孫曉爽，高思田，黃 鷺，祝敏豪，劉林偉

(1.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京100029；2.中國計(jì)量大學(xué)計(jì)量測試工程學(xué)院，浙江杭州310018)

1 引 言

針尖增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)TERS(tip-enhanced Raman spectroscopy)是一種將SPM(scanning probe microscope)和SERS(surface enhanced Raman scattering)技術(shù)相結(jié)合用以進(jìn)行樣品表面納米尺度研究的技術(shù)[1,2]。與傳統(tǒng)拉曼光譜術(shù)相比，TERS具有更高的納米尺度空間分辨率[3,4]，能夠提供更豐富的樣品物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，被廣泛應(yīng)用于材料學(xué)[5]、表面科學(xué)[6]、生物化學(xué)[7,8]、電化學(xué)[9]、醫(yī)療研究[10,11]等領(lǐng)域。

在TERS測量系統(tǒng)中，為提高拉曼信號激發(fā)/收集效率，使入射光經(jīng)高數(shù)值孔徑物鏡聚焦在針尖與樣品接近處以形成激發(fā)光場，獲取樣品準(zhǔn)確的物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。因使用的物鏡具有高數(shù)值孔徑NA、高放大倍率的特點(diǎn)，使得系統(tǒng)景深達(dá)到μm量級，測量過程中輕微的振動或樣品表面高度的微小變化都將導(dǎo)致離焦現(xiàn)象，因此，在TERS測量系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)物鏡的快速、精確對焦尤為重要。

目前，實(shí)現(xiàn)TERS測量系統(tǒng)中軸向精確對焦功能的主要方法有兩種，即人工對焦法[12]和差動共焦軸向?qū)狗╗13]。人工對焦法操作繁瑣、效率低、易受主觀因素影響，導(dǎo)致對焦結(jié)果重復(fù)性差；差動共焦軸向?qū)狗ㄒ蛐枰诠饴分性鎏硖綔y器等光學(xué)器件，增加了系統(tǒng)的復(fù)雜性，耗費(fèi)硬件資源，存在焦點(diǎn)位置易漂移等問題。

圖像調(diào)焦法在顯微視覺系統(tǒng)中具有較廣泛應(yīng)用[14～17]。該方法通過選用合適的調(diào)焦評價(jià)函數(shù)對物鏡成像的圖像進(jìn)行處理判斷對焦?fàn)顟B(tài)，從而控制物鏡移動,具有實(shí)時(shí)性、便捷性和高靈敏度，并且不增加額外的硬件。為實(shí)現(xiàn)物鏡的快速與準(zhǔn)確對焦，本文提出一種基于調(diào)焦評價(jià)函數(shù)分析CCD相機(jī)拍攝的光斑圖像實(shí)現(xiàn)自動對焦的方法。介紹方差函數(shù)、Tenengrad函數(shù)的調(diào)焦原理；給出了所研制的TERS測量系統(tǒng)自動對焦光路并編寫了調(diào)焦算法；通過對樣品表面自動對焦實(shí)驗(yàn)分析得出比較適用于TERS測量系統(tǒng)自動對焦的調(diào)焦評價(jià)函數(shù)；驗(yàn)證所選函數(shù)應(yīng)用于TERS測量系統(tǒng)物鏡對焦的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

2 調(diào)焦評價(jià)函數(shù)

TERS測量系統(tǒng)自動對焦光路如圖1所示。CCD相機(jī)位于聚光鏡的焦距處。入射光經(jīng)物鏡在樣品表面形成聚焦光斑。該光斑再經(jīng)物鏡、單陷波濾波鏡、分光鏡和聚光鏡被CCD相機(jī)獲取。

圖1 自動對焦光路Fig.1 Auto focusing optical path

CCD相機(jī)拍攝的圖像如圖2所示，橫縱坐標(biāo)表示像素點(diǎn)數(shù)。當(dāng)樣品與物鏡距離d=f(準(zhǔn)焦)時(shí)，入射光聚焦在樣品表面，聚焦光斑亮且小，成像在CCD相機(jī)上的像斑也亮且小，見圖2(a)；當(dāng)樣品與物鏡距離d≠f(離焦)時(shí)，物鏡焦點(diǎn)與樣品表面存在一定距離，樣品表面上光斑發(fā)散且亮度較弱，成像在CCD相機(jī)上的像斑也暗且分散，見圖2(b)。樣品與物鏡間的距離與物鏡焦距偏差越大，光斑越分散，像斑也越分散，亮度越低。因此，可利用調(diào)焦評價(jià)函數(shù)來分析CCD相機(jī)接收到的光斑圖像的x,y坐標(biāo)像素值判斷離焦程度。

圖2 CCD相機(jī)拍攝圖像Fig.2 Images of CCD camera

TERS測量系統(tǒng)在對焦時(shí)需具有較高準(zhǔn)確性和重復(fù)性，因而選擇合適的調(diào)焦評價(jià)函數(shù)極為重要，理想的調(diào)焦評價(jià)函數(shù)需要具備無偏性、實(shí)時(shí)性和魯棒性較強(qiáng)等特點(diǎn)。本文在方差評價(jià)函數(shù)、Tenengrad評價(jià)函數(shù)的基礎(chǔ)上開展實(shí)驗(yàn)，以選擇適用于TERS測量系統(tǒng)自動對焦的調(diào)焦評價(jià)函數(shù)。

2.1 方差評價(jià)函數(shù)

方差函數(shù)的陡峭區(qū)寬度較大，在該區(qū)域位置的輕微改變及其他因素的變化都會引起調(diào)焦函數(shù)值的劇烈變化，該函數(shù)具有較大的調(diào)焦范圍。方差函數(shù)定義為

(1)

式中：I(x,y)表示圖像在(x,y)像素點(diǎn)處的強(qiáng)度；μ表示圖像的平均灰度值:

(2)

其中，M和N分別表示圖像像素的行數(shù)和列數(shù)。

2.2 Tenengrad評價(jià)函數(shù)

基于Sobel算子的Tenengrad函數(shù)綜合考慮圖像在水平方向和垂直方向的梯度，并且為保證充分利用圖像邊緣信息，該函數(shù)對梯度進(jìn)行平方運(yùn)算來放大圖像邊緣的梯度。表達(dá)式為

(3)

式中：S(x,y)表示圖像中(x,y)像素點(diǎn)處灰度值與Sobel算子的卷積:

(4)

其中：Gx(x,y)和Gy(x,y)分別表示圖像中(x,y)像素點(diǎn)處灰度值在x和y方向上的梯度:

(5)

式中I(x,y)表示圖像在像素點(diǎn)(x,y)處光強(qiáng)度。

(6)

3 系統(tǒng)研制

針對TERS測量系統(tǒng)中的技術(shù)難點(diǎn)研制自動對焦運(yùn)動控制單元。該單元可以實(shí)現(xiàn)在自動對焦過程中控制位移臺運(yùn)動，最終將入射光通過高數(shù)值孔徑物鏡聚焦在探針尖端形成激發(fā)光場并進(jìn)一步激發(fā)樣品的拉曼散射信號。

3.1 針尖增強(qiáng)拉曼系統(tǒng)自動對焦光路

在圖1的TERS測量系統(tǒng)中，波長為532 nm的激光經(jīng)耦合器耦合進(jìn)入光纖中，從光纖另一端面出射后，再經(jīng)擴(kuò)束準(zhǔn)直、偏振態(tài)調(diào)整后入射至Semrock 532 nm單陷波濾波鏡處，反射后再經(jīng)物鏡聚焦在探針尖端形成激發(fā)光場并進(jìn)一步激發(fā)被測樣品。

激光器選用lwgl532的單縱模激光器，相關(guān)技術(shù)參數(shù)如表1所示，光斑直徑小，線寬窄且單色性好、相干性好，光斑指向穩(wěn)定性好，可滿足TERS測量系統(tǒng)對激光光源的要求。

表1 激光器相關(guān)技術(shù)參數(shù)Tab.1 Technical parameter of laser

物鏡選用的是Mitutoyo高分辨率遠(yuǎn)場矯正顯微物鏡，相關(guān)參數(shù)如表2所示。

表2 物鏡相關(guān)技術(shù)參數(shù)Tab.2 Technical parameter of objective lens

景深計(jì)算公式為

(7)

式中：λ為入射光波長；NA為數(shù)值孔徑；n為介質(zhì)的折射率。

將相關(guān)參數(shù)代入式(7)得到物鏡的景深L=0.393 μm。使用高數(shù)值孔徑物鏡后，減小聚焦光斑的面積，也減少激發(fā)區(qū)域內(nèi)遠(yuǎn)場拉曼信號背景噪聲，提高TERS探測的信噪比。同時(shí)，高數(shù)值孔徑物鏡能有效收集更大空間立體角內(nèi)的拉曼散射信號，提高拉曼信號的收集效率。

同時(shí)，入射光經(jīng)高數(shù)值孔徑物鏡聚焦形成的光斑被CCD相機(jī)獲取，利用調(diào)焦評價(jià)函數(shù)分析該光斑圖像即可判斷離焦程度。CCD相機(jī)性能參數(shù)如表3所示，該相機(jī)具有高量子效率，可使信噪比最大，結(jié)果更準(zhǔn)確，滿足系統(tǒng)成像需求。

表3 CCD相機(jī)相關(guān)參數(shù)Tab.3 Technical parameter of CCD camera

3.2 調(diào)焦控制算法編寫

自動對焦流程如圖3所示。

圖3 自動對焦流程圖Fig.3 Auto focus flow chart

激光入射后，CCD相機(jī)實(shí)時(shí)采集被測樣品表面圖像并傳遞至計(jì)算機(jī)主控制單元，主控制單元調(diào)用調(diào)焦評價(jià)函數(shù)模塊計(jì)算圖像的調(diào)焦評價(jià)值，依據(jù)該評價(jià)值的大小控制位移臺帶動物鏡沿垂直方向上下移動。經(jīng)過多次移動，直至CCD相機(jī)拍攝到的光斑最亮最小，此時(shí)物鏡將入射光聚焦在被測樣品表面，自動對焦過程完成。其中，調(diào)焦評價(jià)函數(shù)模塊直接影響調(diào)焦的準(zhǔn)確度和效率，下面將重點(diǎn)加以詳細(xì)介紹。

調(diào)焦評價(jià)函數(shù)模塊流程如圖4所示，主要分為快速粗調(diào)焦和慢速細(xì)調(diào)焦兩個(gè)階段。調(diào)焦開始時(shí)，初始化位移臺位置，確保入射光經(jīng)物鏡聚焦后的焦點(diǎn)在被測樣品正上方，之后依次進(jìn)行快速粗調(diào)焦和慢速細(xì)調(diào)焦。

圖4 評價(jià)函數(shù)模塊流程圖Fig.4 Flow chart of evaluation function module

(1) 快速粗調(diào)焦階段：垂直位移臺帶動物鏡快速向下移動，通過計(jì)算機(jī)記錄下垂直位移臺當(dāng)前位置和對應(yīng)的CCD相機(jī)獲取的圖像，并進(jìn)一步由所選調(diào)焦評價(jià)函數(shù)計(jì)算出圖像的調(diào)焦評價(jià)值，實(shí)現(xiàn)垂直位移臺所處位置與調(diào)焦評價(jià)值一一對應(yīng)。移動過程中，持續(xù)判斷當(dāng)前位置對應(yīng)的調(diào)焦評價(jià)值是否滿足停止條件：如果滿足，物鏡執(zhí)行器自當(dāng)前位置(K點(diǎn))向上移動150 μm(M點(diǎn))，隨即進(jìn)入慢速細(xì)調(diào)焦階段；如果不滿足，則垂直位移臺繼續(xù)向下移動。

(2) 慢速細(xì)調(diào)焦階段：物鏡執(zhí)行器以低速帶動物鏡自M點(diǎn)向下移動300 μm(N點(diǎn))，同快速粗調(diào)焦階段，實(shí)現(xiàn)物鏡執(zhí)行器所處位置與調(diào)焦評價(jià)值一一對應(yīng)以繪制調(diào)焦評價(jià)函數(shù)曲線，通過曲線求出焦點(diǎn)F位置，將物鏡執(zhí)行器移至對應(yīng)位置處。

快速粗調(diào)焦階段的目的是快速接近焦點(diǎn)位置，確定細(xì)調(diào)焦范圍，提高調(diào)焦效率，避免陷入由噪聲引起的局部最優(yōu)解，提高對焦準(zhǔn)確性。方差函數(shù)在焦點(diǎn)附近時(shí)的評價(jià)值遠(yuǎn)大于遠(yuǎn)離焦點(diǎn)處的評價(jià)值[18]，Tenengrad函數(shù)也如此。因此，當(dāng)垂直位移臺快速移動時(shí)，相鄰兩圖像對應(yīng)位置間距較大，當(dāng)移動至焦點(diǎn)附近時(shí)，對應(yīng)的調(diào)焦評價(jià)值將陡然增大，可將該點(diǎn)視為異常值，利用t分布判斷快速粗調(diào)焦階段是否停止。具體判斷條件公式如下：

(8)

(9)

根據(jù)圖4流程，基于VC編寫相關(guān)控制程序并封裝成獨(dú)立模塊。其中，為減少程序計(jì)算量和提高自動對焦效率，在程序中添加焦點(diǎn)區(qū)域選擇功能，如圖5所示，CCD相機(jī)僅在方框區(qū)域內(nèi)成像，進(jìn)一步降低了空白區(qū)域的干擾，提高對焦精度。

圖5 成像區(qū)域Fig.5 Imaging area

4 實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

選擇合適的調(diào)焦評價(jià)函數(shù)開展自動對焦實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：①打開控制程序，顯示圖像；② 選擇焦點(diǎn)檢測方式，方差函數(shù)或Tenengrad函數(shù)；③ 選擇大小適當(dāng)?shù)某上駞^(qū)域；④開始自動對焦。實(shí)驗(yàn)中使用的樣品為純物質(zhì)硫，表面較為粗糙。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)調(diào)整，m、n的取值分別為0.15和21。

圖6是采用方差函數(shù)、Tenengrad函數(shù)進(jìn)行自動對焦實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

圖6 方差和Tenengrad調(diào)焦函數(shù)評價(jià)曲線Fig.6 The variance and Tenengrad focusing function evaluation curve

圖6(a)為快速粗調(diào)焦階段，橫坐標(biāo)表示垂直位移臺的位置；圖6(b)為慢速細(xì)調(diào)焦階段，橫坐標(biāo)表示物鏡執(zhí)行器的位置；兩圖的縱坐標(biāo)均表示不同位置處CCD相機(jī)拍攝圖像的調(diào)焦評價(jià)值，該調(diào)焦評價(jià)值是經(jīng)公式(1)或公式(3)計(jì)算得到的。垂直位移臺的標(biāo)稱范圍為0～10 mm，物鏡執(zhí)行器的標(biāo)稱范圍為-1～1 mm，閉環(huán)分辨率為1.25nm。由圖6(a)可知，快速粗調(diào)焦階段垂直位移臺從某位置處開始向下移動，確保從正離焦處開始逐步靠近焦點(diǎn)位置；并且移動速度較快，大幅減少調(diào)焦時(shí)間，提高調(diào)焦效率；還可以有效掠過由噪聲引起的局部最優(yōu)解。慢速細(xì)調(diào)焦階段評價(jià)函數(shù)歸一化曲線如圖6(b)所示，可以看出：兩種調(diào)焦函數(shù)評價(jià)曲線趨勢均呈“M”形分布，該分布是由CCD相機(jī)的飽和曝光量造成的。

系統(tǒng)中使用的激光為基模TEM00，以方差函數(shù)為例，慢速細(xì)調(diào)焦時(shí)，物鏡執(zhí)行器自M點(diǎn)開始向下移動，在M點(diǎn)時(shí)由于激光聚焦在樣品表面上方較遠(yuǎn)處，此時(shí)CCD相機(jī)獲取的樣品表面像斑分散且亮度較弱，各像素點(diǎn)均未達(dá)到飽和曝光量。隨著物鏡執(zhí)行器慢速向下移動，焦點(diǎn)逐漸靠近樣品表面，CCD相機(jī)獲取的像斑隨之變小且亮度變亮，中心的像素點(diǎn)值飽和。越靠近樣品表面，由像斑中心向外擴(kuò)散越來越多的像素點(diǎn)飽和。

調(diào)焦函數(shù)歸一化評價(jià)曲線如圖7所示，當(dāng)處于圖7(a)中A點(diǎn)峰值對應(yīng)的位置處時(shí)，焦點(diǎn)距離樣品表面非常近，此時(shí)CCD相機(jī)獲取的像斑大小雖略大于實(shí)際焦斑，但與焦斑大小相同處像素點(diǎn)均已飽和，且大于焦斑處也分布著部分能量，使得A點(diǎn)處方差值大于焦點(diǎn)F處方差值。同理，B點(diǎn)處方差值也大于焦點(diǎn)F處方差值，曲線呈“M”形分布。

圖7 調(diào)焦函數(shù)歸一化評價(jià)曲線Fig.7 Focusing function normalization evaluation curve

結(jié)合實(shí)際情況，為提高對焦準(zhǔn)確性，應(yīng)選擇兩峰中間的谷值(極小值)所對應(yīng)的位置作為焦點(diǎn)位置。為更進(jìn)一步提高對焦準(zhǔn)確度，對慢速細(xì)調(diào)焦曲線進(jìn)行濾波以去除隨機(jī)噪聲的干擾，并對濾波后兩峰值中間處曲線用最小二乘法擬合二次方程，選取擬合曲線極小值所對應(yīng)的位置作為最終結(jié)果(見圖7)。采用方差函數(shù)、Tenengrad函數(shù)經(jīng)濾波擬合后結(jié)果所對應(yīng)的焦點(diǎn)位置處CCD相機(jī)拍攝的圖像如圖8所示，橫縱坐標(biāo)表示像素點(diǎn)數(shù)。

圖8 自動對焦圖像Fig.8 Auto focus image

人工對焦時(shí)，需通過人眼實(shí)時(shí)觀察CCD相機(jī)拍攝的像斑的大小、亮度來判斷入射光是否聚焦在樣品表面，因所選CCD相機(jī)的限制，易將圖7(a)中A點(diǎn)或B點(diǎn)對應(yīng)位置判斷為焦點(diǎn)位置。與人工對焦相比，自動對焦更客觀，準(zhǔn)確性更高。

由圖6(b)可知，與方差評價(jià)函數(shù)曲線相比，Tenengrad評價(jià)函數(shù)曲線更為粗糙，受噪聲影響更大。原因是所選用的532 nm激光線寬小于10-5nm。當(dāng)照射到表面粗糙的純物質(zhì)硫時(shí)會形成嚴(yán)重的激光散斑圖像[19]。

不同的物鏡位置產(chǎn)生的散斑圖像也不同，由于梯度計(jì)算時(shí)為差分運(yùn)算，易受噪聲干擾，綜上使得Tenengrad評價(jià)函數(shù)曲線更為粗糙。結(jié)合圖8可知，與Tenengrad函數(shù)相比，使用方差函數(shù)的聚焦光斑更小、更亮，更適用于實(shí)現(xiàn)TERS測量系統(tǒng)的自動對焦。

為驗(yàn)證方差函數(shù)用于TERS測量系統(tǒng)自動對焦時(shí)的重復(fù)性和魯棒性，進(jìn)行多次自動對焦實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，其中，a、b兩組為不同時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每組自動對焦實(shí)驗(yàn)下多次對焦結(jié)果非常接近，且a、b兩組自動對焦結(jié)果的無偏估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為：0.213 μm、0.231 μm，表明方差函數(shù)在用于TERS測量系統(tǒng)自動對焦時(shí)不僅具有較高的準(zhǔn)確度，還具有較高的重復(fù)性和魯棒性，能夠滿足針尖增強(qiáng)拉曼系統(tǒng)對焦要求。

表4 自動對焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of autofocus μm

5 結(jié) 論

本文針對TERS測量系統(tǒng)中高數(shù)值孔徑物鏡對焦較難的問題，提出選用合適的調(diào)焦評價(jià)函數(shù)評價(jià)光斑圖像灰度值來自動對焦的方法，并在實(shí)際焦點(diǎn)定位時(shí)選擇“M”形曲線的谷值作為最終結(jié)果。重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：

(1) 與Tenengrad調(diào)焦評價(jià)函數(shù)相比，方差評價(jià)函數(shù)更適用于TERS測量系統(tǒng)自動對焦，聚焦到樣品表面時(shí)對焦結(jié)果的無偏估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差小于0.25 μm，具有較高的重復(fù)性和魯棒性；與人工對焦相比，具有更高的對焦效率。

(2) 快速粗調(diào)焦階段可以提高調(diào)焦效率，具有一定的抗干擾能力，可避免陷入局部最優(yōu)解。

(3) 慢速細(xì)調(diào)焦階段因CCD相機(jī)飽和曝光量造成評價(jià)函數(shù)曲線在焦點(diǎn)附近呈現(xiàn)“M”形分布，可通過二次擬合提高調(diào)焦精度。

(4) 選取適當(dāng)?shù)膶箙^(qū)域，可以剔除無關(guān)背景的干擾，提高對焦準(zhǔn)確性；可以減少評價(jià)函數(shù)的計(jì)算量，提高調(diào)焦效率。

(5) 實(shí)現(xiàn)的高數(shù)值孔徑物鏡自動對焦法具有可移植的優(yōu)點(diǎn)，可嵌入到如表面增強(qiáng)拉曼光譜探測系統(tǒng)等其它需實(shí)現(xiàn)自動對焦的拉曼系統(tǒng)中。