孫海燕， 田 蕓， 郝丹青， 王 瑞， 裴金金， 陳 琛， 李新生，2

(1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000； 2.陜西理工大學(xué)/陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西漢中 723000；3.國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心秦巴地區(qū)保鮮工作站，陜西漢中 723000；4.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽 550000)

天麻(Bl.)又稱赤箭、離母、神草等，屬于蘭科植物，廣泛分布于秦巴山區(qū)，是一種傳統(tǒng)的名貴中藥材。天麻的主要有效成分是天麻素及其苷元、天麻多糖，對頭痛失眠等癥狀有較好的治療作用。目前，天麻主要作為藥材使用，在市面上以干品居多，新鮮樣品較少，這是因?yàn)樘炻榈牟墒諘r(shí)間較短，新鮮天麻容易潰爛，不易保鮮，一般僅可自然放置5～7 d。傳統(tǒng)的天麻貯藏大多采用保鮮劑、真空包裝、低溫冷藏等方法，在一定程度上可以延長天麻的保鮮時(shí)間。目前，國內(nèi)外對天麻保鮮的研究較少，國內(nèi)已有的報(bào)道主要集中于鮮食天麻貯藏工藝及鮮食天麻與傳統(tǒng)干制天麻貯藏方法的比較，也有一些報(bào)道是關(guān)于天麻失質(zhì)量率、可食率、口感、硬度、色度等進(jìn)行的研究。至今，天麻軟化相關(guān)酶是否會影響其后續(xù)保鮮效果尚仍不清楚。天麻在采收后仍具有活性，在其貯藏期間會逐漸軟化，活性物質(zhì)會被降解，不利于保鮮；天麻軟化是一個(gè)非常復(fù)雜的發(fā)育調(diào)控過程，包含一些生理生化反應(yīng)，包括細(xì)胞壁的降解、內(nèi)含物的變化、呼吸速率的變化等，可能有多種軟化相關(guān)酶參與調(diào)控。果膠裂解酶(PL)是一種通過降解果膠使果實(shí)軟化的酶，可以隨機(jī)裂解高等植物的中膠層和初生細(xì)胞壁，主要功能是在果實(shí)成熟過程中參與果膠結(jié)構(gòu)的裂解以達(dá)到軟化果實(shí)的目的；果膠甲酯酶(PME)能夠催化細(xì)胞壁中多聚半乳糖醛酸的脫甲酯化，可以使植物細(xì)胞壁中的果膠多糖降解；過氧化物酶(POD)隸屬于氧化還原酶類，廣泛分布于大自然中，是造成植物木質(zhì)化的關(guān)鍵酶之一；木瓜蛋白酶主要存在于番木瓜中，是一種催化活性很強(qiáng)的蛋白水解酶；組織蛋白酶是蛋白酶類的一種，其主要功能是降解蛋白質(zhì)。

本研究所用天麻取自陜西省漢中市南鄭縣青樹鎮(zhèn)，采收當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，篩選無損傷且大小均一的天麻。成熟天麻為黃褐色塊莖，取新鮮天麻，清洗干凈后切成塊狀，采用茶多酚涂膜、超高壓處理、茶多酚涂膜+超高壓處理3種方式處理，用聚乙烯保鮮袋保存于4 ℃冰箱中，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。本試驗(yàn)以3種不同處理方式處理的天麻樣品為材料，首先進(jìn)行表型分析，然后提取樣品RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后用qPCR檢測天麻軟化調(diào)控相關(guān)酶的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步從分子水平揭示天麻軟化機(jī)制和保鮮效應(yīng)奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2019年3月于陜西省漢中市略陽縣采挖新鮮天麻，當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，用清水清洗、晾干、去皮后切成1 cm厚的片狀，用3種不同方式處理(茶多酚涂膜、超高壓、茶多酚涂膜+超高壓)后，各個(gè)處理均稱取(250±2) g裝入聚乙烯塑料袋中，封口后存放于4 ℃冰箱中。

1.2 主要試劑及儀器

總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)、qPCR試劑盒、SYBR Premix Ex[寶生物工程(大連)有限公司，TaKaRa]；三氯甲烷、異丙醇、75%冷乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)水[上?？评噭┯邢薰綸；TRIzol(西安熱默爾生物科技有限公司)。PCR擴(kuò)增儀(美國伯樂公司)、恒溫水浴鍋(上海精密儀器儀表有限公司)、離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)、電子分析天平(奧豪斯公司)、蛋白核酸分析儀(美國Thermo公司)、電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備公司)、凝膠成像(英國Syngene公司)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 選取新鮮天麻，分別用3種方式(茶多酚涂膜、超高壓、茶多酚涂膜+超高壓)進(jìn)行處理。(1)茶多酚涂膜。在新鮮天麻表面均勻噴涂1.5%茶多酚保鮮液，陰涼避光處晾干后，裝入聚乙烯袋中保存。(2)超高壓處理。將新鮮天麻裝入聚乙烯袋中，封口后在20 ℃、300 MPa條件下超高壓處理10 min。(3)茶多酚涂膜+超高壓處理。在新鮮天麻表面均勻噴涂1.5%茶多酚保鮮液后，于陰涼避光處晾干，再將其裝入聚乙烯袋內(nèi)，封口后在20 ℃、300 MPa條件下超高壓處理10 min。

1.3.2 取樣及表型觀察 每7 d取樣1次，每次取出2片鮮切天麻，觀察樣品表型差異并拍照記錄。再將樣品切成小塊，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.3 RNA的提取 提取用不同方式處理的天麻樣品RNA的具體步驟如下：(1)取2 mL離心管，加入1 mL TRIzol，將試驗(yàn)樣品和研缽(160 ℃滅菌)從-80 ℃冰箱中取出，先向研缽中加入液氮預(yù)冷，再將樣品放入研缽中研磨，邊研磨邊補(bǔ)充液氮，研磨至粉末狀，用藥匙將粉末加入離心管中，做好標(biāo)記；(2)室溫靜置10 min使粉末充分裂解，于12 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，去除組織碎片，小心吸取上清(紅色)至新的2 mL離心管中；(3)向離心管中加入 200 μL 三氯甲烷(TRIzol體積的1/5)，蓋緊離心管蓋，劇烈振蕩15 s，待液體充分乳化后，冰上靜置 5 min，于12 000 r/min、4 ℃離心15 min；(4)從離心機(jī)中取出離心管，此時(shí)勻漿分為3層，上層為無色水相上清(RNA所在層)，中間層為白色蛋白層，下層為有機(jī)層，小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中并做好標(biāo)記，勿吸取白色中間層；(5)向上清液中加入與上清液等體積的異丙醇，上下輕柔顛倒，于室溫靜置10 min；(6)于12 000 r/min、4 ℃離心10 min；(7)輕輕倒掉上清液，沿離心管壁緩慢加入1 mL 75%預(yù)冷乙醇(提取RNA專用)，輕輕上下顛倒洗滌沉淀，于12 000 r/min、4 ℃離心5 min，小心倒掉75%乙醇；(8)室溫下干燥沉淀2～5 min，待乙醇完全揮發(fā)后，加入60 μL DEPC水溶解沉淀；(9)用核酸定量儀測定RNA濃度，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 RNA反轉(zhuǎn)為cDNA 參照PrimeScript(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成相應(yīng)的cDNA。1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL樣品RNA，補(bǔ)加Rnase Free dHO至10 μL，于42 ℃水浴2 min，即可得到消除基因組的DNA體系。在上述體系中，加入Reaction solution from Step 1 10 μL，5×Primerscript Buffer 2 4 μL，Primerscripr Mix 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，Rnase Free ddHO 4 μL，渦旋混勻，置于PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.3.5 引物的設(shè)計(jì) 為了篩選天麻中的軟化酶，本研究在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中查閱相關(guān)文獻(xiàn)，以了解軟化相關(guān)酶的種類，由于天麻軟化相關(guān)酶基因在NCBI數(shù)據(jù)庫上未見公布，因此選取與其同科植物的相關(guān)基因序列，用BLAST進(jìn)行比對，選取高度保守的序列，結(jié)合引物設(shè)計(jì)的原則，用Primer 5.0軟件，每個(gè)基因設(shè)計(jì)2～3對引物，共設(shè)計(jì)22對引物。

1.3.6 通過普通PCR法篩選引物 以cDNA為模板，按照PCR反應(yīng)體系將所需試劑依次加入PCR管中，具體反應(yīng)體系為0.6 μL模板DNA，7.5 μL Mix，0.7 μL上游引物，0.7 μL下游引物，5.5 μL滅菌水，總體積15 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)34次；72 ℃ 延伸30 s，72 ℃充分延伸10 min，12 ℃保存。

1.3.7 Real-time qPCR檢測軟化相關(guān)酶編碼基因的mRNA表達(dá)水平 Real-time qPCR的具體操作參照TaKaRa的說明書，每個(gè)基因做3個(gè)重復(fù)，20 μL 反應(yīng)體系：10 μL SYBR，1.6 μL上游引物(10 μmol/L)，1.6 μL下游引物(10 μmol/L)，2 μL cDNA模板，4.8 μL ddHO。采用兩步法PCR反應(yīng)程序，具體反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，循環(huán)50次；95 ℃延伸 15 s，72 ℃充分延伸10 min，12 ℃保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Excel 97-2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻保鮮過程中的表型分析

本試驗(yàn)每隔7 d取樣1次，同時(shí)拍照記錄樣品的表型。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，天麻在保鮮過程中的表型變化具有以下特征：(1)天麻在自然條件下(空白對照組)逐漸變軟，顏色由白色變成淡黃色；(2)經(jīng)茶多酚涂膜的天麻顏色與空白組相比差異不顯著，用刀不易切開；(3)經(jīng)過超高壓處理的天麻整體變脆，很容易用小刀切成塊狀，且有汁液流出；(4)用茶多酚涂膜并進(jìn)行超高壓處理的天麻水分較多，取樣后袋中有較多汁狀液體殘余，相較于其他3種處理方式樣品的顏色更深(圖1)。

2.2 RNA質(zhì)量的檢測

為了檢測RNA的質(zhì)量，隨機(jī)選取部分RNA樣品，并用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。從圖2可以看出，所有樣品總RNA的28S、18S RNA主峰單一、清晰無降解，說明提取的RNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)研究。

2.3 引物的篩選

由于在NCBI等數(shù)據(jù)庫中未檢索到天麻軟化相關(guān)酶的編碼基因序列，因此本試驗(yàn)選取多個(gè)與天麻同科或同種植物軟化相關(guān)酶的編碼基因序列，經(jīng)BLAST軟件比對，選取高度保守序列，結(jié)合引物設(shè)計(jì)原則，用Primer 5.0工具，每個(gè)基因設(shè)計(jì)2～3對引物，共設(shè)計(jì)22對引物，其中為內(nèi)參基因引物，引物序列見表1。

表1 天麻軟化表達(dá)酶相關(guān)基因引物

用PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由圖3、圖4可以看出，只有組織蛋白酶(Cathepsin)和過氧化物酶(POD)擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，其他引物均未檢測到條帶。

2.4 天麻軟化相關(guān)酶的表達(dá)趨勢

以空白樣(處理0 d)為對照進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并繪制成折線圖。由圖5可以看出，28 d前，PL、Cathepsin這2種酶的編碼基因的mRNA水平變化趨勢一致，都是先升后降；PME則前期出現(xiàn)一個(gè)快速下降的趨勢；Papain的表達(dá)水平為先升高再降低；POD相對表達(dá)量在處理28 d前與Papain相對表達(dá)

量變化趨勢相似，但在處理28 d后則迅速升高。

2.5 PL編碼基因的相對表達(dá)量

本試驗(yàn)通過qPCR檢測PL基因的mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PL在所有天麻樣品中都有表達(dá)，經(jīng)過茶多酚涂膜的樣品，其PL的相對表達(dá)量明顯低于空白組；用超高壓處理的天麻樣品，在處理14 d時(shí)PL的表達(dá)量顯著低于空白組，但是隨著保鮮時(shí)間的增加，PL的相對表達(dá)量明顯升高；用茶多酚涂膜+超高壓處理的天麻樣品，在處理14 d時(shí)的表達(dá)量極顯著高于空白對照組，并且隨著保鮮時(shí)間的增加，其表達(dá)量迅速降低(處理21 d左右)，之后有所上升，但表達(dá)水平的變化差異不明顯(表2)。

表2 PL的mRNA相對表達(dá)量

2.6 PME編碼基因的相對表達(dá)量

果膠甲酯酶可以降解植物細(xì)胞壁中的果膠，在植物中普遍表達(dá)。在處理時(shí)間為14 d時(shí)，茶多酚涂膜的天麻樣品中PME的表達(dá)量低于空白對照組，而在處理時(shí)間超過35 d后則高于空白對照組；經(jīng)茶多酚涂膜+超高壓處理的樣品在處理前21 d均低于空白對照組，在處理35 d時(shí)略有升高；超高壓處理樣品PME的相對表達(dá)量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(表3)。

表3 PME的mRNA相對表達(dá)量

2.7 POD編碼基因的相對表達(dá)量

過氧化物酶具有抗氧化性，經(jīng)qRCR檢測發(fā)現(xiàn)，處理14 d時(shí)，3種不同處理方式的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量均低于空白對照組，但在處理21 d時(shí)，經(jīng)超高壓處理的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量極顯著高于空白對照組，其他2種則與空白組差異不大；在處理28 d時(shí)，天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量均高于空白組，且茶多酚涂膜的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量提高了20倍；在處理35 d時(shí)，茶多酚涂膜、超高壓處理的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量顯著低于空白對照組，而茶多酚涂膜+超高壓處理的天麻樣品中POD的相對表達(dá)量與空白組略接近(表4)。

表4 POD的mRNA相對表達(dá)量

2.8 Papain編碼基因

為了分析Papain在天麻軟化過程中的表達(dá)情況，用qPCR檢測Papain編碼基因的表達(dá)水平。由表5可以看出，茶多酚涂膜處理的天麻樣品的Papain編碼基因相對表達(dá)量在處理前28 d均低于空白組，但在處理35 d后則略高于空白組；在超高壓處理下，天麻樣品的Papain編碼基因的相對表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對照組，在處理35 d時(shí)提高到處理7 d時(shí)的437倍左右；在茶多酚涂膜+超高壓處理下，天麻樣品的Papain編碼基因相對表達(dá)量在處理 14 d 時(shí)高于空白對照組，但在處理21 d時(shí)迅速降低，隨后又緩慢提高，但都低于對照。

表5 Papain的mRNA相對表達(dá)量

2.9 Cathepsin編碼基因的相對表達(dá)量

Cathepsin的主要功能是降解蛋白質(zhì)，經(jīng)qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，茶多酚涂膜處理的天麻樣品Cathepsin編碼基因的相對表達(dá)量始終低于空白對照組；在超高壓處理下，天麻樣品的Cathepsin編碼基因的相對表達(dá)量先升高后降低，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對照組；在茶多酚涂膜+超高壓處理下，天麻樣品的Cathepsin編碼基因的相對表達(dá)量在處理14 d時(shí)提高到處理7 d時(shí)的103倍，在處理21 d時(shí)提高至處理7 d時(shí)的8倍；在處理35 d時(shí)上升到處理7 d時(shí)的232倍(表6)。

表6 不同處理時(shí)間Cathepsin的mRNA相對表達(dá)量

3 討論

近年來，關(guān)于天麻保鮮的研究主要集中在生理生化指標(biāo)測定方面，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)研究正逐步向生物技術(shù)靠攏。大量研究發(fā)現(xiàn)，果蔬的軟化與細(xì)胞壁有密切關(guān)系，植物細(xì)胞壁的主要成分為纖維素、果膠，而高等植物細(xì)胞壁中果膠含量較高，是植物細(xì)胞間質(zhì)的重要成分，因此，與植物細(xì)胞壁有關(guān)的酶與天麻的軟化程度密切相關(guān)。目前關(guān)于天麻軟化相關(guān)酶的報(bào)道較少，本試驗(yàn)選取與天麻同科或同屬植物軟化相關(guān)酶的基因序列，用BLAST進(jìn)行序列比對，選取高度保守的序列，用Primer 5.0工具，每個(gè)基因設(shè)計(jì)2～3對引物，共設(shè)計(jì)22對引物，經(jīng)過普通PCR擴(kuò)增篩選及qPCR篩選，最終選取PL、PME、Papain、POD和Cathepsin等5種軟化酶進(jìn)行分析，分別在3種不同包裝方式的天麻樣品中檢測了上述軟化酶的表達(dá)差異。在天麻軟化過程中，這5個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平均受到影響，果膠裂解酶在經(jīng)茶多酚涂膜后表達(dá)量顯著降低，說明這種處理方式抑制了PL的表達(dá)，保鮮效果較好；而在經(jīng)過3種不同包裝方式處理后，PME的表達(dá)水平變化以顯著為主，說明PME的表達(dá)可能不受這3種包裝方式的影響；經(jīng)3種不同方式處理的天麻樣品貯藏35 d時(shí)POD的相對表達(dá)量均低于空白組，說明POD減緩了天麻的氧化程度，具有較好的保鮮效果；經(jīng)超高壓處理后，Papain的相對表達(dá)量升高，說明經(jīng)過這種方式促進(jìn)了Papain的表達(dá)，天麻軟化程度加深，但經(jīng)過茶多酚涂膜+超高壓處理后的天麻Papain的相對表達(dá)量比超高壓處理的天麻的表達(dá)量低，進(jìn)一步說明茶多酚涂膜的保鮮效果較好；茶多酚涂膜的天麻樣品種組織蛋白酶的相對表達(dá)量始終低于空白組，而其他處理方式的Cathepsin相對表達(dá)量升高，說明茶多酚涂膜有利于天麻的保鮮。綜上所述，茶多酚對天麻保鮮的效果較好，而超高壓處理反而促進(jìn)了天麻的軟化，推測可能是超高壓處理時(shí)的溫度、壓強(qiáng)和處理時(shí)間不佳造成的；在分子水平上，天麻軟化過程是由多個(gè)基因共同調(diào)控的，而本試驗(yàn)僅選取且研究了一小部分基因，不能夠完全展現(xiàn)天麻在保鮮過程中的軟化調(diào)控機(jī)制，天麻的軟化相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探索，本試驗(yàn)的結(jié)果可為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)，為天麻保鮮研究提供參考。