譚建福，饒麗娟，王秀

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，在全世界女性癌癥死亡原因占很大比例。據(jù)報道，全球每年有超過520 000名新增宮頸癌病人，每年因?qū)m頸癌死亡人數(shù)超過270 000［1］。由于巴氏涂片篩查試驗的廣泛實施，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率在過去30年內(nèi)有所下降，但晚期宮頸癌病人的預后仍較差，5年生存率約為15%［2］。因此，迫切需要深入了解宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制，為確定新的診斷和預后標志物提供基礎(chǔ)。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一種不具有編碼蛋白質(zhì)能力的RNA，長度＞200個核苷酸，可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在基因表達和細胞生物學功能中發(fā)揮作用［3-4］。大量研究表明lncRNAs與包括宮頸癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［5-6］。然而，目前關(guān)于宮頸癌發(fā)病和進展的LncRNAs較匱乏，以往報道顯示，lncRNA肝癌高表達轉(zhuǎn)錄本（highly upregulated in liver cancer，HULC）可促進胃癌、肝癌和骨肉瘤等腫瘤惡性進展，發(fā)揮致癌基因的功能［7-9］。近期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HULC在宮頸癌組織中表達量較高，但其是否參與宮頸癌細胞惡性生物學行為，目前未見相關(guān)報道［10］。目前研究發(fā)現(xiàn)，HULC與下游微小RNA（microRNAs，miRNA）存在作用靶點［11］，本研究前期通過生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)，HULC與miR-134-5p間存在相似結(jié)合位點。miR-134-5p可調(diào)控宮頸癌細胞增殖過程，具有一定抑癌作用。故本研究推測HULC可通過抑制miR-134-5p的表達參與宮頸癌的進展和預后。因此，本研究于2019年10月至2020年5月，探究HULC和miR-134-5p間的調(diào)控關(guān)系及對宮頸癌細胞生物學行為的影響，以期為宮頸癌的診斷提供潛在的標志物。

1 材料與方法

1.1 材料人正常宮頸上皮細胞Ect1/E6E7及宮頸癌細胞HeLa、Caski、SiHa、C-33A購自美國ATCC；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；特異性靶向HULC siRNA和非特異性siRNA、miR-134-5p模擬物（miR-134-5p mimics）、模擬物對照（mimics control）、miR-134-5p抑制劑（miR-134-5p inhibitors）、抑制劑物對照（inhibitors control）均購自廣州銳博；Trizol試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR熒光檢測試劑盒購自武漢塞維爾生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。Transwell小室購自美國Coring公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組將宮頸癌C-33A細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放置在體積分數(shù)為5%二氧化碳、37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，孵育24 h后更換培養(yǎng)基，穩(wěn)定孵育48 h，細胞貼壁生長匯合度達80%以上時，用胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)增殖期的細胞進行后續(xù)轉(zhuǎn)染實驗。將生長狀態(tài)良好的C-33A細胞接種到96孔板中，繼續(xù)孵育24 h，待細胞生長匯合約50%時，將特異性HULC siRNA和非特異性siRNA用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至C-33A細胞中，分別命名為si-HULC組和NC組，以未轉(zhuǎn)染的C-33A細胞命名為Control組，轉(zhuǎn)染后的細胞放置在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。特異性HULC siRNA序列：正向-5’-CCGGAAUAUUCUUUGUUUAUU-3’；反 向-5’-UAAACAAAGAAUAUUCCGGUU-3’；非 特異性siRNA序列：正向-5’-CCUUAUAUGUUCUGGAAUUUU-3’；反向-5’-UAAAACGAAUGGAAUUCACUU-3’。

1.3 qRT-PCR檢測細胞中HULC的表達采用Trizol法從正常宮頸上皮細胞Ect1/E6E7和宮頸癌細胞HeLa、Caski、SiHa、C-33A中提取RNA，si-HULC組和NC組C-33A細胞轉(zhuǎn)染48 h后，同樣以Trizol法提取細胞中RNA。使用超微量核酸蛋白檢測儀測定RNA的濃度和純度，選取合格的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，通過SYBR Green PCR熒光檢測試劑盒測定細胞中HULC相對表達水平，以18S rRNA作為內(nèi)部對照，反應(yīng)條件為：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，采用40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析熔解曲線，得出Ct值，采用2-ΔΔCt公式計算細胞中HULC相對表達量，實驗重復3次，取均值。引物：18S rRNA：正向引物5’-AGGATCCATTGGAGGGCAAGT-3’；反向引物5’-TCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCA-3’；HULC正向引物5’-TCATGATGGAATTGGAGCCTT-3’；反向引物5′-CTCTTCCTGGCTTGCAGATTG-3’。

1.4 CCK-8檢測C-33A細胞的增殖能力將各組C-33A細胞用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，以1×103個/孔接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3個平行復孔，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入20 μL CCK-8，37℃孵育1 h，在酶標儀上吸光度值（OD值），波長設(shè)為測定450 nm。

1.5 流式細胞術(shù)收集各組C-33A細胞，以PBS洗滌2次，加入適量1×Binding Buffer懸浮細胞并調(diào)整細胞至1×106個/毫升，向細胞懸液中添加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光反應(yīng)15 min，補加1×Binding Buffer緩沖液，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測。

1.6 Transwell實驗將Transwell小室置于24孔細胞培養(yǎng)板中，在小室的上室中加入50 μL以不含血清培養(yǎng)基稀釋的Matrigel基質(zhì)膠，待基質(zhì)膠凝固后備用。Transwell小室的下室添加600 μL含15%胎牛血清的培養(yǎng)基，收集各組細胞計數(shù)，取約1×104個細胞加入到Transwell小室的上室（侵襲實驗上室基底膜以Matrigel基質(zhì)膠包被，遷移實驗無需Matrigel包被），轉(zhuǎn)移小室于37℃培養(yǎng)箱48 h后取出，拭去上室細胞，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗去染色，晾干后在顯微鏡下（隨機選5個視野）觀察并計數(shù)。

1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炆镄畔W軟件LncBase Experimental v.2預 測結(jié)果 顯示，HULC與miR-134-5p存在相似結(jié)合位點，為進一步驗證HULC能夠靶向作用于miR-134-5p，將miR-134-5p與HULC結(jié)合位點的3’UTR擴增并構(gòu)建到熒光素酶報告基因載體上，記為HULC-Wt，并將miR-134-5p與HULC亂序結(jié)合位點的3’UTR構(gòu)建到熒光素酶報告基因載體上，記為HULC-Mut。將HULC-Wt和HULC-Mut與miR-134-5p mimics或mimics control共同轉(zhuǎn)染到C-33A細胞中，48 h后使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒分析各組細胞的相對熒光素酶活性。

1.8 轉(zhuǎn)染miR-135-5p inhibitor逆轉(zhuǎn)實驗為進一步驗證HULC靶向miR-134-5p調(diào)控宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移能力，本研究在抑制HULC表達的C-33A細胞中 轉(zhuǎn)染miR-134-5p inhibitor或inhibitor對照，分別記為si-HULC+anti-NC組和si-HULC+antimiR-134-5p組，采用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-134-5p的表達水平，miR-134-5p正向引物5’-ATCTGTGACTGGTTGACCAGAGG-3’；反 向 引 物5’-TGCAGGGTCCGAGGT-3’；U48正向引物5’-AGTGATGATGACCCCAGGTAACTC-3’；反向引物5′-CTGCGGTGATGGCATCAG-3’。采用CCK-8檢測、流式細胞術(shù)和Transwell實驗分析細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力，步驟同上。

1.9 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學分析，以上實驗均重復3次，取均值，計量資料以表示，兩組采用t檢驗分析相對熒光素酶活性，多組采用單因素方差分析HULC的表達量、細胞活力、凋亡率，以及侵襲和遷移細胞數(shù)，多組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗的方法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HULC在宮頸癌細胞中呈高表達qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與Ect1/E6E7細胞1.00±0.11相比，C-33A、Caski、SiHa、HeLa細 胞 中HULC的 表 達 量（3.49±0.40、2.26±0.21、1.77±0.19、1.95±0.24）明顯升高（F=39.92，P＜0.001），在各宮頸癌細胞系中，C-33A細胞中HULC的表達量最高（P＜0.05），因此選取C-33A細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 抑制HULC的表達對C-33A細胞增殖和凋亡的影響qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染HULC siRNA 48 h后C-33A細胞中HULC的表達量，結(jié)果顯示，與Control組和NC組比較，si-HULC組細胞中HULC的表達量明顯下調(diào)（P＜0.05）；Control組和NC組間相比，HULC的表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。CCK-8實驗檢測細胞增殖能力，與Control組和NC組比較，si-HULC組細胞活力顯著降低（P＜0.05）；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與Control組和NC組比較，si-HULC組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；Control組和NC組間相比，細胞OD值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1，圖1。

表1 各組C-33A細胞中HULC的表達量、細胞活力和凋亡率比較/

表1 各組C-33A細胞中HULC的表達量、細胞活力和凋亡率比較/

注：HULC為肝癌高表達轉(zhuǎn)錄本，OD為光密度。①與Control組比，P＜0.05。②與NC組比，P＜0.05。

組別Control NC si-HULC F值P值重復次數(shù)333 HULC 1.01±0.10 0.94±0.08 0.18±0.02①②113.52＜0.001 OD值0.64±0.11 0.59±0.08 0.38±0.05①②8.16 0.019凋亡率/%2.88±0.30 3.01±0.34 18.54±2.16①②147.79＜0.001

圖1 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

2.3 抑制HULC的表達對C-33A細胞侵襲和遷移的影響Transwell實驗結(jié)果顯示，見圖2，表2。si-HULC組侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)顯著少于Control組和NC組（P＜0.05）。

表2 Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力/

表2 Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力/

注：Control為對照，NC為非特異性siRNA，si-HULC為特異性HULC siRNA。①與Control組比，P＜0.05。②與NC組比，P＜0.05。

組別Control NC si-HULC F值P值重復次數(shù)333侵襲細胞數(shù)120.15±16.24 112.54±13.86 46.28±10.16①②26.58 0.001遷移細胞數(shù)176.33±20.04 158.65±18.66 78.18±10.80①②28.43 0.001

2.4 HULC抑制miR-134-5p的表達在線軟件LncBase Experimental v.2預測 結(jié)果 顯示，HULC和miR-134-5p有靶向結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，在HULC-Wt組中，轉(zhuǎn)染miR-134-5p mimics的細胞相對熒光度酶活性明顯低于miRNC組（P＜0.05）；在HULC-Mut組中，兩組細胞相對熒光度酶活性無明顯改變（P＜0.05）。為進一步驗證HULC對miR-134-5p表達的負向調(diào)控作用，本研究qRT-PCR檢測抑制HULC的表達后對miR-134-5p表達的影響，結(jié)果顯示，與NC組（1.00±0.09）相比，si-HULC組細胞中miR-134-5p表達（2.45±0.24）顯著升高（t=16.37，P＜0.05）。見圖3，表3。

表3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測HULC和miR-134-5p的相互作用/

表3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測HULC和miR-134-5p的相互作用/

注：miR-NC為模擬物對照，miR-134-5p為miR-134-5p模擬物，HULC-Wt為HULC野生型載體，HULC-Mut為HULC突變型載體。

組別miR-NC miR-134-5p t值P值重復次數(shù)。33 HULC-Wt 1.00±0.10 0.23±0.02 22.65＜0.001 HULC-Mut 1.00±0.09 0.99±0.09 0.24 0.817

圖3 在線軟件LncBase Experimental v.2預測HULC和miR-134-5p結(jié)合位點

2.5 抑制miR-134-5p的表達對C-33A細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與si-HULC組 和si-HULC+anti-NC組 比，si-HULC+anti-miR-134-5p組 細 胞 中miR-134-5p的 表達水平明顯降低（P＜0.05）。CCK-8實驗結(jié)果顯示，與si-HULC組和si-HULC+anti-NC組比，si-HULC+anti-miR-134-5p組細胞OD值顯著升高（P＜0.05）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與si-HULC組和si-HULC+anti-NC組比，si-HULC+anti-miR-134-5p組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。Transwell實驗結(jié)果顯示，與si-HULC組 和si-HULC+anti-NC組 比，si-HULC+anti-miR-134-5p組侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均明顯增多（P＜0.05）。si-HULC組和si-HULC+anti-NC組相比，以上各指標均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4，5；表4。

表4 抑制miR-134-5p對C-33A細胞增殖、侵襲和遷移的影響/

表4 抑制miR-134-5p對C-33A細胞增殖、侵襲和遷移的影響/

注：si-HULC為特異性HULC siRNA，si-HULC+anti-NC為特異性HULC siRNA+抑制劑對照，si-HULC+anti-miR-134-5p為特異性HULC siRNA+miR-134-5p抑制劑，OD為光密度。①與si-HULC組比，P＜0.05。②與si-HULC+anti-NC組比，P＜0.05。

組別si-HULC si-HULC+anti-NC si-HULC+anti-miR-134-5p F值P值重復次數(shù)333 miR-134-5p 1.00±0.10 0.99±0.11 0.18±0.02①②88.57＜0.001 OD值0.39±0.05 0.41±0.04 0.61±0.06①②17.30 0.003凋亡率18.14±2.25 19.22±2.43 8.27±1.14①②26.72 0.001侵襲細胞數(shù)48.02±10.04 47.96±8.64 96.28±12.12①②21.70 0.002遷移細胞數(shù)80.20±9.24 82.36±10.58 156.82±16.15①②37.39＜0.001

圖4 抑制miR-134-5p的表達對C-33A細胞凋亡的影響

3 討論

宮頸癌是全球常見的婦科惡性腫瘤之一，也是全世界女性癌癥死亡的主要原因［12］。探索宮頸癌發(fā)生的分子機制有利于開發(fā)宮頸癌的新療法。本研究首次探討了lncRNA HULC和miR-134-5p在宮頸癌中的表達模式和生物學功能。越來越多的證據(jù)表明，LncRNA可以在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因，參與機體多種生長發(fā)育和病理過程［13-14］。多項研究表明，lncRNA可作為致癌基因或抑癌基因參與腫瘤發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移、預后和診斷［15-16］。在先前的研究中，發(fā)現(xiàn)HULC表達上調(diào)參與調(diào)控肝癌、胃癌、前列腺癌等腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移［17-19］。以往研究結(jié)果表明，HULC可能在腫瘤細胞生物學行為中發(fā)揮重要功能。近期發(fā)現(xiàn)HULC在宮頸癌中表達亦呈高表達，且與病人預后不良密切相關(guān)［10］。但關(guān)于HULC與宮頸癌細胞生物學功能的研究鮮有報道，因此，本研究旨在探究HULC對宮頸癌細胞生物學行為的影響及分子機制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HULC在宮頸癌細胞中的表達顯著高于人正常宮頸上皮細胞Ect1/E6E7。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，在宮頸癌C-33A細胞中轉(zhuǎn)染HULC siRNA后HULC的表達顯著下調(diào)，提示轉(zhuǎn)染HULC siRNA可有效抑制HULC的表達。此外本研究發(fā)現(xiàn)，抑制HULC的表達后C-33A細胞OD值降低，凋亡率升高，侵襲和遷移細胞數(shù)減少，表明抑制HULC的表達可抑制宮頸癌C-33A細胞增殖、侵襲和遷移能力，誘導細胞凋亡。因此，推測HULC對宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用。

lncRNA在人類疾病中的重要性可能與它們通過各種機制影響細胞功能的能力有關(guān)［20-21］。受到“競爭性內(nèi)源RNA”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的啟發(fā)，假設(shè)HULC也可作為ceRNA，因此需尋找與HULC相互作用的潛在的miRNA。為支持這一觀點，本研究采用生物信息學分析軟件預測與HULC相互作用的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-134-5p與HULC可形成互補堿基配對。此外通過雙熒光素酶報告基因驗證了HULC與miR-134-5p相互作用。qRT-PCR檢測結(jié)果進一步驗證了HULC可負向調(diào)控miR-134-5p的表達。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-134-5p可通過靶向整合素β1抑制非小細胞肺癌A549和H1299細胞的侵襲和遷移［22］。湯繼英等［23］研究發(fā)現(xiàn)，miR-134-5p的過表達不僅可以抑制人宮頸癌細胞體外增殖和細胞周期進程，還可以誘導細胞凋亡。結(jié)合本研究結(jié)果提示，抑制HULC的表達抑制宮頸癌C-33A細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移與上調(diào)miR-134-5p的表達有關(guān)。為進一步驗證該結(jié)論，本研究在抑制HULC表達的C-33A細胞中轉(zhuǎn)染miR-134-5p抑制物，檢測發(fā)現(xiàn)，抑制miR-134-5p的表達后可逆轉(zhuǎn)HULC表達下調(diào)導致的C-33A細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用，逆轉(zhuǎn)HULC表達下調(diào)誘導的細胞凋亡，表明HULC靶向調(diào)控miR-134-5p參與宮頸癌細胞生物學行為的調(diào)控。

綜上所述，本研究證明HULC在宮頸癌組織和細胞中表達上調(diào)，體外抑制宮頸癌C-33A細胞中HULC的表達可抑制細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力，其作用機制可能與上調(diào)miR-134-5p的表達有關(guān)。關(guān)于miR-134-5p調(diào)控下游靶基因的研究本實驗暫未涉及，后續(xù)研究將進一步探究。隨著HULC的深入研究，其可能成為宮頸癌的潛在預后生物標志物和治療靶點。