祁 宏 李智超 史志強(qiáng)

（1）國科溫州研究院（溫州生物材料與工程研究所），溫州市生物物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325000；2）山西大學(xué)，復(fù)雜系統(tǒng)研究所，太原 030006）

線粒體是真核細(xì)胞制造能量的場(chǎng)所，被稱為“動(dòng)力工廠”；近些年的研究表明它也是細(xì)胞死亡的“調(diào)控中心”。這與線粒體的雙層膜結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，該結(jié)構(gòu)將線粒體分為外膜、膜間隙、內(nèi)膜和基質(zhì)4部分［1］。雖然線粒體外膜起界膜作用，但由于其上有孔蛋白構(gòu)成的通道，通透性很高，所以膜間隙中的離子環(huán)境幾乎與細(xì)胞質(zhì)相同［1］。內(nèi)膜的不通透性限制了所有分子和離子的自由通過，導(dǎo)致膜間隙和基質(zhì)之間存在質(zhì)子電化學(xué)梯度，構(gòu)成呼吸鏈合成ATP的必備條件［2］。膜間隙的細(xì)胞色素c雖是呼吸鏈的組成成分，卻也是細(xì)胞死亡的重要因子?；|(zhì) 中 的 線 粒 體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）雖負(fù)責(zé)部分線粒體蛋白質(zhì)的合成，但也參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡［3-4］。

細(xì)胞死亡是生物體的一項(xiàng)基本生命過程，其方式多種多樣，主要包括凋亡、焦亡、鐵死亡、壞死性凋亡等［5］。凋亡是一種“溫和”的死亡方式，不會(huì)引起炎癥或免疫反應(yīng)，在胚胎發(fā)育和成體組織自穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用。焦亡是一種“劇烈”的死亡方式，其特征在于細(xì)胞膜的破裂和由此產(chǎn)生的炎癥誘導(dǎo)因子的釋放，在防御病毒和細(xì)菌感染過程中起重要作用［6］。過度的細(xì)胞死亡將導(dǎo)致阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生［7-8］，而不足的細(xì)胞死亡則促進(jìn)腫瘤的形成［9］。因此在過去的30年中，對(duì)細(xì)胞死亡的研究（尤其是以信號(hào)通路為主的分子機(jī)制研究）一直是生命科學(xué)的熱門研究領(lǐng)域。

各種細(xì)胞死亡方式雖具有不同的形態(tài)和分子特征，但均受到各自信號(hào)通路的嚴(yán)密調(diào)控。近期的一系列研究表明：各細(xì)胞死亡方式的信號(hào)通路不是孤立存在的，它們之間存在交叉關(guān)聯(lián)［10］，線粒體正是它們交流的“主戰(zhàn)場(chǎng)”［11］。維持線粒體雙層膜的完整性是保持線粒體正常功能的關(guān)鍵，因此線粒體內(nèi)外膜的完整性及其遭到破壞后導(dǎo)致的不同細(xì)胞命運(yùn)成為國內(nèi)外學(xué)者研究的焦點(diǎn)。

1 線粒體外膜通透與細(xì)胞凋亡

1.1 Bcl-2蛋白家族

細(xì)胞凋亡是研究得最為深入的細(xì)胞死亡方式，關(guān)于其分子機(jī)制的研究已比較透徹，它可通過受體途徑（外源途徑）和線粒體途徑（內(nèi)源途徑）發(fā)生。線粒體凋亡途徑主要依賴于線粒體外膜通透（mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），而MOMP的發(fā)生主要受Bcl-2蛋白家族成員之間相互作用的精密調(diào)控（圖1a）。

根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及在MOMP中所發(fā)揮的作用，可將Bcl-2蛋白家族成員劃分為3大類［12-13］：a.效應(yīng)者（effectors，如Bak和Bax），一般為包含3個(gè)BH結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白，被激活后可通過寡聚化在線粒體外膜上形成孔道，促使MOMP發(fā)生；b.保護(hù)者（guardians，如Bcl-2和Bcl-XL），大多為包含4個(gè)BH結(jié)構(gòu)域的抗凋亡蛋白，可通過與效應(yīng)者結(jié)合從而抑制其活性；c.起始者（initiators），因其只含1個(gè)BH結(jié)構(gòu)域（即BH3結(jié)構(gòu)域），也被稱為BH3-only蛋白，屬于促凋亡蛋白，可通過調(diào)控效應(yīng)者或保護(hù)者促使MOMP發(fā)生。起始者又可進(jìn)一步細(xì)分為：可直接激活效應(yīng)者的激活者（activators，如Bid和Bim），以及間接激活效應(yīng)者的致敏者（sensitizers，如Bad），它可以通過抑制保護(hù)者減弱后者對(duì)效應(yīng)者的抑制作用，從而達(dá)到間接激活效應(yīng)者的目的［14］。需要指出的是，很多激活者也可發(fā)揮致敏者的作用。

Fig.1 The major processes of mitochondrial apoptosis pathway圖1 線粒體凋亡途徑的主要過程

1.2 線粒體外膜通透調(diào)控凋亡

當(dāng)細(xì)胞受到生存壓力時(shí)，會(huì)將壓力信號(hào)傳遞給Bcl-2蛋白家族中的激活者，激活者的BH3結(jié)構(gòu)域插入效應(yīng)者的疏水域使后者發(fā)生構(gòu)象改變從而處于激活狀態(tài)［15］。激活的效應(yīng)者單體首先在線粒體外膜上形成二聚物，然后進(jìn)一步以二聚物為基礎(chǔ)形成不同的寡聚物［16］，最后這些寡聚物在線粒體外膜上形成直徑為幾十到幾百納米的“指環(huán)狀”結(jié)構(gòu)［17-18］，促使MOMP發(fā)生。

MOMP的發(fā)生常被看做是細(xì)胞凋亡的不可逆點(diǎn)。這是因?yàn)镸OMP發(fā)生之后，原本位于線粒體膜間隙的一些物質(zhì)，如細(xì)胞色素c和Smac便會(huì)釋放到細(xì)胞質(zhì)中，引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)（圖1b）。一方面，細(xì)胞色素c與單體形式的Apaf1結(jié)合，引起后者構(gòu)象改變，隨后在ATP或dATP參與下，7個(gè)Apaf-1細(xì)胞色素c復(fù)合物與4分子Procaspase 9組裝成“車輪狀”的凋亡體［19-20］，從而激活Caspase 3，降解細(xì)胞內(nèi)數(shù)百種蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［21］。另一方面，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的XIAP可以抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，但是它的活性可被Smac抑制［22］，從而達(dá)到間接促進(jìn)凋亡之目的。

1.3 線粒體外膜通透的三種程度及相應(yīng)的細(xì)胞命運(yùn)

傳統(tǒng)觀念常將MOMP是否發(fā)生看成是凋亡的開關(guān)，這是因?yàn)槿藗兺ǔ０l(fā)現(xiàn)MOMP是一個(gè)“全或無”的事件［11］。然而最近的研究表明存在一些例外情況，比如當(dāng)細(xì)胞遭受某些亞死亡刺激時(shí)會(huì)發(fā)生少量MOMP（minority MOMP），即一個(gè)細(xì)胞內(nèi)僅有少數(shù)線粒體發(fā)生MOMP現(xiàn)象［23-24］。雖然發(fā)生少量MOMP并不會(huì)使細(xì)胞凋亡，但是它仍然會(huì)激活少量Caspase 3，使核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生微弱活性，從而使DNA有限損傷并引發(fā)基因組不穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［24-25］。

因此，在一般情況下，健康存活的細(xì)胞中無MOMP發(fā)生，而凋亡細(xì)胞中所有線粒體均發(fā)生MOMP；在一些病理情況下，細(xì)胞中僅有少量線粒體發(fā)生MOMP，引起細(xì)胞癌變（圖2）?；诒菊n題組已發(fā)表的理論模型所得結(jié)果［26］，認(rèn)為此現(xiàn)象可用非線性動(dòng)力學(xué)中的“三穩(wěn)態(tài)”機(jī)制解釋（待發(fā)表）。

Fig.2 Three distinct settings of MOMP and the corresponding cell fates圖2 線粒體外膜通透的三種程度及相應(yīng)的細(xì)胞命運(yùn)

2 線粒體內(nèi)膜通透與炎癥反應(yīng)

2.1 cGAS-STING信號(hào)通路

凋亡是一種非炎癥的死亡方式，這已是教科書式的觀點(diǎn)。然而近年來的研究顯示，由Bcl-2蛋白家族效應(yīng)者Bak/Bax介導(dǎo)的MOMP不僅可以決定細(xì)胞是否凋亡，還可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，激活機(jī)體免疫應(yīng)答；這與新近鑒定出來的環(huán)狀鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）信號(hào)通路密切相關(guān)［27-28］。

細(xì)胞質(zhì)中游離的DNA被宿主的固有免疫系統(tǒng)當(dāng)做一種危險(xiǎn)信號(hào)，cGAS-STING信號(hào)通路是宿主從檢測(cè)這類信號(hào)到啟動(dòng)防御機(jī)制的重要途徑［29］。當(dāng)病毒或細(xì)菌感染細(xì)胞后，釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的DNA會(huì)被胞質(zhì)DNA受體cGAS識(shí)別，從而催化ATP和GTP合成第二信使環(huán)狀GMP-AMP（cyclic GMP-AMP，cGAMP）［30］，它 與 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 膜 上 的STING蛋白結(jié)合，導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生變化并形成二聚體，繼而寡聚化［31］。STING寡聚體作為信號(hào)平臺(tái)招募并激活TANK-結(jié)合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1），TBK1進(jìn)一步磷酸化STING，從而招募并磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）［32］。磷酸化的IRF3形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子功能產(chǎn)生干擾素β（interferon-β，IFN-β），觸發(fā)炎癥反應(yīng)［33］。cGAS-STING信號(hào)通路可激活免疫系統(tǒng)殺死癌細(xì)胞，已在癌癥免疫療法中顯現(xiàn)出巨大前景［34-35］。

線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（mitochondria antiviral signaling protein，MAVS）也在固有免疫信號(hào)通路中扮演重要角色［36］，它的激活依賴于其線粒體外膜定位功能［37］。MAVS通過信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng) 活 化NF-κB（nuclear factor kappa-B）、IRF3、IRF7等信號(hào)蛋白，進(jìn)而啟動(dòng)干擾素基因的表達(dá)，達(dá)到抑制病毒復(fù)制和傳播之目的［37-38］。鑒于主題和篇幅的限制，本文僅討論cGAS-STING信號(hào)通路調(diào)控炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

2.2 線粒體內(nèi)膜通透引發(fā)炎癥反應(yīng)

cGAS既可識(shí)別來自病毒或細(xì)菌等病原微生物的DNA，也可識(shí)別病理?xiàng)l件下泄露到細(xì)胞質(zhì)的自身DNA，如核DNA和mtDNA［39］。當(dāng)正常細(xì)胞中缺乏Caspase蛋白或其活性受到抑制時(shí)，mtDNA可激活cGAS-STING通路，產(chǎn)生IFN-β并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)；但在凋亡細(xì)胞中Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以抑制該過程［40-41］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Caspase 3可通過切割cGAS、IRF3等cGAS-STING通路中的關(guān)鍵物質(zhì)抑制IFN-β的產(chǎn)生，從而避免發(fā)生炎癥反應(yīng)［42］。這些研究成功解決了細(xì)胞凋亡如何維持天然免疫沉默這一重要的科學(xué)問題，但mtDNA如何從線粒體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)卻未被清楚解釋。近期，科學(xué)家利用超高分辨率顯微鏡技術(shù)揭示：當(dāng)細(xì)胞開始凋亡時(shí)，Bak/Bax通過寡聚化引發(fā)MOMP，釋放出細(xì)胞色素c以激活Caspase 3；與此同時(shí)Bak/Bax形成的寡聚物不斷聚合，形成巨大孔洞，使線粒體內(nèi)膜透過外膜突出，從而導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜通透（mitochondrial inner membrane permeabilization，MIMP），釋 放mtDNA［43-44］。

據(jù)此提出如下設(shè)想（圖3）：低階Bak/Bax聚合物介導(dǎo)MOMP的發(fā)生和細(xì)胞色素c的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［21，45］；而高階Bak/Bax聚合物介導(dǎo)MIMP的發(fā)生和mtDNA的釋放，引起炎癥反應(yīng)。因?yàn)榍罢叩陌l(fā)生不僅先于后者，而且快于后者，所以凋亡細(xì)胞可以憑借Caspase 3的激活阻止炎癥發(fā)生。本課題組已針對(duì)這一設(shè)想建立了數(shù)學(xué)模型并取得了合理的結(jié)果（待發(fā)表）。

Fig.3 The interplay between apoptosis and inflammation regulated by MOMP and MIMP圖3 線粒體內(nèi)外膜通透調(diào)控的細(xì)胞凋亡和炎癥之間的互作

3 線粒體通透性轉(zhuǎn)換與細(xì)胞焦亡

3.1 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔

通透性轉(zhuǎn)換孔（permeability transition pore，PTP）位于線粒體內(nèi)膜，在正常生理情況下，其呈瞬時(shí)開放狀態(tài)，這對(duì)于維持一些重要的細(xì)胞活動(dòng)是必需的；但在病理?xiàng)l件下，其呈持續(xù)性開放狀態(tài)，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，引發(fā)神經(jīng)退行性疾病［46-47］。

鈣離子（Ca2+）經(jīng)線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入線粒體［48］，線粒體鈣穩(wěn)態(tài)在細(xì)胞生理學(xué)和病理學(xué)中均起關(guān)鍵作用［48-49］。三羧酸循環(huán)是糖、脂肪和蛋白質(zhì)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的共同通路，包括8個(gè)反應(yīng)步驟，其中的兩步必須依賴于Ca2+。三羧酸循環(huán)的最終產(chǎn)物通過其下游的氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生ATP，從而保證生物體各項(xiàng)生命活動(dòng)的能量供應(yīng)。因?yàn)槿人嵫h(huán)和氧化磷酸化反應(yīng)均發(fā)生在線粒體內(nèi)，所以需要有適量的Ca2+由細(xì)胞質(zhì)不斷地流入線粒體［50-51］。此外，氧化磷酸化反應(yīng)在產(chǎn)生ATP的同時(shí)，會(huì)生成少量的活性氧。適量的Ca2+和活性氧可刺激PTP瞬時(shí)開放，使部分Ca2+釋放出去，避免線粒體鈣超載［52］。

但細(xì)胞處于病理狀態(tài)時(shí)，會(huì)有過量的Ca2+涌入線粒體，同時(shí)生成大量的活性氧，二者的強(qiáng)烈作用誘導(dǎo)PTP持續(xù)性開放，水和小分子物質(zhì)自由通過PTP流入基質(zhì)，稱為線粒體通透性轉(zhuǎn)換（mitochondrial permeability transition，MPT）［53］。

MPT會(huì)使線粒體內(nèi)部的滲透壓發(fā)生改變，導(dǎo)致其內(nèi)膜膨脹，進(jìn)而撐破外膜，引起細(xì)胞死亡［54］。

3.2 線粒體通透性轉(zhuǎn)換調(diào)控焦亡

早在2005年就有研究指出MPT會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞以非凋亡的方式（尤其是不依賴于Bcl-2蛋白家族的方式）死亡［55-56］，但到底以何種形式死亡成了一個(gè)懸而未決的問題。細(xì)胞焦亡是近年來提出的一種新的細(xì)胞炎性死亡方式，Caspase家族部分成員常參與其上游信號(hào)通路，而下游信號(hào)通路很大程度上依賴于Gasdermin家族，其中Gasdermin E（GSDME）為焦亡的主要執(zhí)行蛋白之一［57-58］。GSDME被Caspase 3切割后釋放的片段在細(xì)胞膜上寡聚化穿孔，水分子等物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞導(dǎo)致胞膜破裂和內(nèi)容物釋放，發(fā)生焦亡［59］。近日的一項(xiàng)研究解釋了MPT引發(fā)焦亡的作用機(jī)制［60］。

該研究揭示不同的刺激條件（鈣超載、膽汁酸、腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)子1激活劑誘導(dǎo)）可通過觸發(fā)MOMP或MPT，選擇性激活凋亡或焦亡信號(hào)通路（圖4）。具體來說，低刺激強(qiáng)度觸發(fā)MOMP，緩慢釋放出細(xì)胞色素c，與Apaf1和Procaspase 9形成凋亡體，逐漸激活Caspase 3，切割PARP（實(shí)驗(yàn)上用于檢測(cè)凋亡是否發(fā)生的一種底物）引發(fā)凋亡；高刺激強(qiáng)度觸發(fā)MPT，迅速釋放出細(xì)胞色素c，與Apaf1和Procaspase 4/11形成焦亡體（化學(xué)計(jì)量比為7∶2），快速激活Caspase 3，切割GSDME引發(fā)焦亡［60］。

Fig.4 The regulation of apoptosis and pyroptosis by MOMP and MPT圖4 線粒體外膜通透和通透性轉(zhuǎn)換對(duì)細(xì)胞凋亡和焦亡的調(diào)控

基于上述研究以及本課題組新近的理論工作［21］，提出如下假說：在低刺激強(qiáng)度下，細(xì)胞質(zhì)Ca2+的提升激活Bcl-2蛋白家族中的激活者Bid，觸發(fā)MOMP導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；在高刺激強(qiáng)度下，線粒體Ca2+過載，觸發(fā)MPT導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。

4 線粒體膜完整性與細(xì)胞命運(yùn)

線粒體雙層膜的完整性是線粒體發(fā)揮正常功能乃至細(xì)胞存活的關(guān)鍵因素，其遭到破壞后一方面會(huì)使線粒體功能受損，無法產(chǎn)生能量，另一方面會(huì)釋放出一些物質(zhì)，引發(fā)不同的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡、焦亡或炎癥（圖5）。在凋亡誘導(dǎo)因子的刺激下，Bcl-2蛋白家族成員Bak/Bax在線粒體外膜上聚合形成小孔，促發(fā)MOMP，細(xì)胞色素c通過該孔釋放到細(xì)胞質(zhì)中，引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。在此過程中，Bak/Bax形成的小孔通過聚合不斷擴(kuò)大成宏孔，促發(fā)MIMP，mtDNA通過宏孔釋放到細(xì)胞質(zhì)中，引發(fā)cGAS-STING級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞產(chǎn)生炎癥。發(fā)生凋亡的細(xì)胞中，由于細(xì)胞色素c和mtDNA的釋放存在動(dòng)力學(xué)方面的差異，以及Caspase 3對(duì)cGASSTING信號(hào)通路的抑制，所以觀察不到炎癥現(xiàn)象；但若Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)受到抑制，則發(fā)生炎癥反應(yīng)。低強(qiáng)度的應(yīng)激水平一般通過MOMP導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，高強(qiáng)度的應(yīng)激水平可使PTP持續(xù)性開放，水和小分子物質(zhì)通過它流入基質(zhì)，促發(fā)MPT，使線粒體內(nèi)膜膨脹撐破外膜，引發(fā)Caspase 4/11-Caspase 3-GSDME級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生焦亡。

Fig.5 The regulation of cell fate by mitochondrial membrane integrity圖5 線粒體膜完整性對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控

5 總結(jié)與展望

線粒體是真核生物細(xì)胞內(nèi)最重要的細(xì)胞器之一，因此存在多種途徑調(diào)控線粒體質(zhì)量［61］，主要包括線粒體生物發(fā)生、線粒體融合與分裂、線粒體自噬［62］。線粒體自噬是細(xì)胞通過自噬的方式清除受損傷線粒體的過程，Pink1（PTEN induced putative kinase 1）/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是目前研究最為深入的機(jī)制［63-64］。Pink1招募并激活Parkin的過程即包含前饋機(jī)制［65］，又包含反饋機(jī)制［66］，從理論上來講很可能蘊(yùn)含復(fù)雜的非線性動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象。這些重要且有趣的問題也值得研究者們高度關(guān)注。

線粒體膜完整性的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡、焦亡或炎癥反應(yīng)，在很多重要疾病中發(fā)揮重要作用［67］。雖然科學(xué)界近期在此方面取得了重大突破，但仍有許多重要問題有待進(jìn)一步研究，如：影響MOMP發(fā)生的其他因素，MIMP發(fā)生的詳細(xì)機(jī)制，PTP的分子鑒定，MOMP與MPT的偶聯(lián)機(jī)制，細(xì)胞如何處理MOMP、MIMP和MPT構(gòu)成的復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)等。解決這些問題，一方面需要針對(duì)單細(xì)胞和單分子的實(shí)時(shí)超分辨等生物技術(shù)的不斷發(fā)展［68］，另一方面需要借助生化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理、非線性動(dòng)力學(xué)理論、統(tǒng)計(jì)物理規(guī)律等構(gòu)建合適的理論模型［20-21，47，69-71］。通過生物實(shí)驗(yàn)與理論模型的結(jié)合，將有助于深入了解線粒體膜完整性調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的復(fù)雜調(diào)節(jié)機(jī)制，促進(jìn)學(xué)科的交叉與融合，并為癌癥和神經(jīng)退行性疾病的診斷和治療提供理論依據(jù)和制定最優(yōu)策略。