李大龍，郭瀟雨,2，李鐵梅，王澤珉，宇航，張鵬,2，王佳明，楊國(guó)慧*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030；2.青島黃海學(xué)院，山東 青島 266555；3.黑龍江工商學(xué)院，哈爾濱 150016）

樹(shù)莓（Raspberry）是薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（RubusL.）空心莓亞屬（Idaeobatus），為多年生落葉性灌木型果樹(shù)，別稱托盤、懸鉤子、馬林果、覆盆子等[1]。樹(shù)莓果實(shí)為聚合小漿果，香氣怡人，口感多為酸甜，含有豐富營(yíng)養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、糖、有機(jī)酸、礦物元素等，藥用價(jià)值高，富含黃酮類化合物、鞣花酸、花青素等多種生理活性成分[2]。樹(shù)莓果實(shí)顏色較多，其中紅色最為常見(jiàn)，還有紫色、黑色和黃色等；按照結(jié)果習(xí)性，可分為夏果型和秋果型兩種。

果實(shí)品質(zhì)由多種因素組成，顏色、香氣、營(yíng)養(yǎng)、甜度等是重要指標(biāo)。果品香氣是決定果實(shí)品質(zhì)主要因素，直接影響消費(fèi)者購(gòu)買意向。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已在樹(shù)莓中鑒定出200多種香氣成分，主要為酯類、醛類、萜烯類、醇類、酮類及其他揮發(fā)性物質(zhì)[3-4]。氣相色譜法（GC）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）是揮發(fā)性物質(zhì)主要測(cè)定手段[5]。Aprea等利用固相微萃取法提取樹(shù)莓果實(shí)香氣物質(zhì)，檢測(cè)到36種香氣物質(zhì)，其中酮類物質(zhì)、萜烯類物質(zhì)、酯類物質(zhì)等含量相對(duì)較高[6]；Honkanen等在樹(shù)莓果實(shí)中分離出75種揮發(fā)性物質(zhì)[7]。20世紀(jì)末，電子鼻技術(shù)出現(xiàn)，可無(wú)損快速檢測(cè)果實(shí)香氣，重復(fù)性良好，應(yīng)用價(jià)值較高[8-9]。

目前，使用電子鼻檢測(cè)果實(shí)成熟度和果實(shí)腐爛情況相關(guān)報(bào)道較多[10-11]。羅楓等分析得出，電子鼻法可用于區(qū)分不同貨架期櫻桃[12]；Defilippi等研究表明，電子鼻法可分析杏果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)在不同成熟度和貯存期差異[13]；嚴(yán)娟等利用電子鼻法評(píng)價(jià)桃果實(shí)香氣種質(zhì)資源[14]。目前，采用電子鼻研究樹(shù)莓，僅有對(duì)其果實(shí)發(fā)酵產(chǎn)品和籽油揮發(fā)性物質(zhì)分析。師艷秋等研究紅樹(shù)莓發(fā)酵酒香氣成分，鑒定出54種化合物[15]；劉麗娜等采用電子鼻從紅樹(shù)莓籽精油中檢測(cè)出40種揮發(fā)性成分[16]。利用電子鼻法評(píng)價(jià)樹(shù)莓種質(zhì)資源香氣成分研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究利用電子鼻技術(shù)，測(cè)定樹(shù)莓不同品種及同一品種不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)香氣成分，以期為樹(shù)莓果實(shí)香氣成分提供快速、便捷的檢測(cè)方法，為提高樹(shù)莓栽培技術(shù)措施提供指導(dǎo)，為培育香氣濃郁的樹(shù)莓品種選育提供數(shù)據(jù)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來(lái)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽(yáng)農(nóng)場(chǎng)樹(shù)莓種質(zhì)資源圃，共計(jì)36個(gè)品種，品種特性見(jiàn)表1，采集成熟期果實(shí)用于試驗(yàn)。此外，選取品種‘卡羅琳’不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)測(cè)定香氣成分。不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)采摘標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[17]：將同一天開(kāi)花樹(shù)莓果實(shí)作標(biāo)記，共標(biāo)記60朵，每7 d對(duì)標(biāo)記果實(shí)進(jìn)行采樣，分別為綠果期1、綠果期2、白果期、轉(zhuǎn)色期、成熟期、過(guò)熟期。

表1 樹(shù)莓品種資源簡(jiǎn)要特性Table 1 Brief characteristics of raspberry varieties

1.2 電子鼻檢測(cè)

試驗(yàn)采用PEN 3.5型金屬氧化物傳感器型電子鼻，具有10個(gè)金屬氧化物氣體傳感器陣列，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 PEN 3.5電子鼻傳感器敏感物質(zhì)Table 2 Substances sensitive to electronic nose PEN 3.5 sensors

將10 g樹(shù)莓果實(shí)置于20 mL螺口頂空瓶中，于25℃靜置30 min測(cè)定數(shù)據(jù)，重復(fù)3次。電子鼻測(cè)定參數(shù)參考文獻(xiàn)[18]稍作修改。當(dāng)電子鼻傳感器接觸到樹(shù)莓果實(shí)香氣物質(zhì)后，電導(dǎo)率G發(fā)生改變，相對(duì)電導(dǎo)率（G/G0或G0/G）也隨之變化。如果G/G0或G0/G接近1或等于1，表示果實(shí)中傳感器相對(duì)應(yīng)香氣種類含量較低，反之，相對(duì)電導(dǎo)率值越偏離1，說(shuō)明傳感器所對(duì)應(yīng)香氣物質(zhì)含量越高。響應(yīng)值一般在55~60 s趨于平緩，檢測(cè)數(shù)值較為準(zhǔn)確，選擇此時(shí)段響應(yīng)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用PEN 3.5自帶軟件WinMuster和IBM SPSS Statistics 22分析數(shù)據(jù)。分析方法為主成分分析（Principal components analysis，PCA）、線性判別分析（Linear discriminant Analysis，LDA）和傳感器區(qū)分貢獻(xiàn)率分析（Loadings，LO）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹(shù)莓果實(shí)芳香特征電子鼻響應(yīng)圖

對(duì)樹(shù)莓果實(shí)香氣物質(zhì)作電子鼻檢測(cè)分析，獲得10個(gè)傳感器響應(yīng)圖（見(jiàn)圖1）。圖中曲線代表樹(shù)莓果實(shí)中香氣成分通過(guò)傳感器時(shí)，G/G0或G0/G隨檢測(cè)時(shí)間變化情況。由圖1可看出，檢測(cè)物質(zhì)還未進(jìn)入傳感器時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率數(shù)值均在1附近，當(dāng)香氣物質(zhì)進(jìn)入電子鼻，隨被檢測(cè)氣體在傳感器表面積累，相對(duì)電導(dǎo)率數(shù)值不斷變化，最后達(dá)到平緩狀態(tài)。電子鼻中每一個(gè)傳感器均對(duì)樹(shù)莓香氣物質(zhì)成分響應(yīng)明顯，但響應(yīng)值有差異。對(duì)比36個(gè)樹(shù)莓品種果實(shí)香氣物質(zhì)響應(yīng)圖可看出，W1S（烷類）、W2S（檢測(cè)醇，部分芳香族化合物）、W3C（氨，芳香分子）、W6S（氫化物）相對(duì)電導(dǎo)率值較其他傳感器響應(yīng)值更高。

圖1 傳感器對(duì)樹(shù)莓品種‘卡羅琳’香氣響應(yīng)Fig.1 Graph of sensor response to the aroma of raspberry variety‘Caroline’

2.2 樹(shù)莓品種資源香氣物質(zhì)PCA分析

圖2中每個(gè)圓形區(qū)域代表一種樹(shù)莓果實(shí)數(shù)據(jù)采集點(diǎn)。在PCA分析中，第一和第二主成分貢獻(xiàn)率分別為97.46%和1.34%，總貢獻(xiàn)率為98.80%。在電子鼻PCA分析中，重疊區(qū)域越大說(shuō)明品種間香氣物質(zhì)越相似，從圖2可看出，除‘卡羅琳’和‘黑樹(shù)莓’兩品種重疊，‘菲爾杜德’和‘Метеор’區(qū)域間重疊較大外，其余品種間或重疊較小，或完全分開(kāi)。

圖2 樹(shù)莓各個(gè)品種PCA分析Fig.2 PCA analysis for various varieties of raspberry

進(jìn)一步分析得到每個(gè)品種與其他供試品種平均區(qū)分度值均在98%以上（見(jiàn)表3），說(shuō)明不同品種在香氣物質(zhì)含量及組成之間存在較大差異。

表3 不同樹(shù)莓品種間香氣物質(zhì)平均區(qū)分度Table 3 Average discrimination of aroma substances among different raspberry varieties

2.3 不同類型品種、不同果實(shí)發(fā)育期樹(shù)莓香氣物質(zhì)LDA分析

LDA分析是在PCA分析基礎(chǔ)上對(duì)傳感器響應(yīng)樹(shù)莓果實(shí)香氣成分的優(yōu)化，通過(guò)擴(kuò)大差異更直觀表現(xiàn)不同類型品種、不同果實(shí)發(fā)育期樹(shù)莓香氣物質(zhì)區(qū)別。

圖3為不同顏色樹(shù)莓果實(shí)香氣物質(zhì)LDA分析圖，可看出第一和第二主成分貢獻(xiàn)率分別為33.35%和17.05%，總貢獻(xiàn)率為50.40%，僅解釋50%以上變異。根據(jù)第一和第二主成分貢獻(xiàn)率可看出，LDA可根據(jù)香氣物質(zhì)區(qū)分樹(shù)莓不同果實(shí)顏色。果實(shí)顏色與第一主成分貢獻(xiàn)率相關(guān)趨勢(shì)較好，隨第一主成分貢獻(xiàn)率延伸至遠(yuǎn)端，集中分布于紫樹(shù)莓、黃樹(shù)莓、紅樹(shù)莓、黑樹(shù)莓4種果實(shí)顏色樹(shù)莓品種資源。

圖3 不同果實(shí)顏色樹(shù)莓品種LDA分析Fig.3 LDA analysis for raspberry with different colors'fruit

根據(jù)PCA分析，黑樹(shù)莓與紫樹(shù)莓香氣區(qū)分度在70%以上，黑樹(shù)莓與黃樹(shù)莓區(qū)分度在50%~60%，紅樹(shù)莓與紫樹(shù)莓、紅樹(shù)莓與黑樹(shù)莓區(qū)分度在40%~50%，黃樹(shù)莓與紫樹(shù)莓、黃樹(shù)莓與紅樹(shù)莓區(qū)分度在30%~40%，表明電子鼻可區(qū)分樹(shù)莓果實(shí)香氣。

圖4為夏果型和秋果型樹(shù)莓品種LDA分析，可看出第一和第二主成分貢獻(xiàn)率分別為79.17%和2.60%，總貢獻(xiàn)率為81.77%，可解釋80%以上變異，根據(jù)第一和第二主成分貢獻(xiàn)率可區(qū)分出不同結(jié)果類型樹(shù)莓果實(shí)。

圖4 不同結(jié)果類型樹(shù)莓品種LDA分析Fig.4 LDA analysis for raspberry of different fruiting types

基于樹(shù)莓品種‘卡羅琳’果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期香氣成分LDA判別分析見(jiàn)圖5。

由圖5可看出第一和第二主成分貢獻(xiàn)率分別為64.16%和25.19%，總貢獻(xiàn)率為89.35%，可解釋80%以上變異，雖然白果期和轉(zhuǎn)色期、成熟期和過(guò)熟期區(qū)域有部分交叉，但LDA分析可區(qū)分出樹(shù)莓果實(shí)各發(fā)育時(shí)期香氣成分的差異。對(duì)不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)傳感器響應(yīng)值分析可看出，隨果實(shí)發(fā)育成熟，硫化合物（W1W）、芳烴化合物及硫有機(jī)化合物（W2W）變化小，氮氧化合物（W5S）表現(xiàn)逐漸減少趨勢(shì)；芳烴化合物（W1C）、氨及芳香分子（W3C）、氫化物（W6S）、烷類（W1S）、檢測(cè)醇及部分芳香族化合物（W2S）、烷類和脂肪族（W3S）表現(xiàn)為先降后升，其中W3C和W3S從綠果期1到白果期表現(xiàn)為下降，W1C、W6S、W1S、W2S從綠果期1到轉(zhuǎn)色期表現(xiàn)為下降，之后到成熟期表現(xiàn)為上升；烯烴及芳族和極性分子（W5C）從綠果期到過(guò)熟期逐漸升高（見(jiàn)表4）。

圖5 不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)香氣物質(zhì)LDA分析Fig.5 LDA analysis for aroma substances in raspberry fruits at different development stages

表4 不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)各傳感器響應(yīng)值Table 4 Sensor response values of raspberry fruits at different development stages

2.4 LO分析傳感器貢獻(xiàn)率

LO分析反映各傳感器在區(qū)分樹(shù)莓果實(shí)香氣中貢獻(xiàn)大小，一般通過(guò)圖中各傳感器位置判斷。在坐標(biāo)原點(diǎn)（0，0）附近傳感器對(duì)樹(shù)莓果實(shí)香氣分析發(fā)揮作用較小，反之表示作用越大。由圖6可看出，W1S傳感器（烷類）對(duì)第一主成分貢獻(xiàn)率最大，W5S傳感器（氮氧化物）對(duì)第二主成分貢獻(xiàn)率較大，W2S傳感器（檢測(cè)醇，部分芳香族化合物）對(duì)第一和第二主成分貢獻(xiàn)率均較大；W3C傳感器（氨，芳香分子）和W6S傳感器（氫化物）對(duì)第一主成分貢獻(xiàn)率作用次之，但因第一主成分貢獻(xiàn)率（97.46%）遠(yuǎn)高于第二主成分（1.34%），因此認(rèn)為傳感器貢獻(xiàn)率高低依次為傳感器W1S（烷類化合物）、W2S（檢測(cè)醇和部分芳香族化合物）、W3C（烷類和脂肪族）和W6S（氫化物），與36個(gè)品種傳感器響應(yīng)結(jié)果相符合，因此可利用以上4個(gè)傳感器結(jié)果評(píng)價(jià)樹(shù)莓果實(shí)香氣。而傳感器W1W（硫化合物）、W1C（芳烴化合物）、W5C（烯烴，芳族，極性分子）、W3S（烷類和脂肪族）和W2W（芳烴化合物，硫的有機(jī)化合物）響應(yīng)值在（0，0）附近，因此對(duì)香氣物質(zhì)貢獻(xiàn)率最小，對(duì)PCA、LDA分析發(fā)揮作用也較小。

圖6 不同品種樹(shù)莓LO分析Fig.6 Loadings analysis of different raspberry varieties

3 討論

3.1 電子鼻法評(píng)價(jià)樹(shù)莓果實(shí)香氣

電子鼻技術(shù)方便便捷，對(duì)香氣物質(zhì)品鑒重復(fù)性較好。目前，電子鼻技術(shù)在果實(shí)檢測(cè)應(yīng)用主要集中在果實(shí)成熟度和采后貯藏品質(zhì)變化評(píng)估，例如，蔣鑫妹利用電子鼻有效識(shí)別歐李果實(shí)是否需要催熟[19]；馬蒙蒙等試驗(yàn)表明，利用電子鼻可對(duì)貨架期蘋(píng)果果實(shí)香氣物質(zhì)變化情況進(jìn)行分析，且對(duì)不同品種區(qū)分效果較好[20]；嚴(yán)娟等將其應(yīng)用于桃果實(shí)香氣資源評(píng)價(jià)，結(jié)果表明桃果實(shí)生育期對(duì)香氣物質(zhì)影響顯著，不同肉質(zhì)顏色桃果實(shí)之間香氣物質(zhì)差異不顯著[14]。本研究利用電子鼻法評(píng)價(jià)不同樹(shù)莓品種果實(shí)香氣物質(zhì)，LDA分析可區(qū)分夏果型和秋果型不同結(jié)果類型樹(shù)莓品種資源以及不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)香氣，可區(qū)分紅樹(shù)莓、黃樹(shù)莓、紫樹(shù)莓、黑樹(shù)莓不同顏色樹(shù)莓果實(shí)香氣，說(shuō)明電子鼻法可用于判別不同成熟度樹(shù)莓果實(shí)香氣，也可初步評(píng)價(jià)樹(shù)莓種質(zhì)資源香氣成分。

3.2 關(guān)于不同類型樹(shù)莓品種資源香氣評(píng)價(jià)

夏果型樹(shù)莓品種約在2年生枝條上結(jié)果，黑龍江省結(jié)果時(shí)間一般在7月上中旬至8月上旬，秋果型品種約在1年生枝條上結(jié)果，結(jié)果時(shí)間一般為8月下旬至10月初。LDA分析可區(qū)分兩種結(jié)果類型品種資源香氣成分，可能與親緣關(guān)系有關(guān)，同種類型品種在雜交中可能利用相同或相近親本；也可能與果實(shí)發(fā)育時(shí)環(huán)境條件有關(guān)，由于生長(zhǎng)環(huán)境有差異，兩種果實(shí)在不同季節(jié)成熟，奚昕琰等研究表明，葡萄成熟期受溫度影響較大，果實(shí)中香氣物質(zhì)變化規(guī)律存在明顯差異，說(shuō)明溫度影響果實(shí)中香氣物質(zhì)形成[21]；席萬(wàn)鵬等通過(guò)對(duì)桃果實(shí)進(jìn)行套袋處理，發(fā)現(xiàn)不同處理后桃果實(shí)香氣物質(zhì)差異明顯，說(shuō)明光照也可影響果實(shí)中香氣物質(zhì)形成[22]。LDA分析可區(qū)分不同顏色樹(shù)莓果實(shí)香氣，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黑樹(shù)莓和紫樹(shù)莓香氣成分區(qū)分度最大，達(dá)70%，紅樹(shù)莓和黃樹(shù)莓香氣物質(zhì)有部分交叉，區(qū)分度為30%~40%。紅樹(shù)莓品種主要來(lái)自于歐洲紅樹(shù)莓（R.idaeusL.），黃樹(shù)莓是其變種；黑樹(shù)莓來(lái)自于北美洲R.occidentalisL.，紫樹(shù)莓則來(lái)自于R.neglectusPeck.。紅樹(shù)莓、紫樹(shù)莓和黑樹(shù)莓分屬于不同種類，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，香氣物質(zhì)差異較大，而黃樹(shù)莓是紅樹(shù)莓變種，二者果實(shí)香氣物質(zhì)相似度更高。

3.3 關(guān)于樹(shù)莓果實(shí)特征香氣物質(zhì)

果實(shí)中芳香物質(zhì)成分復(fù)雜，主要為酯類、醛類、萜類等，其次是醇類、酮類及其他揮發(fā)性物質(zhì)。樹(shù)莓果實(shí)中現(xiàn)已鑒定芳香成分有200多種，關(guān)于香氣種類有不同觀點(diǎn)。Sakai等和Lou等研究認(rèn)為樹(shù)莓酮為決定樹(shù)莓香氣的主要成分[23-24]，竇泓喆則認(rèn)為樹(shù)莓主要香氣成分為β-紫羅酮，占樹(shù)莓香氣成分80%~90%[25]。Ravid等認(rèn)為樹(shù)莓果實(shí)中特征香氣物質(zhì)為α-紫羅酮和質(zhì)癸內(nèi)酯[26]；陳樂(lè)天則認(rèn)為芳樟醇、α-紫羅酮、β-紫羅蘭酮3種物質(zhì)相對(duì)含量較高，可占總含量20%[27]。

樹(shù)莓果實(shí)發(fā)育期一般30~40 d，可分為綠果期、白果期、轉(zhuǎn)色期、成熟期和過(guò)熟期，從轉(zhuǎn)色期至成熟期變化明顯，果實(shí)迅速軟化著紅，表現(xiàn)出品種特有香氣。本研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)色期到成熟期，樹(shù)莓果實(shí)香氣物質(zhì)相對(duì)含量顯著增加，其中芳烴化合物、氨及芳香分子、烷類、檢測(cè)醇及部分芳香族化合物、烯烴及芳族和極性分子尤為明顯，推測(cè)成熟前增加這些香氣物質(zhì)對(duì)樹(shù)莓芳香特征具有更大決定作用。因此，在栽培管理方面，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)成熟期前樹(shù)莓管理，例如噴施葉面肥等，有利于促進(jìn)果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，提高樹(shù)莓果實(shí)品質(zhì)，增加樹(shù)莓果實(shí)香氣程度。

電子鼻優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)單實(shí)用，但一般無(wú)法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，需結(jié)合其他方法分析果實(shí)中香氣物質(zhì)，例如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）等手段測(cè)定樹(shù)莓果實(shí)特征香氣物質(zhì)，明確不同類型樹(shù)莓品種香氣成分及果實(shí)香型，為樹(shù)莓栽培和加工產(chǎn)業(yè)中品種選擇提供依據(jù)，也為樹(shù)莓香氣育種提供數(shù)據(jù)資源。

4 結(jié)論

電子鼻對(duì)供試樹(shù)莓品種香氣成分均有響應(yīng)，傳感器貢獻(xiàn)率高低為W1S（烷類化合物）、W2S（檢測(cè)醇和部分芳香族化合物）、W3C（氨，芳香分子）和W6S（氫化物）；PCA分析表明不同樹(shù)莓品種在香氣物質(zhì)含量及組成之間存在較大差異；LDA分析可區(qū)分不同結(jié)果類型樹(shù)莓品種、不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)香氣，區(qū)分不同顏色樹(shù)莓果實(shí)香氣；果實(shí)成熟期前相對(duì)含量顯著增加，其中芳烴化合物、氨及芳香分子、烷類、檢測(cè)醇及部分芳香族化合物、烯烴及芳族和極性分子尤為明顯。