對與芽期相關(guān)上位性位點，其中1對與成苗率有關(guān)，表型貢獻率為17.04%，上位性效應(yīng)為3.96。另2對與耐冷級別有關(guān)，表型貢獻率分別為4.52%和5.24%，上位性效應(yīng)值分別為-0.37和0.14（見表4）。

表4 水稻發(fā)芽期和芽期耐冷性上位性位點Table 4 Epistatic sites of cold tolerance at germination and bud stages of rice

3 討論

水稻發(fā)芽期和芽期低溫脅迫影響水稻產(chǎn)量和直播生產(chǎn)發(fā)展[26]。本試驗利用培養(yǎng)箱模擬空氣低溫，處理重組自交系群體，探究低溫脅迫對水稻發(fā)芽期相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢、平均發(fā)芽天數(shù)、發(fā)芽系數(shù)和芽期成苗率、耐冷級別的影響，挖掘耐冷性相關(guān)QTL，有利于耐冷性品種選育，保障水稻安全生產(chǎn)。Wang等在研究水稻耐冷性時，常將發(fā)芽期和芽期統(tǒng)稱為芽期[27]，本試驗對兩個時期分別研究耐冷性，以期發(fā)現(xiàn)共同位點。秈稻和粳稻生物學下限溫度分別為12℃和10℃，因此以往研究中常以秈粳雜交的重組自交系群體為試驗材料[7]，而本試驗以黑龍江省大面積種植粳稻品種為親本，使鑒定的耐冷性位點更適用于黑龍江省水稻育種。

發(fā)芽期和芽期耐冷基因挖掘已取得一定進展，但低溫處理的溫度和時間差異較大。Wang等以IR28和Daguandao衍生RIL群體為試驗材料，在14℃條件下處理23 d，檢測與發(fā)芽率和發(fā)芽勢相關(guān)位點[27]。鄧浩東等以秈稻9311和日本晴為親本構(gòu)建的CSSLs群體為試驗材料，在7℃條件下處理7 d，檢測與存活率相關(guān)位點[28]。本研究設(shè)置發(fā)芽期12、13和14℃和芽期2、3、4℃預(yù)試驗，結(jié)果表明RIL群體在較高溫度下發(fā)芽率和成苗率差異較小，而在較低溫度下發(fā)芽率和成苗率過低，因此發(fā)芽期13℃和芽期3℃為本試驗?zāi)屠湫澡b定最適條件。姜樹坤等以LTH和SN265衍生的144個株系重組自交系為試驗材料，于2℃條件下處理2 d，轉(zhuǎn)移至20~30℃條件下恢復10 d，調(diào)查成苗率[21]。本試驗分別設(shè)置芽期2、3和4℃下低溫處理10 d，在26℃下恢復7 d并測定成苗率，試驗結(jié)果表明3℃條件下成苗率較高且株系間差異顯著。

本試驗共檢測到7個與發(fā)芽期耐冷性相關(guān)QTL，分別位于第1、2、3、6、7、11號染色體C1_27059272~29072866、C2_35227548~35357752、C3_17168622~23410343、C6_4815311~4915271、C7_6259359~8809828和C11_23291638~23542994區(qū)間。其中控制相對發(fā)芽率的qRGR3和控制發(fā)芽系數(shù)的qGC3均位于3號染色體C3_17168622~23410343區(qū)間，與Jiang等檢測到低溫發(fā)芽率qLTG-3位點部分重合，重合片段長度為5.95 Mb[23]?？刂破骄l(fā)芽天數(shù)的qAGD1位點位于C1_27059272~29072866區(qū)間，楊洛淼等檢測的低溫發(fā)芽率qLTG1位于該區(qū)間內(nèi)[10]，該區(qū)間與陳瑋等檢測芽苗存活率qSCT-1位點部分重合[24]，qSCT-1位點位于C1_23971321~27335176，重合片段長度為275.9kb，其中包含39個基因。本試驗中影響平均發(fā)芽天數(shù)的qAGD7位于潘招遠檢測到的qLTGR7-2區(qū)間之內(nèi)[25]。本研究檢測到控制發(fā)芽勢的qGE6、控制平均發(fā)芽天數(shù)的qAGD2和qAGD11，以往研究中未見報道。

本試驗共檢測到3個與芽期耐冷性相關(guān)QTL，分別位于第3號染色體C3_1493308~9449124區(qū)間和第7號染色體C7_179537~5442924區(qū)間。位于7號染色體C7_179537~5442924區(qū)間的qSSR7和qCTL7，在芽期成苗率和耐冷級別中均被檢測到，潘招遠檢測到的低溫發(fā)芽率qLTGR7-1也位于該區(qū)間內(nèi)[25]?？刂蒲科谀屠浼墑e的qCTL3位于C3_1493308~9449124區(qū)間，該區(qū)間包含任永梅[9]檢測到的qSR3-2和潘招遠[25]檢測到的qLTGR3-1，其中qLTGR3-1為控制水稻種子低溫萌發(fā)的主效位點，可能通過物質(zhì)代謝與合成影響種子萌發(fā)[25]。本研究檢測到10個與發(fā)芽期和芽期耐冷性相關(guān)QTL位點中，除控制平均發(fā)芽天數(shù)的qAGD1和qAGD2增效等位基因來源于小白粳子外，其他增效等位基因均來源于空育131。

在數(shù)量性狀遺傳中上位性效應(yīng)普遍存在，上位性互作受位點基因型和環(huán)境共同影響[29]，本研究以發(fā)芽系數(shù)為耐冷性鑒定指標，在發(fā)芽期檢測到6號染色體C6_3070977~4805565區(qū)間和11號染色體C11_1609876~4416248區(qū)間存在上位性效應(yīng)，與平均發(fā)芽天數(shù)相關(guān)的qAGD11加性位點位于11號染色體區(qū)間內(nèi)，說明該加性效應(yīng)QTL參與上位性效應(yīng)。本研究在芽期共定位到3對上位性位點，其中以芽期成苗率為指標，在4號和7號染色體間檢測到一對上位性位點，其表型貢獻率在3對上位性位點中最大（17.04%）；以耐冷級別為指標，在1號染色 體C1_32601806~33102009和C1_37540821~42208479之間、3號染色體C3_1493308~9449124和7號染色體C7_179537~5442924之間分別檢測到1個上位性位點，3號和7號染色體這兩個區(qū)間同時檢測到耐冷級別加性QTL。

4 結(jié)論

在發(fā)芽期檢測到7個與發(fā)芽期耐冷性相關(guān)QTL位點，其中與發(fā)芽勢相關(guān)的qGE6、與平均發(fā)芽天數(shù)相關(guān)的qAGD2和qAGD11暫無報道。檢測到3個與芽期耐冷性相關(guān)QTL位點，其中控制成苗率的qSSR7和耐冷級別的qCTL7均位于C7_179537~5442924區(qū)間。10個與發(fā)芽期和芽期耐冷性相關(guān)QTL位點中，除控制平均發(fā)芽天數(shù)的qAGD1和qAGD2增效等位基因來源于小白粳子外，其他增效等位基因均來源于空育131。檢測到4對上位性位點，其中1對與發(fā)芽期耐冷性相關(guān)，其貢獻率為14.26%，另有3對與芽期耐冷性相關(guān)，貢獻率分別為17.04%、4.52%和5.24%。