鄭晶晶，張曉華*，劉秀平，牛瑞芳，楊凱龍，張京哲

（1.許昌學(xué)院食品與藥學(xué)院河南省食品安全生物標(biāo)識快檢技術(shù)重點實驗室，河南 許昌 461000；2.鄢陵縣環(huán)境監(jiān)察大隊，河南 許昌 461000）

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜或蜜露、甘露等植物分泌物與自身分泌物結(jié)合，并用蜂蠟封蓋貯藏在巢脾內(nèi)經(jīng)過加工釀造而成的天然甜物質(zhì)[1-2]，也是目前人們公認(rèn)的一種營養(yǎng)豐富、健康的天然食品。蜂蜜中含有65%～80%糖類（葡萄糖與果糖）、18%水分和少量的蛋白質(zhì)、多酚、黃酮類化合物、酶、游離氨基酸、色素、生物堿、維生素和香氣化合物等。蜂蜜是一種藥食兩用的過飽和糖類混合物[3-5]。國內(nèi)外多項研究表明蜂蜜具有抗氧化、抑菌、促進(jìn)傷口愈合、護肝等作用，且這些作用多數(shù)與蜂蜜中的多酚類物質(zhì)有關(guān)[6-11]。由于生長環(huán)境、采蜜時節(jié)、加工工藝等方面的不同，蜂蜜具有抗氧化活性的內(nèi)源性代謝物的種類和含量會存在明顯差異，最終反映在蜂蜜抗氧化能力方面[12-13]。

雙水相萃取是一種新型液液萃取方法，由兩種互不相溶的水溶液組成，在提取過程中，由于分子間氫鍵、范德華力、鹽析等作用力導(dǎo)致提取物在兩相間進(jìn)行選擇性分配，從而達(dá)到分離的目的。與傳統(tǒng)提取方法比，存在整體體積小、萃取條件溫和、自行調(diào)整因素較多、分相時間短、提取率高和適合工廠化生產(chǎn)等特點，特別適用于天然活性物質(zhì)的分離和純化[14-16]。超聲輔助提取法的超聲波空化作用可破壞植物細(xì)胞壁，使有效成分易于溶出，將雙水相提取法與超聲輔助提取法協(xié)同使用有助于提高天然活性物質(zhì)的提取率，同時，超聲波對提取溶劑有富集效應(yīng)，可縮短上相和下相的相分離時間，提取在常溫下進(jìn)行，對受高溫易氧化的多酚類化合物的提取更為有利[17-18]。

本試驗采用超聲輔助雙水相的方法對蜂蜜多酚進(jìn)行提取工藝研究，通過選擇醇和鹽的種類來構(gòu)建最佳雙水相萃取體系。在此基礎(chǔ)上設(shè)計不同的蜂蜜處理液添加量、鹽濃度、醇添加量、pH值和超聲時間對提取工藝優(yōu)化，最后采用正交試驗得出蜂蜜多酚最佳提取工藝參數(shù)。另外，對蜂蜜樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。試驗研究結(jié)果對蜂蜜功能成分的研究及開發(fā)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荊條蜜：河南卓宇蜂業(yè)有限公司；沒食子酸（色譜純）：上海阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、檸檬酸鈉、硫酸銨、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鈉、濃鹽酸（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；福林酚（生化試劑）：上海麥克林日用化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；H1850R醫(yī)用離心機：湖南湘儀試驗室儀器開發(fā)有限公司；AE224J電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；US6180DH數(shù)顯加熱型超聲儀：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別移取100.0 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 于 9 個 10 mL 棕色容量瓶中，加入2.5 mL福林酚稀釋液，混勻反應(yīng)5 min，然后加入2.0mL碳酸鈉溶液，超純水定容至10mL刻度線，充分搖勻，常溫20℃黑暗靜置2 h，20℃下10 000 r/min離心10 min后，以超純水為空白對照在760 nm處測定吸光度，最后以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 蜂蜜中多酚含量測定

在離心管中加入蜂蜜處理液（0.6 mL）、醇（無水乙醇、聚乙二醇）和無機鹽（檸檬酸鈉、硫酸銨），搖勻后在溫度40℃、功率220 W下超聲20 min，50℃下恒溫靜置20 min，40℃下10 000 r/min離心10 min以加速上、下相分離過程，記錄上、下相體積。分別移取上、下相各1.0 mL，加入1.25 mL福林酚稀釋液，混勻后加入1.0 mL碳酸鈉溶液，加超純水定容到10 mL，充分搖勻，常溫20℃黑暗靜置2 h，20℃下10 000 r/min離心10 min，然后以超純水為空白對照在760 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算上、下相多酚的濃度。相比R、分配系數(shù)K和提取率Y（%）計算公式如下。

式中：R為相比；V1為上相體積，mL；V2為下相體積，mL；K為分配系數(shù)；C1為上相蜂蜜多酚的濃度，μg/mL；C2為下相蜂蜜多酚的濃度，μg/mL；Y為提取率，%。

1.3.3 雙水相體系中醇和鹽的選擇

向編號1～10的10 mL離心管中分別加入蜂蜜處理液0.60 mL。1～5號管加入4.65 mL 30%檸檬酸鈉，6～10號管加入4.65mL30%硫酸銨。分別以1.70 g無水乙醇、1.50 g PEG2000、1.50 g PEG4000、1.50 g PEG6000、1.50 g PEG10000依次加入1～5和6～10。所有添加試劑搖勻后按1.3.2測定步驟測定上、下相吸光度，計算相比、分配系數(shù)和提取率。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 蜂蜜處理液添加量對蜂蜜多酚提取率和分配系數(shù)的影響

在檸檬酸鈉溶液濃度30%、體積4.65 mL、PEG6000 1.50 g、超聲時間20 min、pH9條件下，測定蜂蜜處理液添加量分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 時多酚的提取率和分配系數(shù)。

1.3.4.2 鹽濃度對蜂蜜多酚提取率和分配系數(shù)的影響

在確定蜂蜜處理液最佳添加量的條件下，固定PEG6000 添加量 1.50 g、超聲時間 20 min、pH9，測定檸檬酸鈉溶液濃度分別為12%、16%、20%、24%、28%、32%時多酚的提取率和分配系數(shù)。

1.3.4.3 PEG6000添加量對蜂蜜多酚提取率和分配系數(shù)的影響

在確定蜂蜜處理液最佳添加量和最佳鹽濃度的條件下，固定超聲時間20 min、pH9，測定PEG6000添加量分別為 1.6、1.9、2.2、2.5、2.8、3.1 g 時多酚的提取率和分配系數(shù)。

1.3.4.4 pH值對蜂蜜多酚提取率和分配系數(shù)的影響

在確定蜂蜜處理液最佳添加量、最佳鹽濃度和最佳PEG6000添加量的條件下，測定pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 檸檬酸鈉溶液時的多酚提取率和分配系數(shù)。

1.3.4.5 超聲時間對蜂蜜多酚提取率和分配系數(shù)的影響

在確定蜂蜜處理液最佳添加量、最佳鹽濃度、最佳PEG6000添加量和最佳pH值的條件下，以超聲時間為自變量，測定超聲 10、15、20、25、30、35 min 時多酚的提取率和分配系數(shù)。

1.3.5 單因素試驗結(jié)果對蜂蜜多酚提取率影響的對比與分析

為了探究各單因素隨著自變量的變化對蜂蜜多酚提取率影響程度，通過公式計算每個單因素試驗結(jié)果的均方差，均方差越小表明影響程度越小。均方差計算公式如下。

式中：R為均方差；Yi為每組單因素試驗中各水平的提取率；Y為每組單因素試驗中各水平提取率的平均值；n為每組單因素試驗水平數(shù)量。

1.3.6 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗，正交試驗設(shè)計見表1。

表1 正交試驗設(shè)計Table 1 The design of orthogonal test

1.3.7 加標(biāo)回收試驗

在正交試驗獲得最佳提取條件基礎(chǔ)上，取6支10 mL離心管，均加入蜂蜜處理液（0.6 mL）、醇（無水乙醇、聚乙二醇）和無機鹽（檸檬酸鈉、硫酸銨），其中3支再分別加入1.0、1.5、2.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)試樣平行測定3次。按照1.3.2測定步驟測定上相吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出多酚的濃度，并根據(jù)下列公式計算標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率。

式中：n為加標(biāo)試樣平行測定次數(shù)；Xi為加標(biāo)試樣中多酚含量，mg/g；X為加標(biāo)試樣多酚含量平均值，mg/g；S為加標(biāo)試樣多酚含量標(biāo)準(zhǔn)偏差，%。

W/%=（CiVi-CTVT）/C0V0× 100式中：W為加標(biāo)回收率，%；Ci為加標(biāo)樣品多酚濃度的平均值，μg/mL；Vi為加標(biāo)樣品上相體積，mL；CT為蜂蜜樣品多酚濃度的平均值，μg/mL；VT為蜂蜜樣品上相體積，mL；C0為添加沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度；V0為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品體積，mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，不同濃度的沒食子酸在波長760 nm的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

由圖1可知，吸光度對沒食子酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.115x-0.007，R2=0.995，線性關(guān)系良好。

2.2 雙水相體系構(gòu)建結(jié)果

雙水相體系構(gòu)建提取結(jié)果見表2。

表2 雙水相體系構(gòu)建提取結(jié)果Table 2 Construction of aqueous two-phase extraction and extraction result

由表2可知，乙醇以及不同分子量的PEG都有較好的成相能力，其中不同PEG分子量成相能力大小為PEG10000＞PEG6000＞PEG4000＞PEG2000，成相能力隨分子量增大而增強[19]。當(dāng)鹽種類均為檸檬酸鈉時，多酚提取率大小分別為76.15%（PEG6000）＞71.19%（PEG4000）＞62.52%（PEG10000）＞56.51%（PEG2000）＞45.10%（乙醇），最高為76.15%；當(dāng)鹽種類均為硫酸銨時，多酚提取率大小為 79.58%（PEG10000）＞72.78%（PEG6000）＞67.02%（PEG4000）＞65.67%（PEG2000）＞59.13%（乙醇），最高為79.58%。但由于體系的黏度隨著PEG分子量的增加而增大，相分離過程也會更加困難[20]；硫酸銨若應(yīng)用于工業(yè)會對環(huán)境造成不良影響。因此綜合考慮提取率及體系黏度等因素，最終選擇PEG6000-檸檬酸鈉為最佳雙水相提取體系。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 蜂蜜處理液添加量對蜂蜜多酚分配系數(shù)和提取率的影響

蜂蜜處理液添加量蜂蜜對多酚分配系數(shù)和提取率的影響見圖2。

圖2 蜂蜜處理液添加量蜂蜜對多酚分配系數(shù)和提取率的影響Fig.2 The effect of the addition amount of honey treatment solution on the partition coefficient and extraction rate of polyphenols

由圖2可知，當(dāng)蜂蜜處理液添加量為0.3 mL時，蜂蜜多酚的分配系數(shù)和提取率較高；蜂蜜處理液添加量增加至0.4 mL時，蜂蜜多酚的分配系數(shù)為2.83，提取率為66.27%；但隨著蜂蜜處理液添加量繼續(xù)增加，蜂蜜多酚的分配系數(shù)和提取率均逐漸下降。這是因為蜂蜜多酚在細(xì)胞內(nèi)與糖、蛋白質(zhì)通過苷鍵、酯鍵等疏水鍵結(jié)合，若使多酚溶出則必須破壞疏水鍵。當(dāng)蜂蜜處理液添加量較少時，溶劑進(jìn)入并擴散到細(xì)胞的速度及多酚化合物向溶劑擴散的速度小，導(dǎo)致分配系數(shù)和提取率較小[21]；當(dāng)蜂蜜處理液添加量過多時，鹽的溶解度下降，下相的蜂蜜多酚含量增加，導(dǎo)致下相吸光度增大、分配系數(shù)降低、蜂蜜多酚提取率也隨之降低。最終選擇蜂蜜處理液添加量為0.4 mL進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.3.2 鹽濃度對蜂蜜多酚提取率的影響

通過預(yù)試驗得知，當(dāng)鹽濃度為6%時，所構(gòu)建的體系沒有分相；當(dāng)鹽濃度為8%時，下相較少且體系不穩(wěn)定；隨著鹽濃度的增加，下相體積逐漸增大，所構(gòu)建的雙水相體系趨于穩(wěn)定，分配系數(shù)和提取率也隨之增大。鹽濃度對蜂蜜多酚分配系數(shù)和提取率的影響見圖3。

圖3 鹽濃度對蜂蜜多酚分配系數(shù)和提取率的影響Fig.3 The effect of salt concentration on the partition coefficient and extraction rate of polyphenols

由圖3可知，當(dāng)鹽濃度為16%時，蜂蜜多酚分配系數(shù)和提取率均達(dá)到最大值，分別為2.11和77.22%；但當(dāng)鹽濃度大于16%時，其分配系數(shù)和提取率隨著鹽濃度的增加而下降。其原因是隨著鹽濃度的增加，體系中檸檬酸鈉的用量增加，導(dǎo)致下相的水和能力增強、體積增大，上相的體積隨之減小，醇的體積分?jǐn)?shù)和多酚的分配系數(shù)增大，提取率提高。當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加時，體系的極性增大，下相中的蜂蜜多酚和一些水溶性雜質(zhì)含量增加，導(dǎo)致多酚分配系數(shù)減小，提取率降低[22]。最終選擇鹽濃度為16%進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.3.3 PEG6000添加量對蜂蜜多酚分配系數(shù)和提取率的影響

PEG6000添加量蜂蜜對多酚分配系數(shù)和提取率的影響見圖4。

圖4 PEG6000添加量對蜂蜜多酚分配系數(shù)和提取率的影響Fig.4 The effect of PEG6000 addition amount on the partition coefficient and extraction rate of polyphenols

由圖4可知，當(dāng)PEG6000添加量為2.5 g時，蜂蜜多酚提取率最高。PEG6000添加量小于2.5 g時，蜂蜜多酚的提取率隨著醇添加量增加而增加，這是因為PEG6000添加量增加導(dǎo)致體系中PEG6000的體積分?jǐn)?shù)增大，在加入相同體積的蜂蜜處理液條件下，蜂蜜多酚能夠被充分溶解在上相，從而使得體系的分配系數(shù)增大、多酚提取率提高。PEG6000添加量大于2.5 g時，多酚提取率無明顯變化。綜合考慮以上因素，確定PEG6000最佳添加量為2.5 g。

2.3.4 pH值對蜂蜜多酚分配系數(shù)和提取率的影響

pH值對蜂蜜多酚分配系數(shù)和提取率的影響見圖5。

圖5 pH值對蜂蜜多酚分配系數(shù)和提取率的影響Fig.5 The effect of pH on the partition coefficient and extraction rate of polyphenols

由圖5可知，當(dāng)pH值為5.0時，蜂蜜分配系數(shù)和多酚提取率較低，隨著pH值增加，分配系數(shù)和提取率整體呈上升趨勢，但上升幅度逐漸減小，pH值為9.0時，分配系數(shù)和多酚提取率均達(dá)到最大值，分別為3.66和92.97%。當(dāng)pH值繼續(xù)增大時，分配系數(shù)和多酚提取率均快速下降。主要的原因可能是pH值超過9.0時，多酚類化合物易生成鹽，將呈現(xiàn)陰離子狀態(tài)。該狀態(tài)下，易與水分子形成較強的氫鍵作用使其更傾向于分布在雙水相的下相，導(dǎo)致提取率降低；多酚類化合物在高pH值時易氧化聚合，從而降低了多酚的提取率。因此，確定pH9.0為PEG-檸檬酸三鈉雙水相體系提取蜂蜜中多酚類化合物最適宜的pH值。

2.3.5 超聲時間對蜂蜜多酚分配系數(shù)和提取率的影響

超聲時間對蜂蜜多酚分配系數(shù)和提取率的影響見圖6。

圖6 超聲時間對蜂蜜多酚分配系數(shù)和提取率的影響Fig.6 The effect of ultrasonic time on the partition coefficient and extraction rate of polyphenols

由圖6可知，在10 min～20 min內(nèi)，蜂蜜多酚的分配系數(shù)和提取率隨著超聲時間的延長而增大，這是由于超聲波的空化作用使得蜂蜜多酚更加充分的溶解到有機相中，超聲時間越長，溶解得越多，蜂蜜多酚的提取效果明顯提高。當(dāng)超聲時間為20 min時多酚基本被提取出來，分配系數(shù)和提取率均達(dá)到最大值，分配系數(shù)和提取率分別為4.68、92.79%。超聲波的空化作用可使多酚類化合物充分的溶解到PEG上相中，超聲時間越長，提取效果越好。而當(dāng)超聲時間超過20 min后，蜂蜜多酚的提取率隨超聲時間的延長而逐漸降低，這是由于多酚類化合物為活性物質(zhì)，具有不穩(wěn)定性，過長時間的超聲作用使得這些成分發(fā)生氧化、聚合等反應(yīng)而受到破壞，進(jìn)而導(dǎo)致多酚提取率下降[23-24]。因此在提取多酚時超聲時間不宜過長，初步確定20 min為最佳超聲時間。

2.3.6 單因素試驗結(jié)果對蜂蜜多酚提取率影響的對比與分析

各單因素隨著自變量的改變對蜂蜜多酚提取率影響程度，計算結(jié)果如表3所示。

表3 各單因素均方差Table 3 Standard deviation of single factors

由表3可知，5個單因素隨著自變量的改變對蜂蜜多酚提取率影響程度從大到小依次為鹽濃度＞PEG6000添加量＞超聲時間＞蜂蜜處理液添加量＞pH值，為了簡化正交試驗，把影響程度較小的因素舍掉，即固定pH值為9.0，選取蜂蜜處理液添加量、鹽濃度、PEG6000添加量和超聲時間作為正交試驗因素。

2.4 正交試驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果和正交試驗設(shè)計方案，進(jìn)行L9（34）正交試驗，結(jié)果如表4所示。

表4 正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal experiment results

由表4可知，在固定pH值為9.0條件下，影響蜂蜜多酚提取率的因素排序為B＞C＞D＞A，即鹽濃度＞PEG6000添加量＞超聲時間＞蜂蜜處理液添加量，最佳提取條件為A3B1C2D3，即蜂蜜處理液添加量為0.5 mL、鹽濃度為12%、PEG6000添加量為2.5 g；超聲時間為25 min，而此條件與最高提取率94.02%所對應(yīng)的提取條件A2B1C2D3不一致，即蜂蜜處理液添加量為0.4 mL、鹽濃度為12%、PEG6000添加量為2.5 g、超聲時間為25 min，因此需對這兩種條件進(jìn)行驗證。

2.5 驗證試驗

把正交試驗中通過極差R分析所得的最提取條件A3B1C2D3與最高提取率所對應(yīng)的最佳提取條件A2B1C2D3方案進(jìn)行驗證試驗，通過比較提取率確定最終提取條件。驗證試驗結(jié)果見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果Table 5 Verification test results

由表5可知，在A3B1C2D3和A2B1C2D3兩種提取條件中，蜂蜜多酚提取率較高的提取條件組為A2B1C2D3，即蜂蜜處理液添加量為0.4 mL、鹽濃度為12%、PEG6000添加量為2.5 g、超聲時間為25 min，此條件下提取率為94.81%。

2.6 加標(biāo)回收試驗結(jié)果及分析

通過驗證試驗得知蜂蜜多酚最佳提取條件，其中蜂蜜處理液添加量為0.4 mL、濃度12%的檸檬酸鈉溶液為3.93 mL、PEG6000添加量為2.5 g、pH值為 9.0、超聲時間為25 min，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，結(jié)果如表6所示。

表6 加標(biāo)試驗結(jié)果Table 6 Standard recovery experiment results

由表6可知，未加沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液時3次平行試驗測得的上相蜂蜜多酚濃度分別為29.82、30.77、30.95 μg/mL，平均值為30.51μg/mL。加沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為1.0、1.5、2.0 mL時測得上相蜂蜜多酚含量分別為 42.51、45.03、48.69 μg/mL。經(jīng)計算得荊條蜜中多酚含量為1.246 mg/g，回收率為91.76%～100.26%，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.31%～0.78%范圍內(nèi)，說明本試驗所得出的最佳提取條件適合提取蜂蜜多酚。

3 結(jié)論

本試驗采用超聲輔助雙水相方法提取蜂蜜多酚，考慮提取率、環(huán)保以及試驗的便利等因素，選擇PEG6000-檸檬酸鈉為最佳萃取體系。通過單因素試驗對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，包括蜂蜜處理液添加量、鹽濃度、醇添加量、pH值和超聲時間，并利用各單因素中每個因素水平下的提取率計算均方差，得出pH值的變化對蜂蜜多酚提取率的影響較小。結(jié)果表明：蜂蜜處理液添加量為0.4 mL、鹽濃度為12%、PEG6000添加量為2.5 g、pH值為9.0、超聲時間為25 min時，蜂蜜多酚提取率最大，為94.81%。最后對測定樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，得出荊條蜜中多酚含量為1.246 mg/g，回收率為91.76%～100.26%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.31～0.78%。