周欣怡，張金璧，陳寬鳳，倪佳怡，丁 悅，徐世永，程澤信

(金陵科技學院動物科學與食品工程學院， 江蘇 南京 210000)

二花臉豬是原產(chǎn)于江蘇中南部地區(qū)的特色地方豬種，不僅性情溫和，耐粗飼，而且肉質(zhì)優(yōu)良，肌內(nèi)脂肪含量高，風味濃郁。此外還具有產(chǎn)子率高、繁殖壽命長等優(yōu)異的繁殖性能。但在優(yōu)勢明顯的同時，二花臉豬具有生長速度慢、背膘厚、瘦肉率較低的特點[1-2]。相對于西方豬種，如大白豬等穩(wěn)定較低的肌內(nèi)脂肪含量(約2%)，成年二花臉豬的肌內(nèi)脂肪含量可高達5%。Maria等[3]發(fā)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter)超家族成員之一的ABCG8不僅是豬脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因，同時與肌內(nèi)脂肪沉積有關(guān)。Henry等[4]發(fā)現(xiàn)飼料轉(zhuǎn)化率高的豬在營養(yǎng)物質(zhì)代謝循環(huán)速度上具有優(yōu)勢，而ABCG8在飼料轉(zhuǎn)化率高的豬中表達量偏低。因此，ABCG8可能在二花臉豬較慢的生長速度和高脂含量的肉質(zhì)特色性狀形成中起到重要作用。

ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter)，又稱ATP結(jié)合盒式蛋白，是目前已知規(guī)模最大的一類跨膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族，在所有原核生物和真核生物中均有分布，且一般廣泛存在于細胞質(zhì)膜中，擔負著細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能[5]。已知的人類基因組總共含有48個ABC基因，根據(jù)不同的結(jié)構(gòu)可分為7個家族，即ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF和ABCG。在人類和小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，ABCG8能與ABCG5在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中組裝形成異源二聚體，該二聚體移動到細胞膜發(fā)揮作用，作為將膽固醇分子向細胞外運輸?shù)耐ǖ?，是維持動物體內(nèi)膽固醇代謝平衡的重要分子[6]。目前對該基因的研究在植物甾醇血癥的相關(guān)研究中報道較多，而在肝細胞中，ABCG8和ABCG5的功能主要是將膽固醇分泌到膽汁中，從而抑制膽固醇的吸收，與負責膽固醇攝取的關(guān)鍵蛋白NPC1L1(膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白)作用相反，二者共同維持機體膽固醇平衡[7-8]。ABCG8在豬分子育種和改良中具有較大潛力，然而其在豬脂質(zhì)代謝中的功能研究關(guān)系尚未見報道。

本研究旨在以低生長速度和高脂含量的二花臉豬為研究對象，通過生物信息學方法對ABCG8編碼蛋白的高級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及生物學功能進行分析，并通過PCR技術(shù)分析ABCG8基因在豬內(nèi)臟和肌肉組織中的表達特征，為進一步研究ABCG8在豬脂質(zhì)代謝中的生物學功能，并加以利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試驗動物 3頭約200日齡的健康雄性二花臉豬，于宿遷市沭陽縣生豬定點屠宰場常規(guī)屠宰后，采集肝、肺、腎、脾、胰、小腸、背最長肌組織樣本，用生理鹽水沖洗干凈，迅速投入液氮中保存并運回實驗室后，轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱中保存。

1.1.2主要試劑與儀器 組織RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊公司，AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購自南京諾唯贊公司。

1.2 試驗方法

1.2.1生物信息學分析 根據(jù)NCBI上豬ABCG8基因的預(yù)測序列(登錄號：XM_021087570.1)及相應(yīng)預(yù)測蛋白序列(XP_020943229.1)進行生物信息學分析。ABCG8的理化性質(zhì)由ProtParam(https://www.expasy.org/resources/protparam/)進行分析；ABCG8蛋N-糖基化位點及O-糖基化位點分別由NetNGlyc 1.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)和YinOYang 1.2(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?YinOYang-1.2)進行預(yù)測；信號肽位點由SignalP-5.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)進行分析；蛋白磷酸化位點由NetPhos3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進行預(yù)測；亞細胞定位分析由PSORT II Prediction TargetP-2.0(https://psort.hgc.jp/form2.html)進行；蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域使用DeepTMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?DeepTMHMM)進行預(yù)測；ABCG8編碼蛋白的二級機構(gòu)和三級空間構(gòu)型分別由SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/interactive)進行預(yù)測；蛋白質(zhì)相互作用由SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)數(shù)據(jù)庫(http://www.string-db.org/)進行分析。

1.2.2組織總RNA的提取和cDNA的合成 采用組織RNA提取試劑盒進行豬肝、肺、腎、脾、胰、背最長肌組織的總RNA提取，調(diào)整濃度后用PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書步驟進行第一鏈cDNA的合成，最后將溶解于超純水中cDNA樣品置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3引物設(shè)計與組織表達分析 根據(jù)NCBI上豬ABCG8基因的預(yù)測序列(登錄號：XM021087570)和內(nèi)參基因豬GADPH序列(登錄號：AF017079)，利用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計qRT-PCR引物，引物具體信息見表2。

熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL：10 μL SYBR Green Master Mix(2×)，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，4 μL cDNA模板，4.4 μL ddH2O。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min、95℃變性15 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，40個循環(huán)，每個樣品3個重復(fù)。每個組織設(shè)置3個重復(fù)。運用2-ΔΔCt方法分析qRT-PCR數(shù)據(jù)，使用Excel進行顯著性檢驗統(tǒng)計分析。P<0.05和P<0.01分別被認為差異顯著和極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABCG8理化性質(zhì)分析

根據(jù)ProtParam分析得出，豬ABCG8共編碼730個氨基酸，分子式為C3638H5712N982O1027S35，分子量為80 761.43 kD，理論等電點(pI)值為8.73，為不穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)為46.26)。所含氨基酸種類較多，含量較高的有亮氨酸(12.6%)、甘氨酸(8.2%)、絲氨酸(7.9%)、丙氨酸(7.7%)、精氨酸(5.9%)和異亮氨酸(5.9%)等，色氨酸(1.1%)含量較低。帶負電荷殘基總數(shù)谷氨酸(Glu)+天冬氨酸(Asp)為57個，正電荷殘基總數(shù)賴氨酸(Lys)+精氨酸(Arg)為65個。ProtScale親疏水性分析結(jié)果見圖1，ABCG8第535位纈氨酸(Met)疏水性最強(3.011)，第330位精氨酸親水性最強(-2.678)，疏水性總平均值(GRAVY)為0.071，屬于疏水蛋白。

圖1 豬ABCG8的親疏水性分析Fig.1 Hydrophobicity analysis of ABCG8 in pig

2.2 ABCG8磷酸化位點分析

利用NetPhos 3.1對ABCG8進行在線分析，結(jié)果表明該蛋白存在109個潛在的N-磷酸化位點，包括73個絲氨酸(Serine)、26個蘇氨酸(Threonine)和10個酪氨酸(Tyrosine)(圖2)。YinOYang 1.2預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白含有6個O-糖基化位點(圖3)。

圖2 ABCG8的N-磷酸化位點預(yù)測Fig.2 N-phosphorylation site prediction of ABCG8

圖3 ABCG8的O-磷酸化位點預(yù)測Fig.3 O-phosphorylation site prediction of ABCG8

2.3 ABCG8糖基化位點及信號肽分析

NetNGlyc1.0分析顯示，ABCG8在88、158和616位上存在3個N-糖基化位點，其中158位的糖基化可能性極高(圖4)。但SignalP-5.0信號肽分析結(jié)果顯示，ABCG8分泌信號肽概率極低，為0.001(圖5)，說明ABCG8不存在信號肽序列，因此即使它們含有潛在的糖基化基序，在動物體內(nèi)大概率并不會被糖基化。

圖4 ABCG8的N-糖基化位點預(yù)測Fig.4 N-glycosylation site prediction of ABCG8

圖5 ABCG8的信號肽位點預(yù)測Fig.5 Site prediction of the signal peptide of ABCG8

2.4 ABCG8的亞細胞定位及跨膜結(jié)構(gòu)域分析

利用PSORT II亞細胞定位結(jié)果顯示，ABCG8主要定位于細胞膜(43.50%)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(26.10%)，在細胞質(zhì)中分布極少(4.30%)，因此推測其為膜蛋白。使用TMHMM 2.0預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)ABCG8存在6個顯著的跨膜結(jié)構(gòu)域(圖6)，是一個多次跨膜蛋白。

2.5 ABCG8的高級結(jié)構(gòu)及蛋白互作分析

SOPMA軟件分析ABCG8二級結(jié)構(gòu)，分析顯示α-螺旋、βv轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)卷曲分別占43.01%、6.16%、14.52%、36.30%(圖7)。SWISS-MODEL在線進行三級結(jié)構(gòu)建模顯示結(jié)果和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測一致(圖8)。用STRING交互式數(shù)據(jù)庫預(yù)測，ABCG8可能與ABCG5、NPC1L1、CYP7A1、NR1H3、SCARB1、SREBF2、APOA1、NR1H2、SQLE、NR1H4等10種蛋白存在相互作用關(guān)系(圖9)。

圖6 ABCG8的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測 Fig.6 Prediction of the transmembrane domain ofABCG8

注：藍色豎線為α-螺旋，紫色豎線為無規(guī)卷曲，紅色豎線為延伸鏈圖7 ABCG8的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Secondary structure prediction of ABCG8

圖8 ABCG8的三級結(jié)構(gòu)建模Fig.8 Tertiary structure modeling of ABCG8

圖9 ABCG8的蛋白質(zhì)互作分析Fig.9 Protein interaction analysis of ABCG8

2.6 ABCG8基因的組織表達譜分析

利用qRT-PCR技術(shù)檢測ABCG8基因在二花臉豬肝、肺、腎、脾、胰、小腸、背最長肌組織中的表達規(guī)律。結(jié)果顯示，以組織混合樣為參照，豬ABCG8基因僅在肝臟中高表達，在肺和腎臟中有痕量表達，而在其他組織中幾乎無法檢出，肝臟與其他組織表達量間差異極顯著。

圖10 ABCG8基因的組織表達分析Fig.10 Tissue expression analysis of ABCG8 gene

3 討論與結(jié)論

本研究通過生物信息學方法對二花臉豬ABCG8的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位、蛋白互作等進行了預(yù)測分析。在生物學功能方面，首先ABCG8的疏水性能和6個跨膜結(jié)構(gòu)域提示該蛋白屬于一種膜蛋白，而亞細胞定位預(yù)測中細胞膜分布比率最高的結(jié)果進一步肯定了這一結(jié)論。其次，預(yù)測顯示ABCG8在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中也有較高分布，這與人、小鼠相關(guān)研究中顯示的ABCG8和ABCG5在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成異源二聚體的生物學過程相符[2]。這一結(jié)果進一步與蛋白互作分析結(jié)果，即ABCG5顯示為與ABCG8互作最為緊密的蛋白相互印證。最后，表達譜分析顯示了其肝臟和小腸中的顯著表達，可見豬ABCG8參與細胞膜上的膽固醇轉(zhuǎn)出這一基本功能與其在人和小鼠中基本一致[9]。

蛋白互作分析提示了豬ABCG8可能存在的其他生物學功能。如該蛋白與幾種轉(zhuǎn)錄因子，即固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子SREBF2和3個核受體超家族的NR1亞家族成員NR1H2、NR1H3和NR1H4均可能產(chǎn)生互作。這3種核受體互為旁系同源蛋白，且與SREBF2都主要在肝臟中起作用。其中NR1H2可直接與DNA的順式作用元件結(jié)合，參與脂肪生成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[10]；NR1H3通過與視黃酸受體(RXR)的結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄因子活性，參與相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，促進極低密度脂蛋白(VLDL)的生成[11]；NR1H4的功能更為廣泛，主要作為膽汁酸的受體，反饋調(diào)節(jié)參與膽汁酸合成和轉(zhuǎn)運的基因的表達[12]?？梢娯iABCG8作為甾醇調(diào)節(jié)基因，位于幾種轉(zhuǎn)錄因子下游，可能在多種信號的觸發(fā)下啟動轉(zhuǎn)錄并發(fā)揮作用。此外，NPC1L1一般通過囊泡內(nèi)吞作用將游離膽固醇吸收到細胞中，在腸道膽固醇的吸收中起關(guān)鍵作用[13]，因此其與ABCG8的互作最可能發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，可能對ABCG8/ABCG5二聚體的組裝產(chǎn)生影響。另外，與ABCG8互作的清道夫受體B1基因SCARB1是高密度脂蛋白膽固醇(HDL)的質(zhì)膜受體，介導膽固醇與HDL的結(jié)合和分離[14]；載脂蛋白APOA1，是血漿中HDL的主要蛋白質(zhì)成分，促進膽固醇從組織運送到肝臟進行排泄，并且是卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的輔助因子[15]，由此可見ABCG8可能與多種蛋白在脂質(zhì)代謝中相互協(xié)作，是脂質(zhì)代謝的核心蛋白之一，可能在豬的脂類沉積過程中起重要作用。

綜上，本研究以生物信息學方法分析了二花臉豬ABCG8的理化性質(zhì)、高級結(jié)構(gòu)和基本功能，預(yù)測了其在豬脂質(zhì)代謝中的生物學功能和互作通路，為進一步研究ABCG8自身功能以及發(fā)掘其在豬生長性能和肉質(zhì)性能調(diào)控中的機理，開發(fā)其在育種中的應(yīng)用潛力研究奠定了基礎(chǔ)。