劉艷榮

（山西健碩食品藥品研究院有限公司，山西太原 030006）

核苷酸是構(gòu)成核酸的成分，是由含氮的堿基、核糖或脫氧核糖、磷酸3種分子連接而成，在人體廣泛分布，具有多種生物學(xué)功能。例如，母乳中就含有尿苷酸（Uridine Monophosphate，UMP）、胞苷酸（Cytidine Monophosphate，CMP）、 腺苷酸（Adenosine Monophosphate，AMP）、 鳥苷酸（Guanosine Monophosphate ，GMP）和肌苷酸（Cytidine Monophosphate，IMP）等多種核苷酸，為提高嬰兒的免疫調(diào)節(jié)功能和記憶力發(fā)揮著重要作用。此外，鳥嘌呤核苷酸和次黃嘌呤核苷酸還有呈味和增鮮的作用，在味精、雞精等調(diào)味品中廣泛使用[1-2]。

目前，核苷酸類物質(zhì)已作為一種功效成分被廣泛添加于各種嬰幼兒奶粉和保健食品中，通過改善細胞的活力而提高機體各系統(tǒng)的自身功能和自我調(diào)節(jié)能力，來達到最佳綜合狀態(tài)和生理平衡[3]。核苷酸花粉膠囊是一種以核苷酸和油菜花粉為主要原料制成的保健食品，經(jīng)動物實驗證明具有增強免疫力的保健功能[4]。

核苷酸含量的測定方法包括熒光比色法、毛細管電泳法、離子交換色譜法、液相色譜法和質(zhì)譜法等，其中高效液相色譜法最為常用，而毛細管電泳法重現(xiàn)性較差，熒光比色法和離子交換色譜法存在較大的干擾，質(zhì)譜法成本高，因此這幾種方法使用較少。文獻關(guān)于液相色譜法測定乳粉中核苷酸含量的報道較多[5]。由于核苷酸親水性強，在普通C18柱上保留和分離效果欠佳，因此本研究優(yōu)化建立了一套操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定可靠的檢測方法，為保健食品領(lǐng)域該類產(chǎn)品的質(zhì)量檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

高效液相色譜儀LC-20AT，島津；超聲清洗機SB-5200DTD，寧波新芝；電子天平AUW120D，島津；ZORBAX SB-C18色譜柱；Acutfex PW-C18色譜柱；Shim-pack GIST C18色譜柱。

鳥嘌呤核苷酸（GMP），BePure，純度98.3%；腺嘌呤核苷酸（AMP），Dr.E，純度92.2%；次黃嘌呤核苷酸（IMP），PANPHY，純度100.0%；胞嘧啶核苷酸（CMP），PANPHY，純度99.2%；尿嘧啶核苷酸（UMP），BePure，純度98.7%；甲醇和乙腈，F(xiàn)isher 色譜純；四丁基硫酸氫銨，美國MREDA；磷酸二氫鉀，分析純；氫氧化鉀，分析純；磷酸，優(yōu)級純；娃哈哈純凈水、芬格欣核苷酸絞股藍口服液，市購。

1.2 色譜條件

色譜柱：Acutfex PW-C18；流動相：0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀∶甲醇=97 ∶3；流速：1 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取CMP、UMP、AMP、GMP 和IMP 標(biāo)準(zhǔn)品適量，精確到0.1 mg，用水溶解，配制成濃度分別為2 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別吸取一定體積的各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品制備

精密量取供試品溶液1 mL 至100 mL 棕色容量瓶中，加入50 ℃左右的熱水80 mL，超聲30 min，冷卻至室溫后用水定容至刻度，過膜待上機測定。

1.5 含量計算

試樣中各核苷酸含量測定的計算公式為

式中：X為試樣中某種核苷酸的含量，mg·g-1或mg·mL-1；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的試樣溶液中某種核苷酸的濃度，μg·mL-1；V為試樣定容體積，mL；n為樣液稀釋倍數(shù)；m為試樣的質(zhì)量或體積，g 或mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種核苷酸液相色譜分離分析條件的確定

2.1.1 流動相的選擇

核苷酸檢測的液相色譜法主要是采用離子對試劑來延長化合物在反相色譜上的保留時間。本文參考國標(biāo)GB 5413.40—2016 和文獻[4-5]的方法配制了5種流動相進行比較，分別是A：0.2%磷酸 水∶乙 腈=97 ∶3；B：0.01 mol·L-1磷 酸 二 氫鉀∶乙腈=97 ∶3；C：0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀∶甲醇=97 ∶3；D：（1.4 mmol·L-1四丁基硫酸氫氨+0.01 mol·L-1磷 酸 二 氫 鉀）∶甲 醇=97 ∶3；E：（1.4 mmol·L-1四丁基硫酸氫氨+0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀）∶乙腈=97 ∶3，結(jié)果表明流動相C 和D 條件下5種核苷酸分離度都滿足要求，峰形對稱性較好，但是流動相D 離子對試劑和色譜柱固定相結(jié)合需要較長的平衡時間，且有機相比例的增減對離子對試劑影響很大，離子對試劑對柱子的傷害也大，而且與C 相比出峰時間較長，對基質(zhì)復(fù)雜的乳制品可能更適合。核苷酸易溶于水，相比乙腈，甲醇的洗脫能力弱一些，出峰晚，容易和水溶性雜質(zhì)分離，而且甲醇比例越低分離度越好，但是考慮到反相C18柱的耐水性和柱效問題，綜合選擇流動相C 進行檢測。

2.1.2 流動相pH 的影響

核苷酸在酸性條件下比較穩(wěn)定，本文將0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液用磷酸分別調(diào)節(jié)pH=3、pH=3.8、pH=4.8 進行實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH=3 時，只出了4個峰，經(jīng)單個化合物標(biāo)品確認，4個峰依次是CMP、UMP、GMP、AMP 和IMP，其 中GMP 和AMP 為第3個峰，完全重疊不能分離。pH=3.8 時，出峰順序不變，其中AMP 和IMP 有交叉，分離度不夠。pH=4.8 時，5種核苷酸均能有效分離，出峰順序依次是CMP、UMP、GMP、IMP 和AMP，說明pH 變化對AMP 影響最大，pH 越低，出峰越早。最終選擇流動相pH=4.8。

2.1.3 色譜柱的選擇

本實驗選擇了SB-C18、PW-C18和Shim-pack GIST C18這3種色譜柱進行比較，5種核苷酸在這3種色譜柱上均可以有效分離。其中Shim-pack GIST C18峰形最好，PW-C18對化合物的保留時間稍長，分離度好，柱子本身耐水性較強，所以最終選擇PWC18色譜柱進行方法驗證。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

將核苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，分別用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述色譜條件進樣10 μL，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過回歸計算求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果如表1 所示，線性良好，可以用外標(biāo)法進行定量測定。5種核苷酸的高效液相色譜圖如圖1 所示，分離度好，靈敏度高。

表1 5種核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)

圖1 5種核苷酸的高效液相色譜圖（10 μg·mL-1）

2.2.2 方法重復(fù)性

分別量取6 份供試品溶液各1 mL，按照樣品制備的方法在同一條件下進行含量測定，結(jié)果如表2所示。該樣品中次黃嘌呤核苷酸（IMP）未檢出，其余4種核苷酸含量的RSD 在0.26%～1.06%，滿足方法驗證的要求。

表2 供試品中5種核苷酸的含量結(jié)果

2.2.3 方法準(zhǔn)確度

方法準(zhǔn)確度采用標(biāo)準(zhǔn)添加測定回收率實驗，以6 份樣品測定的平均值為本底，平行精密量取9 份供試品各0.5 mL，按照低（1 mg）、中（2 mg）、高（3 mg）3個水平進行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加，含量測定同樣品的測定，計算各水平的加標(biāo)回收率，從而評價方法的準(zhǔn)確度。結(jié)果如表3 所示，5種核苷酸加標(biāo)回收率在96.2%～104.7%，說明該方法準(zhǔn)確度好，結(jié)果可靠。

表3 供試品中5種核苷酸的回收率結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了保健食品中功效成分核苷酸含量的高效液相色譜測定方法，分別研究了流動相組成、流動相pH 對5種化合物的影響，同時比較了3種不同品牌的色譜柱的分離效果。結(jié)果表明流動相組成和pH 的影響最大，在5 ～100 μg·mL-1線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999，平均回收率在96.2%～104.7%，樣品重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.26%～1.06%。本方法操作簡單，精密度好，準(zhǔn)確度高，滿足定量要求，為保健食品樣品的核苷酸檢測提供參考。