周防震，周 志，劉水松，龔琪雯，陳夢潔，鄢鵬飛

（1.硒食品營養(yǎng)與健康智能技術湖北省工程研究中心，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000）

硒是人體必需的微量元素之一，其生理功能已經(jīng)得到國內外專家的廣泛認可。研究表明，克山病、大骨節(jié)病以及其他免疫性疾病均與人體硒元素缺乏有關［1］。土壤中的無機硒主要是通過高等植物的同化作用進入食物鏈而被人體攝入的。國內有22個省、72%的人口生活的地方存在缺硒現(xiàn)象，這導致在缺硒地區(qū)的人體硒攝入量不足，存在低硒引發(fā)疾病的隱患［2］。因此，篩選富硒的植物尤其是富硒中藥及富硒農(nóng)產(chǎn)品具有重要的現(xiàn)實意義。

藤茶（Amepelopsis grossedentata）是一種非常古老的中草藥資源、類茶植物資源和藥食兩用植物資源［3］，具有抗炎、止咳、化痰和保肝護肝等多種生理活性［4］。研究表明，藤茶有效成分為黃酮類物質，主要成分為二氫楊梅素和楊梅素，其中前者占藤茶總黃酮的70%以上。藤茶活性成分二氫楊梅素的保肝護肝、抗腫瘤、降血糖等藥理研究已有大量報道。盡管市場上廣有富硒藤茶的宣傳，但藤茶富硒方面的研究罕見報道。周成河等［5］通過藤茶盆栽試驗，發(fā)現(xiàn)隨著亞硒酸鈉含量的升高，藤茶硒含量呈先降后升的規(guī)律；張朝陽等［6］通過藤茶大田試驗，發(fā)現(xiàn)隨著富硒生物有機肥用量的增加，藤茶嫩茶莖葉硒含量呈上升趨勢。迄今，對藤茶富硒方面的研究以藤茶扦插苗為主，未見硒肥對藤茶實生苗硒富集的報道。本研究在前期藤茶硒含量抽樣檢測的基礎上，針對龍須藤茶硒含量普遍不足的問題，繼續(xù)深入研究藤茶內生真菌在藤茶實生苗硒富集中的作用，以期為藤茶的大田富硒栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤茶成熟漿果采集于湖北省恩施市七里坪藤茶基地。引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）由上海英駿生物技術有限公司合成。改良馬丁培養(yǎng)基（真菌培養(yǎng)基）購于杭州微生物試劑有限公司；NaClO購于武漢市中天化工有限責任公司；TaqDNA聚合酶購于TAKARA公司；鹽酸、氫氧化鉀、硼氫化鉀（均為優(yōu)級純）和亞硒酸鈉（化學純）購于國藥集團化學試劑有限公司；硒標準溶液購于環(huán)境保護部標準樣品研究所。

1.2 主要儀器

所用儀器有ABI-2720 PCR擴增儀、Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)、Milli-Q Advantage超純水系統(tǒng)、MARS微波消解儀和AFS-930d原子熒光光度計。

1.3 方法

1.3.1 藤茶內生真菌的分離 用無菌水將藤茶種子表面沖洗干凈，用75%乙醇浸泡2 min，用無菌水沖洗3次，5%次氯酸鈉處理10 min，無菌水沖洗3次。將消毒的藤茶種子接種到PDA培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h。挑取菌絲接種到改良馬丁培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。挑取菌落邊緣菌絲轉接于分離培養(yǎng)基平板，得到藤茶種子源優(yōu)勢內生真菌的純培養(yǎng)體。

1.3.2 內生真菌的基因組提取 稱取少量的菌絲體（0.04 g），加入0.5 mL 1.5%（m/V）CTAB抽提液在預冷研缽中充分研磨；將研磨液轉入1.5 mL離心管中，立即置于65℃水浴10 min，再加入200 μL乙酸銨（10 mol/L）冰浴8 min，12 000 r/min離心10 min；吸取上層水相至另一1.5 mL離心管中，加入0.5～0.6倍體積的冰預冷的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置15 min，12 000 r/min離心15 min，棄上清，75%乙醇洗滌兩次，自然晾干，加入適量ddH2O，放入-20℃冰箱保存，待用。利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組提取情況。

1.3.3 ITS序列擴增 取PCR管，在其中添加以下各種反應液：ddH2O 7 μL、模板DNA 2 μL、上下游引物各0.5 μL、TaqDNA聚合酶（含dNTP混合物）10 μL、總體積20 μL；PCR擴增程序如下：95℃5 min；95℃30 s，58℃1 min，72℃30 s，30個循環(huán)；72℃ 延伸10 min，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物；PCR擴增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司武漢分公司進行ITS序列測定。

1.3.4 藤茶實生苗的制備及移栽 將藤茶種子按常規(guī)方法育苗，待實生苗長度在4～7 cm時移入大田（北緯30°17′44″，東經(jīng)109°29′48″，海拔440 m）；大田土壤為黃棕壤，硒背景值為0.75 mg/kg。5周后進行內生真菌處理；晴天早晚各澆水一次。

1.3.5 內生真菌孢子懸液的制備及田間試驗 血球計數(shù)板計數(shù)后，將內生真菌孢子懸液調整為高、低濃度兩組，其濃度分別為5.0×106、2.5×106CFU/mL。藤茶實生苗共分為4個處理，分別為生理鹽水對照組（CK）、根際施硒組（T1）和高（T2）、低（T3）濃度孢子懸液葉面噴施+根際施硒組，每處理組6株藤茶，重復3次。其中根際施硒量為每株50 mL濃度為80 mg/L亞硒酸鈉溶液，而噴施以葉面有液滴滴落為標準。

1.3.6 藤茶硒含量的測定 內生真菌處理1個月后，收集藤茶莖尖至下方4層葉片，60℃干燥至恒重，放研缽中充分研磨待用。精確稱取藤茶粉末0.200 g加入5 mL硝酸和1.25 mL H2O2，用微波消解儀以1 000 W、150℃消解40 min。于通風櫥中180℃條件下趕酸至終體積1 mL左右，加入鹽酸5 mL，繼續(xù)趕酸至1 mL左右，然后用8%的鹽酸定容至25 mL，待用。采用原子熒光光譜法，按照GB 5009.93—2017［7］測定硒濃度。硒標準品溶液經(jīng)稀釋后終濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin2019進行硒標準曲線繪制，使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 內生真菌的分離

分離得到一株藤茶種子源優(yōu)勢內生真菌LZC-1，在改良馬丁培養(yǎng)基上培養(yǎng)可見白色菌絲（圖1a），光學顯微鏡下可見明顯鐮刀型孢子（圖1b）。

圖1 LZC-1菌落及分生孢子形態(tài)

2.2 內生真菌的分子鑒定

分離純化得到的內生真菌LZC-1經(jīng)基因組提取，進行瓊脂糖凝膠電泳。該基因大小在10 kb以上（圖2），表明該基因組DNA提取成功。對LZC-1的rDNA-ITS序列進行PCR擴增，電泳檢測結果顯示該基因片段大小為500 bp（圖3）左右，符合真菌通用引物擴增ITS基因序列片段的大小。將擴增出來的ITS序列測序，發(fā)現(xiàn)其片段長度為538 bp，將測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對和系統(tǒng)進化樹分析（圖4），發(fā)現(xiàn)內生真菌LZC-1與鐮孢菌屬菌種（Fusariumsp.）最為相似，與形態(tài)學觀察結果一致。

圖2 內生真菌LZC-1基因組DNA電泳圖譜

圖3 內生真菌LZC-1 ITS序列擴增片段電泳圖譜

圖4 LZC-1的系統(tǒng)進化樹分析

2.3 內生真菌對藤茶硒富集的影響

硒濃度在1～50 μg/L范圍內，熒光值與濃度間有良好的線性關系，y=17.875 55+83.466 49x，R2=0.999 45（圖5）。

圖5 硒溶液的標準曲線

根據(jù)標準曲線計算得藤茶供試樣本中的硒含量如表1所示，可以看出高、低濃度內生真菌處理均能顯著降低藤茶對硒的富集（P＜0.01），且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關系（P＜0.05），高濃度內生真菌孢子懸液的抑制作用強于低濃度內生真菌孢子懸液。

表1 LZC-1處理對藤茶中硒富集的影響

3 討論

藤茶屬于葡萄科蛇葡萄屬的一種藤本植物，隨著生理藥理功能不斷被發(fā)現(xiàn)［8，9］，已開始被越來越多的人所青睞。藤茶及其總黃酮在抗氧化、降血糖、降血脂等方面表現(xiàn)出較好的活性，被認為是防治慢性代謝性疾病的一個非常有前景的研究對象；2013年藤茶葉被國家衛(wèi)生計生委批準為新食品原料［10］。來鳳藤茶是國家地理標志性保護產(chǎn)品，目前，來鳳縣藤茶產(chǎn)業(yè)基地面積達3 333 hm2，年產(chǎn)值近10億元［6］。人工栽培的藤茶均采用枝條進行無性繁殖，除了有性繁殖需要增加育苗環(huán)節(jié)［11］以外，有性繁殖的藤茶種子育苗出苗率低，出苗晚及出苗不整齊等現(xiàn)象［11］也是其進行無性繁殖的重要原因。本研究也發(fā)現(xiàn)自然條件下藤茶種子萌發(fā)需要70 d以上，且萌發(fā)率只有5%左右。而同是葡萄科的植物葡萄，其種子通常在第7～9天開始萌發(fā)，且萌發(fā)率為19.4%～78.8%［12］。葡萄實生苗因壽命長、生長發(fā)育快、分生力和抗寒性強等優(yōu)點，在生產(chǎn)上被廣泛用作砧木培育葡萄耐寒性品系。前期研究發(fā)現(xiàn)無性繁殖的藤茶扦插苗帶有多種內生菌，這些內生菌對藤茶萌發(fā)和硒富集的影響尚未見報道，亟待評估。

本研究從藤茶種子中分離和鑒定了一株優(yōu)勢內生真菌LZC-1，發(fā)現(xiàn)利用該菌的孢子懸液葉面噴施能顯著降低宿主實生苗對土壤中硒的富集；同時發(fā)現(xiàn)根際施硒可以顯著增加藤茶實生苗葉片中硒的富集。富硒栽培提高藤茶硒含量的結果與已有報道一致［5，6］。前期藤茶硒含量抽樣檢測結果顯示，原產(chǎn)世界硒都湖北恩施來鳳縣的21家藤茶企業(yè)的龍須藤茶硒含量均值為0.030 4 mg/kg（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。本研究中對照組藤茶中硒含量的測定值為0.36 mg/kg，明顯高于龍須藤茶硒含量，可能原因是試驗過程中采樣的不同。有報道顯示，老葉中的硒含量高于嫩葉硒含量［13，14］；龍須藤茶是采用莖尖（龍須）部位，而本研究采樣為藤茶莖尖至下方4層葉片。80 mg/L亞硒酸鈉溶液根際施硒30 d后藤茶硒含量可以達1.48 mg/kg，與文獻報道［15］結果基本一致。內生真菌LZC-1顯著降低藤茶硒富集的結果暗示，內生真菌的積累以及富硒技術的缺乏可能是導致目前大田龍須藤茶硒富集不足的重要原因。