趙玉榮 王 麗 李幸凡 張黎民 王 棟 陳翠霞

（中國石油大學(xué)（華東）化學(xué)化工學(xué)院，青島 266580）

硅元素在地球上的含量非常豐富，二氧化硅由于具有生物相容性好、機(jī)械強(qiáng)度高、光學(xué)性質(zhì)優(yōu)異等特殊性能，近些年來在非均相催化、酶固定、生物傳感和微電子等技術(shù)領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景［1-6］。通過化學(xué)合成法可制備二氧化硅納米材料，但該傳統(tǒng)方法往往很難控制二氧化硅材料的精細(xì)結(jié)構(gòu)，同時(shí)反應(yīng)條件苛刻，常需要在高溫高壓下進(jìn)行，且反應(yīng)需要引入有機(jī)化學(xué)試劑，導(dǎo)致大量有毒副產(chǎn)物的產(chǎn)生，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此，迫切需要開發(fā)一種高效、低毒且反應(yīng)條件溫和的二氧化硅納米材料的制備方法。

生物礦化是由生物體在生物大分子的調(diào)控下形成無機(jī)礦物的過程，該過程在溫和條件下便能形成更為精密的結(jié)構(gòu)，且展示出優(yōu)異的性能［7-8］，例如，硅藻殼是硅藻細(xì)胞的細(xì)胞壁，具有精致的分層多孔結(jié)構(gòu)，它的主要成分二氧化硅可為硅藻細(xì)胞提供出色的支撐與保護(hù)作用［9-10］。海綿可通過生物礦化的方式，利用海洋中的硅酸形成二氧化硅結(jié)構(gòu)［11］。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成相比，生物礦化所需反應(yīng)條件溫和，在常溫常壓、pH值接近中性的條件下即可進(jìn)行，且反應(yīng)無有毒副產(chǎn)物，可有效減少對(duì)環(huán)境的污染。正因如此，通過模擬生物礦化過程，在體外構(gòu)建具有類似性能的先進(jìn)功能材料已發(fā)展成為生物化學(xué)、材料化學(xué)和納米技術(shù)等交叉學(xué)科的研究熱點(diǎn)。近年來，隨著研究工作的不斷推進(jìn)，人們對(duì)生物礦化機(jī)理有了較深的認(rèn)識(shí)，成功從生物體中提取了與礦化相關(guān)的生物大分子并在體外仿生合成了尺寸和形貌不同的二氧化硅納米材料，如納米球、納米管、納米棒等，這些納米材料在生物探針、生物分離以及生物運(yùn)輸?shù)确矫嬲故境隽己玫膽?yīng)用前景［10，12-13］。在上述研究過程中，人們發(fā)現(xiàn)了一些重要的生物分子，如從硅藻和海綿骨針中分離提取的siliffins［14］、silacidins［3］和silicatein［15-16］等，可在常溫常壓、中性條件下誘導(dǎo)二氧化硅的沉積。在誘導(dǎo)過程中，這些生物大分子中含有的氨基、咪唑基和胍基等是導(dǎo)致硅化反應(yīng)進(jìn)行的重要基團(tuán)［17］。然而，從生物體中直接提取生物大分子進(jìn)行體外礦化不僅成本較高且提取過程中生物大分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)容易遭到破壞。同時(shí)，這些生物大分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的體外調(diào)控相對(duì)復(fù)雜，這在一定程度上限制了該方法的推廣和應(yīng)用。因此，模擬天然生物大分子的結(jié)構(gòu)，人工合成生物小分子并利用礦化反應(yīng)制備無機(jī)納米材料有助于人們拓寬制備的生物無機(jī)材料的種類和性質(zhì)。

多肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類小分子，通過調(diào)整氨基酸的種類和排列順序，可設(shè)計(jì)合成不同的多肽。由于堿性氨基酸中含有參與生物礦化反應(yīng)的活性基團(tuán)，人們首先將目光瞄準(zhǔn)了它們。Patwardhan等［18］利用聚賴氨酸分子進(jìn)行了二氧化硅的仿生礦化，發(fā)現(xiàn)礦化產(chǎn)物的形貌受賴氨酸的手性控制，這為二氧化硅仿生礦化提供了新思路。然而，聚肽的分子質(zhì)量相對(duì)較大，純化困難且自組裝行為不易調(diào)控，這為解釋二氧化硅納米材料的形成機(jī)制帶來了困難。相比之下，小分子短肽結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于合成和進(jìn)行組裝體形貌調(diào)控，可為二氧化硅納米材料的合成提供豐富的模板，同時(shí)可為反應(yīng)機(jī)理的探索提供方便。最近，Nguyen等［19］合成了一種雙功能肽，考察了其在蛋白質(zhì)凈化和二氧化硅沉淀中的應(yīng)用，但他們制備的二氧化硅主要為球形顆粒。本課題組以超短肽I3K自組裝形成的納米纖維為模板，正硅酸乙酯（TEOS）為硅源，在不同條件下仿生礦化制備二氧化硅納米材料，發(fā)現(xiàn)短肽組裝體在不同條件下可誘導(dǎo)TEOS水解并最終形成二氧化硅納米管，通過改變pH值和放置時(shí)間可有效調(diào)節(jié)納米管的尺寸。在礦化過程中，肽同時(shí)具有成核劑和催化劑的作用。值得注意的是，由于I3K形成納米纖維的尺寸較小，仿生礦化制備的二氧化硅納米管的尺寸也相對(duì)較小［20-21］。最近，Wang等［22］考察了系列非對(duì)稱Bola型短肽的自組裝行為，并以KI3E和KI4E構(gòu)筑的組裝體為模板仿生礦化得到了二氧化硅和二氧化鈦納米材料。盡管他們制備的納米管的尺寸仍然較小，但是成功合成了尺寸較大的納米帶結(jié)構(gòu)，為大尺寸納米材料的制備提供了思路［22］。

二氧化硅納米管的尺寸和形貌可顯著影響其性質(zhì)，因此制備尺寸不同的納米管可促進(jìn)其在不同領(lǐng)域的應(yīng)用。前期針對(duì)Bola型多肽Ac-KI3VK-CONH2自組裝行為的研究表明，該多肽在溶液為酸性或中性、濃度為32 mmol/L時(shí)可自組裝形成尺寸約為40 nm的納米管結(jié)構(gòu)［23］。為進(jìn)一步拓寬仿生礦化二氧化硅納米管的尺寸，本文以Ac-KI3VK-CONH2自組裝形成的納米管為模板進(jìn)行仿生礦化，制備二氧化硅納米材料。首先考察了Ac-KI3VK-CONH2納米管的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)該納米管在稀釋、加入甲醇或乙醇、改變?nèi)芤簆H值時(shí)形貌均遭到破壞，展示出較差的穩(wěn)定性。為盡可能保證多肽納米管在礦化過程中的模板作用，實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)速率較快的TMOS為前驅(qū)體，仿生礦化制備二氧化硅，系統(tǒng)考察了乙醇加入量、硅源濃度、硅源種類、溶液pH值等因素對(duì)二氧化硅形貌和尺寸的影響。在此基礎(chǔ)上，討論了二氧化硅納米管的形成機(jī)理。通過條件優(yōu)化，仿生礦化成功制備出規(guī)則有序且尺寸較大的二氧化硅納米管。該研究設(shè)計(jì)的短肽分子質(zhì)量小、易于合成，其特異的原位催化作用使其形成的組裝體可直接用于二氧化硅的仿生礦化。研究工作的開展為拓寬二氧化硅納米管的尺寸和實(shí)現(xiàn)其在不同領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 多肽純度表征

1.1.1 質(zhì)譜

配制1 g/L的多肽溶液，并以TA30（乙腈∶含0.1%三氟乙酸的超純水（30∶70，v/v））作為溶劑配制飽和α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）溶液。按照體積比為1∶1將兩種溶液進(jìn)行充分混合，取2.5 μl混合溶液滴在干凈的靶板上，待溶劑揮發(fā)干之后，將樣品靶板放入儀器中進(jìn)行分析。

1.1.2 高效液相色譜

配制1 g/L的多肽溶液，用0.22 μm的水系濾頭過濾至液相瓶中，然后放入樣品倉中進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)。采用C18反相液相色譜分析柱對(duì)多肽的純度進(jìn)行檢測(cè)，待基線平穩(wěn)后，用A相和B相對(duì)樣品逐級(jí)梯度洗脫，其中流動(dòng)相A為含0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液，B相為含0.1%TFA的乙腈，流動(dòng)相的流速設(shè)定為0.6 ml/min，進(jìn)樣量為60 μl，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波長為214 nm。梯度洗脫條件：0～1 min，A相95%，B相5%；1～45 min，A相95%～5%，B相5%～95%；45～50 min，A相5%～95%，B相95%～5%。

1.2 溶液配制

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，配制濃度為32 mmol/L的Ac-KI3VK-CONH2溶液。具體配制方法如下：使用電子天平準(zhǔn)確稱量多肽并溶解在超純水中，通過超聲和渦旋促使其完全溶解。如果多肽未完全溶解，可繼續(xù)用85℃水浴加熱溶液2 h以促其溶解。用NaOH將溶液調(diào)至目標(biāo)pH值，最后將配制好的溶液室溫靜置1周后進(jìn)行形貌表征。

1.3 多肽組裝體的二級(jí)結(jié)構(gòu)表征

實(shí)驗(yàn)采用圓二色譜儀（CD）和傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）表征了多肽組裝體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3.1 CD表征

為防止氙燈在高溫下受空氣氧化而損壞，在實(shí)驗(yàn)開始前先通氮?dú)?0 min，以排除裝置中的空氣。選擇厚度為0.1 mm的樣品池測(cè)定其二級(jí)結(jié)構(gòu)。具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：波長范圍為190～260 nm，步長為1 nm，光源帶寬為0.5 nm，狹縫寬度為1 mm，掃描速度為120 nm/min。樣品檢測(cè)前，首先對(duì)樣品所對(duì)應(yīng)的溶劑（水）進(jìn)行信號(hào)收集，并將其作為樣品背景進(jìn)行扣除。待背景扣除后檢測(cè)多肽樣品，3次測(cè)量后取平均值，利用Bio-Logic軟件進(jìn)行曲線平滑。

1.3.2 FTIR表征

為了防止H2O對(duì)酰胺I帶測(cè)量峰的影響，實(shí)驗(yàn)前用D2O代替H2O進(jìn)行樣品配制，利用NaOD調(diào)節(jié)pD值。實(shí)驗(yàn)中采用CaF2樣品池，厚度為0.1 mm的聚四氟乙烯墊片，采集光譜范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為64次。樣品數(shù)據(jù)采集時(shí)，先扣除溶劑背景，之后采用OMINC軟件對(duì)光譜曲線進(jìn)行平滑和基線校正。

1.4 組裝體的形貌表征

1.4.1 原子力顯微鏡（AFM）

取少量多肽溶液滴到新鮮云母片上，吸附2 min左右，用純水沖掉多余溶液，再用氮?dú)鈱⒃颇钙系臉悠反蹈?，放置在樣品臺(tái)上。利用輕敲模式（tapping mode）進(jìn)行圖像掃描。實(shí)驗(yàn)采用TESP-V2型單晶硅探針，掃描頻率為1.00 Hz，掃描角度為0o，圖片分辨率為512×512。待圖片采集完畢后，利用原子力自帶軟件對(duì)圖片進(jìn)行處理分析。

1.4.2 透射電子顯微鏡（TEM）

取5～10 μl多肽溶液滴于封口膜表面，將干凈的銅網(wǎng)吸附在液滴上（吸附時(shí)間約為2 min），吸附完畢后晾干銅網(wǎng)。利用染色劑醋酸雙氧鈾進(jìn)行染色，染色時(shí)間大約為8 min，待銅網(wǎng)徹底晾干后進(jìn)行形貌表征。對(duì)制備的二氧化硅，首先將產(chǎn)物凍干，然后取少量?jī)龈僧a(chǎn)物利用乙醇分散并吸附于銅網(wǎng)，待銅網(wǎng)徹底晾干后進(jìn)行形貌表征。實(shí)驗(yàn)采用JEOL JEM-2100UHR型透射電子顯微鏡，加速電壓設(shè)定為200 kV，利用Gatan CCD采集圖像。

1.4.3 低溫透射電子顯微鏡（Cryo-TEM）

取5～10 μl多肽溶液滴在微柵支持膜上，吸附3～8 s后，迅速投入預(yù)先冷卻好的-165℃液態(tài)乙烷中，隨后將玻璃化樣品轉(zhuǎn)入液氮中，再將制好的樣品轉(zhuǎn)移到樣品桿中。利用JEOL JEM-1400透射電子顯微鏡于約-174℃成像，加速電壓為120 kV。

1.5 二氧化硅的仿生礦化

首先配制濃度為32 mmol/L的Ac-KI3VKCONH2溶液，在室溫下放置1周以保證體系形成納米管，然后將溶解（或分散）在溶劑（水、乙醇或者水和乙醇的混合體系）中的硅源TMOS與多肽溶液混合，再將溶液pH值調(diào)到目標(biāo)值，室溫靜置一定時(shí)間使其充分礦化并將礦化后的溶液凍干。利用乙醇將產(chǎn)物分散，通過TEM表征形成二氧化硅納米材料的形貌。系統(tǒng)考察了礦化過程中乙醇加入量、硅源濃度、硅源種類、以及pH值對(duì)礦化結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)中溶液的總體積為900 μl，其中包含組裝后的多肽溶液500 μl和TMOS混合溶液400 μl。

2 結(jié)果與討論

2.1 多肽純度鑒定

首先，實(shí)驗(yàn)利用反相-高效液相色譜儀（RPHPLC）及基質(zhì)輔助的激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）對(duì)多肽Ac-KI3VK-CONH2的純度進(jìn)行了表征（圖S1）?？梢钥闯觯珹c-KI3VK-CONH2的RP-HPLC譜圖在保留時(shí)間為13.6 min時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)強(qiáng)度較大且尖銳的單峰，沒有其他雜峰出現(xiàn)，說明多肽純度較高。通過對(duì)峰面積積分發(fā)現(xiàn)其純度達(dá)98%以上。質(zhì)譜圖中（圖S1b）有3個(gè)峰出現(xiàn)，它們分別對(duì)應(yīng)Ac-KI3VK-NH2與氫離子（755.3）、鈉離子（777.3）和鉀離子（793.3）的結(jié)合峰，無其他雜峰出現(xiàn)，說明多肽純度很高，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 多肽組裝體的形貌表征

研究利用負(fù)染色TEM、Cryo-TEM以及AFM對(duì)多肽組裝體的形貌進(jìn)行表征。

2.2.1 TEM和Cryo-TEM表征

本文首先用負(fù)染色TEM和Cryo-TEM對(duì)Ac-KI3VK-CONH2溶液在pH值為3.0時(shí)形成組裝體的形貌進(jìn)行了表征（圖1）。負(fù)染色TEM結(jié)果（圖1a）表明體系形成了尺寸較大且均一的組裝體，其邊緣兩側(cè)各有一條白色亮線，這主要是由染色劑在組裝體內(nèi)部沉積造成的［24］，證明體系形成了納米管結(jié)構(gòu)，這些納米管的直徑約為42 nm（圖1a中的插圖）。相比于負(fù)染色TEM，Cryo-TEM的制樣不需要干燥和染色，能夠避免制樣過程對(duì)樣品的破壞，有助于保持組裝體的真實(shí)形貌。因此，本文進(jìn)一步通過Cryo-TEM對(duì)Ac-KI3VK-CONH2形成組裝體的形貌進(jìn)行了表征（圖1b），可以看出，組裝體的邊緣有兩條平行的黑線，進(jìn)一步證明Ac-KI3VKCONH2自組裝形成了納米管。

Fig.1 Negative-TEM and Cryo-TEM images of Ac-KI3VK-CONH2self-assemblies formed at the concentration of 32 mmol/L and pH value of 3.0

2.2.2 AFM表征

與TEM相比，AFM不僅可表征組裝體形貌，還能夠有效表征組裝體的高度信息。本文利用AFM詳細(xì)表征了Ac-KI3VK-CONH2形成組裝體的形貌和高度信息（圖2）?？梢钥闯?，Ac-KI3VK-CONH2形成了納米管結(jié)構(gòu)，管口清晰可見（圖2a中白色箭頭所示）。高度分析表明管的厚度約為4 nm（圖2b），是Ac-KI3VK-CONH2分子長度的兩倍，說明納米管的管壁為單層。

Fig.2 AFM images and the cross-section profile of Ac-KI3VK-CONH2 nanotubes

2.3 組裝體的二級(jí)結(jié)構(gòu)表征

研究利用CD和FTIR表征了組裝體的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3）。

CD結(jié) 果 表 明，Ac-KI3VK-CONH2溶 液 在～215 nm處呈現(xiàn)一個(gè)負(fù)吸收峰，在～198 nm處呈現(xiàn)一個(gè)正吸收峰，表明Ac-KI3VK-CONH2形成納米管的二級(jí)結(jié)構(gòu)為β折疊［25］。FTIR譜圖在～1 622 cm-1處有一個(gè)強(qiáng)吸收峰，進(jìn)一步證明了Ac-KI3VK-CONH2組裝體的二級(jí)結(jié)構(gòu)為β折疊［26］。此外，F(xiàn)TIR譜圖中1 674 cm-1附近的吸收峰是多肽合成過程中殘余的三氟乙酸（TFA）造成的［27］。

Fig.3 CD and FTIR spectra of Ac-KI3VK-CONH2 self-assemblies formed at the concentration of 32 mmol/L

2.4 納米管的穩(wěn)定性考察

為了以Ac-KI3VK-CONH2形成的納米管為模板仿生礦化二氧化硅，本文首先對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行了詳細(xì)考察。

2.4.1 稀釋對(duì)Ac-KI3VK-CONH2形成納米管的穩(wěn)定性影響

研究配制了32 mmol/L的Ac-KI3VK-CONH2溶液，室溫放置1周后加入超純水稀釋至16 mmol/L，利用負(fù)染色TEM表征了稀釋后組裝體的形貌（圖S2a）。可以看出，此時(shí)組裝體中包含很多螺旋帶，說明當(dāng)多肽濃度降低至16 mmol/L時(shí)，部分納米管轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪龓ЫY(jié)構(gòu)，表明納米管的穩(wěn)定性較差。

2.4.2 有機(jī)溶劑對(duì)Ac-KI3VK-CONH2形成納米管的穩(wěn)定性影響

研究配制了32 mmol/L的Ac-KI3VK-CONH2溶液，分別加入等體積的甲醇或乙醇將其濃度稀釋至16 mmol/L，考察了甲醇和乙醇對(duì)形成納米管的穩(wěn)定性影響（圖S2b，S3）?？梢钥闯?，甲醇的加入使組裝體由納米管轉(zhuǎn)變成較細(xì)的扭轉(zhuǎn)帶。這主要是由于甲醇的加入會(huì)降低體系的疏溶劑作用，導(dǎo)致β折疊的側(cè)向堆積能力減弱，使組裝體寬度明顯減小。同時(shí)，本文考察了乙醇對(duì)Ac-KI3VK-CONH2形成納米管的穩(wěn)定性影響，發(fā)現(xiàn)乙醇的引入可顯著破壞納米管結(jié)構(gòu)。圖S3給出了加入50%乙醇對(duì)Ac-KI3VK-CONH2納米管結(jié)構(gòu)的影響。隨著乙醇加入，納米管變成了無序片層和細(xì)纖維結(jié)構(gòu)。造成上述現(xiàn)象的主要原因是，相比于甲醇，乙醇極性顯著降低，導(dǎo)致多肽在水/乙醇混合溶劑中的溶劑化程度較水/甲醇中顯著降低，組裝能力減弱，最終形成了無序結(jié)構(gòu)。在有機(jī)溶劑甲醇或乙醇存在時(shí)，Ac-KI3VK-CONH2形成的納米管結(jié)構(gòu)均被破壞，表現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性。

2.4.3 溶液pH值對(duì)Ac-KI3VK-CONH2形成納米管的穩(wěn)定性影響

配制32 mmol/L的Ac-KI3VK-CONH2溶液，室溫放置1周，用NaOH將其pH調(diào)至8.0，利用TEM表征此時(shí)形成組裝體的形貌（圖S2c）。與pH值為3.0時(shí)相比，pH為8.0時(shí)形成的組裝體形貌發(fā)生了明顯變化，主要為不均勻的納米帶，只有少量納米管存在。造成這一現(xiàn)象的主要原因是：當(dāng)溶液pH值從3.0升高至8.0時(shí)，Ac-KI3VK-CONH2中兩端K側(cè)鏈上的氨基部分去質(zhì)子化，大大降低了多肽分子間的靜電斥力，破壞了多肽自組裝過程中的非共價(jià)鍵力平衡，導(dǎo)致了納米管的解體。這表明，Ac-KI3VK-CONH2形成的納米管在溶液pH值較高時(shí)不能穩(wěn)定存在。

綜上所述，Ac-KI3VK-CONH2在濃度為32 mmol/L時(shí)形成的納米管不穩(wěn)定，在稀釋、加入有機(jī)溶劑和改變pH值時(shí)形貌均被破壞，因此實(shí)驗(yàn)選用反應(yīng)速率較快的TMOS作為硅源進(jìn)行反應(yīng)制備二氧化硅納米材料，以盡可能減小實(shí)驗(yàn)條件的改變對(duì)Ac-KI3VK-CONH2形成納米管結(jié)構(gòu)的破壞。

2.5 二氧化硅仿生礦化

2.5.1 乙醇加入量對(duì)二氧化硅形貌的影響

實(shí)驗(yàn)以TMOS為硅源，首先將其分散在溶劑中（水或水和乙醇的混合物），然后加入已經(jīng)放置1周的多肽溶液中，進(jìn)行礦化反應(yīng)。在TMOS混合溶液中，TMOS的體積為20 μl，乙醇加入量分別取0、200、380 μl（總體積為400 μl，其余為水），調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0，礦化時(shí)間為4 d。待礦化反應(yīng)結(jié)束后將樣品凍干，利用乙醇分散，通過TEM表征乙醇含量不同時(shí)礦化得到的二氧化硅納米材料的形貌（圖4）。

Fig.4 TEM images of silica obtained after 4 d incubation by using TMOS as silicon source and with different amounts of ethanol at pH 7.0

TEM結(jié)果表明，乙醇加入量不同的體系均形成了二氧化硅納米管，且其形貌隨乙醇加入量無明顯變化。當(dāng)不加入乙醇時(shí)，納米管的外壁附著一層均勻的納米二氧化硅，粒徑分析表明此時(shí)形成二氧化硅納米管的直徑為50 nm左右，略大于多肽Ac-KI3VK-CONH2形成納米管的尺寸，這主要是由于二氧化硅在多肽納米管的外壁沉積造成的。盡管TMOS在水中不溶解，在沒有乙醇，僅將其分散在水中即可保證礦化反應(yīng)的進(jìn)行。因此，下述實(shí)驗(yàn)體系中均未加入乙醇，僅用水分散TMOS，以降低有機(jī)溶劑乙醇的加入對(duì)多肽納米管結(jié)構(gòu)的破壞。

2.5.2 硅源濃度對(duì)二氧化硅形貌的影響

本部分考察了硅源TMOS的濃度對(duì)二氧化硅形貌和尺寸的影響。移取500 μl孵化1周的多肽溶液與TMOS含量不同（總體積為400 μl，TMOS含量分別為20、40、80 μl）的水溶液混合，再將溶液pH值用NaOH調(diào)至7.0，礦化4 d后將礦化產(chǎn)物冷凍干燥。利用乙醇分散產(chǎn)物并用TEM表征其形貌（圖5）。

Fig.5 TEM images of silica obtained after 4 days incubation by using different amounts of TMOS as silicon source at pH 7.0

結(jié)果表明，加入20 μl TMOS時(shí)，納米管外壁沉積的二氧化硅排列致密有序，礦化效果最為理想，粒徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明此時(shí)二氧化硅納米管的管徑為50 nm左右（圖5a）。增加TMOS含量至40 μl時(shí)，礦化得到二氧化硅納米管的管壁明顯增厚，形成納米管邊緣仍較為平滑，但礦化產(chǎn)物中開始出現(xiàn)塊狀不規(guī)則的成分（圖5b）。繼續(xù)增加TMOS含量至80 μl時(shí)，形成二氧化硅納米管表面出現(xiàn)明顯毛刺，納米管厚度不均勻，同時(shí)產(chǎn)物中出現(xiàn)大量不規(guī)則產(chǎn)物并覆蓋在二氧化硅納米管表面（圖5c）。造成上述現(xiàn)象的主要原因是，當(dāng)增加TMOS含量時(shí)，其局部濃度顯著增加，礦化反應(yīng)速率過快，導(dǎo)致納米管管徑不均勻，同時(shí)出現(xiàn)塊狀或者膜狀結(jié)構(gòu)。因此，TMOS的加入量顯著影響礦化產(chǎn)物二氧化硅的形貌。當(dāng)溶液總體積為900 μl，TMOS含量為10～30 μl時(shí)得到二氧化硅納米管的尺寸較均勻，且表面較平滑。

2.5.3 硅源種類對(duì)二氧化硅形貌的影響

由于Ac-KI3VK-CONH2形成納米管的穩(wěn)定性較差，本文均以反應(yīng)速率較快的TMOS作為硅源進(jìn)行礦化，以降低溶液條件改變對(duì)多肽Ac-KI3VK-CONH2形成納米管的破壞，保證反應(yīng)模板的完整性。為考察硅源種類對(duì)礦化結(jié)果的影響，本部分用反應(yīng)速率較慢的TEOS代替TMOS作為硅源進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。研究首先將TEOS分散在水中，然后與500 μl組裝1周的多肽Ac-KI3VK-CONH2溶液混合，用NaOH將溶液pH值調(diào)至7.0，礦化4 d后將產(chǎn)物冷凍干燥。利用乙醇分散產(chǎn)物，通過TEM進(jìn)行表征（圖6）。

Fig.6 TEM images of silica obtained after 4 d incubation by using different silicon source as the precursors at pH 7.0

結(jié)果表明，以TEOS為硅源時(shí)，肽納米管表面只沉積了少量二氧化硅，礦化效果不理想，這是由于TEOS的水解縮聚速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于TMOS，在礦化過程中，TEOS的水解縮聚只產(chǎn)生少許的硅烷水解縮聚產(chǎn)物，因而只有少量二氧化硅可以附著在尺寸較大的管壁上，多數(shù)產(chǎn)物不規(guī)則；而以TMOS作為硅源的體系中，則得到了尺寸均勻的二氧化硅納米管，說明以TMOS為硅源的礦化效果比TEOS理想。這表明，由于尺寸較大的多肽納米管穩(wěn)定性差，使用反應(yīng)速率較快的TMOS更利于制備出形貌和尺寸均一的二氧化硅納米管。

2.5.4 溶液pH值對(duì)二氧化硅形貌的影響

本部分考察了溶液pH值對(duì)二氧化硅形貌的影響，將500 μl放置1周的多肽溶液與400 μl TMOS溶液（20 μl TMOS+380 μl水）混合，分別調(diào)節(jié)pH值至5.0、7.0、8.0以及9.0，礦化4 d后將產(chǎn)物冷凍干燥，乙醇分散后利用TEM表征其形貌（圖7）。

Fig.7 TEM images of silica obtained after 4 d incubation by using TMOS as silicon source at different pH values

TEM結(jié)果表明，在pH為5.0時(shí)，礦化效果不理想，僅形成了少量的二氧化硅納米管，產(chǎn)物中存在大量無序結(jié)構(gòu)。當(dāng)調(diào)節(jié)溶液至中性或者堿性，使pH值為7.0、8.0和9.0時(shí)，均可得到形貌和尺寸均勻的二氧化硅納米管，且其尺寸和形貌隨pH值變化不大。

3 機(jī)理解釋

自然界中生物礦化過程的發(fā)生往往和生物大分子密切相關(guān)，這些生物大分子一方面可以預(yù)先組裝成特定的形貌結(jié)構(gòu)，為礦化反應(yīng)提供模板。同時(shí)，它們結(jié)構(gòu)中都含有與礦化反應(yīng)相關(guān)的活性基團(tuán)，可為生物礦化提供反應(yīng)位點(diǎn)。在對(duì)自然界生物礦化的研究中發(fā)現(xiàn)，許多在礦化過程中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)主要由賴氨酸（K）、絲氨酸（S）、組氨酸（H）等氨基酸組成，其中K在二氧化硅礦化蛋白sillaffins中含量豐富，對(duì)二氧化硅的形成有十分重要的作用。本文設(shè)計(jì)的多肽Ac-KI3VK-CONH2包含兩個(gè)K殘基，在組裝后分布在組裝體納米管的表面。當(dāng)溶液為中性或者弱堿性時(shí)，其側(cè)鏈氨基全部或部分質(zhì)子化，此時(shí)多肽帶正電，可為TMOS溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化提供充足的催化位點(diǎn)，促使其經(jīng)過水解和縮合反應(yīng)后形成硅酸以及聚硅酸，這些中間體容易去質(zhì)子化，帶有負(fù)電荷，使其在靜電吸引力的驅(qū)動(dòng)下聚集到肽納米管的表面，最終礦化形成規(guī)則的二氧化硅納米管，礦化過程和形成機(jī)理如圖8所示。

Fig.8 Proposed mechanism for the silica nanotubes fabrication by using peptide self-assemblies as templates

4 結(jié) 論

本文模擬自然界中生物礦化的過程，以短肽Ac-KI3VK-CONH2自組裝形成的納米管為模板，仿生礦化制備二氧化硅納米材料。系統(tǒng)考察了不同反應(yīng)條件，如是否加入乙醇、硅源種類、濃度和溶液pH值等因素對(duì)二氧化硅尺寸和形貌的影響，探索得到以TMOS為硅源、濃度為10～30 L/900 L、溶液pH值為中性或者弱堿性時(shí)，可礦化得到形貌規(guī)則且尺寸均勻的二氧化硅納米管。上述研究為制備尺寸較大的二氧化硅納米管提供了思路，可有效促進(jìn)其在不同領(lǐng)域的應(yīng)用。

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