孫海紅， 董國強， 蔡 葵， 呂享華， 孫永紅， 薛魯燕， 張瑞巧， 王文嬌， 趙征宇， 石大川

(1.青島市農業(yè)科學研究院，山東青島 266100； 2.青島市農產品質量安全中心，山東青島 266100)

油茶(Abel)是山茶花中一種重要的木本食用油料樹種，它主要分布于我國的湖南、湖北、江西、廣西、浙江和福建等省份，是我國獨有的一種食用油料樹種，別稱楂木，通常為常綠灌木林，有時為小喬木，高度為3～4 m，極少數(shù)可達 8 m。油茶樹皮呈淡黃褐色，平滑但不裂；小枝微被短柔毛；單葉互生；葉柄長4～7 mm，有毛；葉片多為厚革質，形狀為卵狀橢圓形或卵形，長度為3.5～9.0 cm，寬度多為1.8～4.2 cm，其頂點相對較鈍，基部呈楔形，邊緣多呈細鋸齒形，上部則呈亮綠色，通常為無毛或中脈有硬毛，下面中脈基部有毛或無毛，其側脈不明顯；花為兩性花，1～3朵生于枝頂或葉腋上，直徑達到3～5 cm，無梗；通常有5張萼片，形狀接近圓形，外表面有被絹毛；花瓣數(shù)一般為5～7瓣，花色為白色，花分離，形狀為倒卵形至披針形，長度多為2.5～4.5 cm，先端常有凹缺，外表面有毛；雄蕊更多，無毛外觀，外部花絲僅有基部連合；上部子房長有密集白色絲狀絨毛，花柱先頂三淺裂；蒴果形狀為近球形，直徑通常達到3～5 cm，其果皮較厚，為木質，室背2～3裂；種子形狀為背圓腹扁形，長度達2.5 cm；花期為10、11月，果期在次年10月。油茶的栽培歷史較為悠久，分布區(qū)域很廣，栽培面積很大，用途較多，由于其具有收斂止血、解毒之功效，因此常常被用于治療鼻衄病、皮膚潰爛瘙癢、瘡疽等癥狀。此外，油茶具有較強的清除自由基、抗腫瘤、抗炎、降血脂的作用，在食品藥品、營養(yǎng)保健、日用化工等領域也具有良好的應用價值。但是，目前油茶葉資源并未得到良好、可循環(huán)的利用，特別是在油茶整形修剪、低產油茶林的改造等不當應用下，大量油茶葉常被作為廢棄物丟棄，使其功能和使用價值大大降低，極大地浪費了資源。通過大量的研究發(fā)現(xiàn)，油茶葉中也含有多種不同的黃酮類化合物，黃酮類化合物常常具有良好的抗油脂氧化性能，并有報道指出，油茶提取物可用于治療一些無名腫毒病癥、犬咬或是火燒成瘡等疾病。油茶葉茶多糖是一類成分復雜的糖類混合物。此外，油茶多糖功效很多，具有抵抗各種輻射、增加人體內白細胞的數(shù)量、提高人體免疫力的作用，還可以降低人體血糖。通過泡飲用油茶制成的粗茶來治糖尿病的嘗試和方法較為流行，原因可能是茶多糖發(fā)揮了作用。但是茶多糖的抗氧化能力較弱，在受到胞外真菌的寄生后，有關茶耳的理化性質及其糖類成分的研究在我國和世界范圍內還有待拓展，因此本研究旨在分析油茶葉可食用真菌在營養(yǎng)成分及體外抗氧化性方面的作用。

1 試驗方法

本試驗的總流程見圖1。

1.1 油茶和茶耳水提物及多糖的提取

油茶葉產自湖南省株洲市，采集時間為2018年4月。試驗時間為2018年5—6月，試驗地點為青島農業(yè)科學研究院。將油茶葉葉片和茶耳葉片粉碎后按 1 g ∶30 mL的料液比加入蒸餾水，放入恒溫水浴鍋中于65 ℃提取2 h，分別抽濾得到油茶葉濾液(CF)、茶耳濾液(TF)。取一部分濾液旋蒸濃縮后按1 ∶4的體積比加入無水乙醇醇沉，將沉淀物在 4 ℃ 條件下靜置過夜，取其沉淀物放置于離心機內并且于4 000 r/min離心15 min，將沉淀物再次溶解于蒸餾水后，用離心機離心以除去水中那些不溶性雜質，使用流水透析72 h，將透析后的樣品經冷凍干燥后，便可得到油茶粗多糖(CCP)、茶耳多糖(TCP)，進而計算粗多糖產率。

1.2 理化形式分析

1.2.1 總糖含量的測定 標準曲線的繪制。首先，在干燥的100 mL容量瓶中準確稱量18.80 mg無水葡萄糖，加水溶解并稀釋至刻度處，充分搖勻，然后在50 mL容量瓶中準確吸取10 mL葡萄糖溶液，加蒸餾水至刻度線標記處，充分搖動，得到 0.037 6 mg/mL 無水葡萄糖標準貯備液。分別精確量取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mL葡萄糖參比溶液(濃度)于干燥的試管中，每管補加蒸餾水至0.5 mL。每管再加入300 μL 6%苯酚溶液，充分搖勻后再次加入1.5 mL濃硫酸溶液(濃度)，振蕩搖勻后在沸水浴中充分反應 15 min，再取出混合物，并置于冰浴中冷卻至室溫，通過測定推導出回歸方程。

樣品的測定：將多種樣品配制成5 mg/mL水溶液備用，再精確移取0.2 mL水溶液，按上述操作分別測量樣品，并根據(jù)標準曲線計算總糖含量。

1.2.2 還原糖含量的分析 將各種樣品制備成質量濃度為5 mg/mL的水溶液，分別精確移取1.0 mL水溶液轉移到25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。然后精確移取2.5 mL稀釋后的供試樣品溶液至容量瓶中，準確加入2.5 mL DNS試劑，充分混勻，沸水浴加熱5 min后，用冷流水冷卻，將體積調節(jié)至標記線處(25 mL)，以去離子水作為空白對照組，測量其在540 nm處的吸光度。以葡萄糖作為標準品，根據(jù)標準曲線計算出其還原糖含量。

1.2.3 總酚含量的分析 精確量取5 mL各種供試品溶液于干燥試管中，再加入5 mL福林酚試劑，搖勻后在室溫下放置3 min。再次加入5 mL 10%碳酸鈉溶液，充分搖勻后在室溫下顯示1 h(使用相應試劑作為空白對照)，用紫外-可見分光光度法在 700 nm 處測量吸光度。以50 μg/mL沒食子酸溶液作為標準溶液，并根據(jù)其標準曲線計算出其總酚含量。

1.3 單糖組分分析

由于在測定單糖組成前首先需要將多糖降解為單糖后才能測定，因此試驗前準確稱取5 mg已經分離純化的油茶葉濾液、油茶葉粗多糖、茶耳濾液、茶耳粗多糖樣品，分別置于不同安瓿瓶中，加入 1 mL 濃度為2 mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液，使用乙醇噴燈封閉瓶口，將密封的安瓿瓶放到溫度為110 ℃的烘箱內進行水解反應(反應8 h使反應完全)。等待水解反應完全后，將樣品用甲醇溶液(濃度100%)溶解并轉移到不同雞心瓶內，用甲醇溶液旋蒸多次，直至除去所有樣品中的TFA，并轉移至EP管中供以后使用，最后放置于40 ℃烘箱內烘干。

標準溶液的制備。分別準確稱取干燥的甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、葡萄糖(Glc)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcuA)、半乳糖醛酸(GalUA)、乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)和巖藻糖(Fuc)的單糖標準品，用蒸餾水配制成1.0 mg/mL的標準溶液。然后采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色譜法對各種單糖標準品和油茶葉濾液、油茶葉粗多糖、茶耳濾液、茶耳多糖水解產物進行衍生化，然后進行高效液相色譜分析。

試驗條件：色譜柱為KP-C色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH值=6.7)-乙腈(體積比=82 ∶18)；流速為 1 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL；檢測器為紫外檢測器；檢測波長為254 nm。

1.4 體外抗氧化能力的測定

DPPH自由基清除率的測定。將油茶葉多糖和茶耳多糖分別配制成濃度為0、2、4、6、8、10 mg/mL的水溶液。將油茶葉多糖(HE)、茶耳多糖(IE)水提液分別配制成0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/mL水溶液，然后吸取250 μL 0.02% DPPH-甲醇(DPPH為1，1-二苯基-2-硝基苯肼)溶液加到 1 mL 樣品水溶液中。在室溫下避光放置 30 min 后，以維生素C作為陽性對照，在517 nm處測量其混合物的吸光度。DPPH自由基清除率的計算公式如下：

DPPH自由基清除率=517 nm()-517 nm()/517 nm()×100%。

式中：517 nm()為樣品的吸光度；517 nm()為空白樣品的吸光度。

羥基自由基清除率的測定。將多糖分別配制成質量濃度為0、2、4、6、8、10 mg/mL的水溶液。將水提液HE、IE分別配制成質量濃度為0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/mL的水溶液，吸取1 mL 9 mmol/L FeSO溶液和1 mL 9 mmoL/L水楊酸-甲醇溶液加入1 mL樣品水溶液中。混合后，向混合物中加入 1 mL 9 mmoL/L HO溶液。在37 ℃避光30 min后，以維生素C作為陽性對照，在517 nm處測量混合物的吸光度。其對羥基自由基清除率的計算公式如下：

羥基自由基清除率=517 nm()-517 nm()/517 nm()×100%。

式中：517 nm()為樣品的吸光度；517 nm()為空白樣品的吸光度。

2 結果與分析

2.1 油茶、茶耳水提物及多糖的提取

本試驗提取的油茶、茶耳水提物的顏色均為紅棕色，醇沉后的多糖為褐色粉末，油茶葉多糖的產率為16.9%，茶耳多糖的產率為10.24%，多糖的理化性質分析結果見表1。通過分析健康油茶葉、被(shirai)Syd真菌寄生后油茶葉茶耳中多糖相關成分的性質發(fā)現(xiàn)，被感染葉片茶耳的總糖含量高于健康葉片，還原糖含量也顯著增加。由試驗結果可以看出，真菌的寄生可以促進一些糖類物質的轉化，使被真菌寄生的葉片的含糖量比健康葉片高。通過比較總酚含量發(fā)現(xiàn)，真菌的寄生可以提高葉片中的酚類物質含量。

表1 油茶、茶耳水提物及其各多糖成分含量 %

2.2 油茶和茶耳水提物及多糖的單糖組成分析

分析圖2至圖6可知，油茶葉多糖由甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)5種單糖組成，由其相對峰面積比可以看出，5種單糖的含量比例為 2.96 ∶5.83 ∶22.28 ∶19.71 ∶15.99。分析圖3、圖6可知，油茶葉水提液由甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)5種單糖組成，由其相對峰面積比可以看出，5種單糖的含量比例為0.85 ∶9.80 ∶71.86 ∶4.10 ∶3.63。分析圖4、圖6可知，茶耳多糖由甘露糖(Man)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)4種單糖組成，由其相對峰面積比可以看出，4種單糖的含量比例為23.81 ∶20.71 ∶22.88 ∶6.74。分析圖5、圖6可以看出，茶耳水提液由甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)5種單糖組成，由其相對峰面積比可以看出，5種單糖的含量比例為 5.54 ∶3.80 ∶63.73 ∶6.83 ∶3.25。

通過比較茶耳多糖和油茶葉粗多糖的單糖組分發(fā)現(xiàn)，茶耳多糖的甘露糖含量明顯高于油茶葉多糖，并且茶耳多糖組分中沒有油茶葉多糖的氨基葡萄糖成分。

2.3 油茶和茶耳水提物及多糖的抗氧化活性

由圖7至圖10可以看出，油茶葉、茶耳水提取物具有良好的抗氧化活性。本研究分析了油茶葉、茶耳、油茶葉水提液和茶耳水提液對DPPH自由基的清除活性，并將其與陽性對照抗壞血酸進行了比較。由結果可知，茶葉水提液、茶耳水提液對DPPH自由基的清除效果都明顯優(yōu)于多糖。茶葉提取物、茶耳提取物清除DPPH自由基的EC分別為0.07、0.03 mg/mL(圖8)。水提取物具有良好的抗氧化活性，可能與其內部酚類物質含量豐富有關。茶耳粗多糖、油茶葉粗多糖清除DPPH自由基的EC分別為4.7、3.4 mg/mL (圖7)。通過圖9、圖10比較茶葉水提液和茶耳水提液對羥自由基的清除活性，并與油茶葉多糖和茶耳多糖進行了比較。由結果可知，油茶葉多糖、茶耳多糖具有弱的羥自由基清除作用。研究結果表明，真菌的寄生會提升葉片提取物的體外抗氧化能力。

3 結論

本試驗從油茶葉和茶耳中提取水提物與活性多糖，分析其單糖組成及化學性質。結果表明，真菌寄生后茶葉中的總糖、還原糖和總酚含量均有增加。本研究結果表明， 真菌可以將油茶葉片中的一些營養(yǎng)物質轉化為糖類、酚類物質。將茶葉水提液和茶耳水提液、茶葉多糖和茶耳多糖的體外抗氧化能力進行比較發(fā)現(xiàn)，真菌寄生后可以使葉片提取物的抗氧化能力顯著增強，可以為市場上油茶葉真菌污染問題提供一些解決方法，同時可對一些真菌污染后的油茶葉進行處理以開發(fā)一些茶飲料，減少經濟損失。