干建松

（1.江蘇財經職業(yè)技術學院糧食與食品藥品學院，江蘇 淮安 223003；2.中國礦業(yè)大學化工學院，江蘇 徐州 221116）

荸薺（Eleochairis toberosa），俗稱馬蹄，是多年生淺水草本植物荸薺的地下球莖，我國荸薺資源豐富[1]。荸薺營養(yǎng)豐富，味甜多汁，具有較高的營養(yǎng)價值。荸薺可直接食用，亦可加工成菜品、罐頭、果脯及飲料等[2-4]。荸薺皮為荸薺加工副產物，多被丟棄，造成資源浪費并污染環(huán)境[5]。荸薺皮含有黃酮類、多酚類、甾醇類、糖類等多種活性物質[6-9]。陳秋娟等[10]研究微波輔助提取荸薺皮多酚工藝，結果表明荸薺皮中多酚含量為3.15%。以荸薺皮為原料制備具有生物活性的多酚對荸薺皮的深度開發(fā)利用具有重要意義。

多酚類物質是一種含有多個羥基，化學性質活潑的化合物[11-12]，具有抑菌、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等活性[13-14]，可用于醫(yī)藥、食品、飼料及日用化妝品等。目前荸薺皮多酚的研究多集中在提取工藝及粗提物的活性研究[15-16]，粗提液中含有大量的蛋白質、多糖等雜質，對其生物活性的評價準確性不高[17]。因此研究適宜的方式分離純化荸薺多酚，并評價其生物活性、理化性質是重要的研究方向。

本文考察5種大孔吸附樹脂對荸薺皮粗多酚的純化效果，篩選最佳的純化樹脂，并進行純化工藝優(yōu)化，分析純化后荸薺皮多酚的抗氧化活性、穩(wěn)定性等，為荸薺皮多酚類物質在功能性食品、藥品和化妝品中的利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荸薺皮：市售，50℃熱風干燥；D101（非極性）、AB-8（弱極性）、ADS-17（中等極性）、S-8（極性）、NKA-9（極性）樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國sigma公司；2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：上海碧云天生物技術有限公司；NaOH、HCl、福林酚、沒食子酸、Na2CO3、乙酸乙酯：國藥集團化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

FA2004N電子天平：上海菁華科技儀器有限公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機、Eppendorf5418小型臺式高速離心機：德國艾本德股份有限公司；DHC-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；D-8紫外可見分光光度計：南京菲勒儀器有限公司；XO-1500DN超聲波萃取儀：南京先歐儀器制造有限公司；ZHWY-2102c恒溫搖床：上海智城分析儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 荸薺皮多酚的提取

取干燥荸薺皮，粉碎，加入50%乙醇，置于超聲波萃取儀內，設定提取溫度50℃、料液比1∶25（g/mL）、超聲功率300 W、超聲時間40 min、提取次數2次，合并2次提取液，減壓濃縮，得到荸薺皮多酚粗提液，置于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大孔樹脂的篩選

選取5種不同極性的大孔吸附樹脂，分別為D101（非極性）、AB-8（弱極性）、ADS-17（中等極性）、S-8（極性）、NKA-9（極性）。取適量樹脂置于無水乙醇浸泡24 h，用去離子水洗至無醇味，加入4%HCl溶液浸泡6 h后，用去離子水洗至中性，然后加入4%NaOH溶液浸泡6 h，用去離子水洗至中性，備用。分別取2.0 g預處理的大孔樹脂，置于帶塞三角瓶中，加入荸薺皮多酚粗提液50 mL，于恒溫搖床中25℃、150 r/min下吸附12h，測定上清液的總多酚濃度C1。吸附結束后抽濾，樹脂用去離子水清洗2次后，置于具塞三角瓶中，加入70%乙醇100 mL，于恒溫搖床中振蕩洗脫2 h，測上清液的總多酚濃度C2[18]。樹脂吸附量、吸附率及解吸率計算公式如下。

式中：C0為初始多酚濃度，mg/mL；C1為吸附后上清液中多酚濃度，mg/mL；C2為解吸液中多酚濃度，mg/mL；W為大孔吸附樹脂的質量，g；V1為多酚溶液體積，mL；V2為解吸液體積，mL。

1.2.3 樹脂靜態(tài)吸附與解吸

1.2.3.1 靜態(tài)吸附動力學曲線

分別取2.0 g預處理的大孔樹脂，置于帶塞三角瓶中，加入荸薺皮多酚粗提液100 mL，于恒溫振蕩器中25℃、150 r/min下吸附，每隔20 min測定上清液的多酚濃度至無明顯變化。計算吸附量并繪制靜態(tài)吸附動力學曲線。

1.2.3.2 多酚初始濃度對吸附的影響

取2.0 g預處理好的AB-8樹脂5份，分別加入100 mL 的質量濃度分別為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL荸薺皮粗多酚溶液，在25℃、150 r/min下振蕩2 h，測定上清液中多酚濃度，計算吸附量。

1.2.3.3 乙醇濃度對樹脂解吸效果的影響

取飽和吸附多酚且吸附量已知的AB-8樹脂5份，各2.0g，分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇200 mL，在25℃、150 r/min下振蕩2 h，測定洗脫液中的多酚濃度，計算解吸率及純度。

多酚純度測定方法：多酚純度為混合物中多酚類物質質量與混合物總質量的比值。將洗脫液減壓濃縮后，真空冷凍干燥至恒重，稱取一定量多酚純化物（m1）溶解，測定多酚含量（m2），純度按如下公式計算。

1.2.4 動態(tài)吸附-解吸

1.2.4.1 上樣流速對樹脂吸附效果的影響

稱取適量處理好的AB-8樹脂，采用濕法裝柱（2.0 cm×50 cm），將質量濃度為3.0 mg/mL的樣液分別以2、4、6 mL/min的流速過柱，每30 mL收集流出液一次，測定流出液中的多酚濃度，繪制穿透曲線。

1.2.4.2 洗脫速度對樹脂解吸效果的影響

在多酚質量濃度為3.0 mg/mL、上樣速度為1.0 mL/min條件下上樣40 mL，吸附2 h后，用70%乙醇以洗脫速度分別為1、2、3 mL/min洗脫，每10 mL為一管收集流出液，測定其多酚濃度，繪制解吸曲線。

1.2.4.3 多酚濃度的測定

稱取0.025 g的沒食子酸，加入蒸餾水使其溶解，然后倒入1 000 mL的容量瓶中，用蒸餾水潤洗燒杯倒入容量瓶中，再加蒸餾水定容至刻度線，沒食子酸標準液濃度為0.025 mg/mL。吸取沒食子酸標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 置于 25 mL 的容量瓶中，每份都加入1.0 mL福林酚試劑，搖晃均勻，隨后再加4 mL 15%Na2CO3，搖勻后加入蒸餾水定容至刻度線，避光于30℃靜置1 h后，在波長760 nm下測定其吸光度，由試驗數據可得出標準曲線方程為y=10.119 0x-0.017 3，相關系數R2=0.995 7。多酚樣品處理同沒食子酸標準溶液，對照沒食子酸標準曲線計算樣品中多酚的濃度。

1.2.5 多酚抗氧化活性的測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除試驗

取2 mL多酚溶液，加1 mL濃度為0.2 mmoL/L的DPPH溶液，振蕩搖勻，置暗處反應30 min后，用紫外分光光度計測定517 nm處吸光度A1；取乙醇溶液1 mL與多酚溶液2 mL混勻，測吸光度A2；取乙醇溶液2 mL和DPPH溶液1 mL混勻，測吸光度A3；2 mL水與2 mL乙醇混合溶液調零[19]。DPPH自由基清除率計算公式如下。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除能力測定

參照DE等[20]的方法，分別取5mL7.4mmol/LABTS溶液與3.6 mmol/L過硫酸鉀溶液，混勻，25℃避光反應12 h，得ABTS+溶液。取樣品液0.4 mL，加入3.6 mL ABTS+溶液，避光反應6 min，測定734 nm處吸光度。以去離子水替代樣品做空白對照。ABTS+自由基清除率計算如下。

式中：A0為空白對照吸光度；A1為樣品與ABTS反應后吸光度；A2為樣品吸光度。

當數據包是以HBF模式轉發(fā)時,數據包目的節(jié)點是t,雷區(qū)FAR為F。節(jié)點si是任意一個節(jié)點。而節(jié)點sj是節(jié)點si的一個鄰居節(jié)點。從節(jié)點si至節(jié)點sj的HTHS表示為

1.2.6 多酚穩(wěn)定性研究

1.2.6.1 溫度對荸薺皮多酚穩(wěn)定性的影響

取一定濃度的多酚溶液，分別放置于40、60、80、100℃的水浴中，每隔1 h取樣，在760 nm處測吸光度。

1.2.6.2 pH值對荸薺皮多酚穩(wěn)定性的影響

用1 mol/L HCl和0.5 mol/L NaOH配成pH值為3、6、9的溶液，加入適量多酚樣品，每隔2 d取樣，在760 nm波長處測其吸光度。

1.2.6.3 光照對荸薺皮多酚穩(wěn)定性的影響

取一定濃度的多酚溶液，密封，分別置于自然光和避光條件下，每隔2 d取樣，在760 nm處測吸光度。

1.2.6.4 蔗糖對荸薺皮多酚穩(wěn)定性的影響

1.3 數據處理

試驗數據以平均值±標準偏差表示（n=3），采用Origin pro 18.0和Design-expert軟件對試驗數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

5種大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸性能見圖1。

圖1 大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸性能Fig.1 Static adsorption and desorption properties of macroporous resin

由圖1可知，非極性的D101和弱極性的AB-8的吸附量較高，極性的S-8、NKA-9吸附量較低，其中AB-8的吸附量最高，為（31.64±1.11）mg/g。D101 和AB-8的解吸率較高，其中AB-8的解吸率最高，為（88.35±2.65）%；多酚類化合物的分子中含有多個酚羥基結構，其分子的極性不高，所以弱極性或非極性的樹脂吸附效果較好[2，19]。因此，本試驗選擇AB-8為最適宜樹脂。

2.2 樹脂靜態(tài)吸附與解吸

2.2.1 靜態(tài)吸附動力學曲線

AB-8對多酚吸附的靜態(tài)吸附動力學曲線及對應的吸附速度曲線見圖2。

圖2 靜態(tài)吸附動力學與吸附速度曲線Fig.2 Static adsorption kinetics and adsorption rate curve

由圖2可知，在吸附的前80 min，吸附量迅速增加，在80 min～180 min，吸附量增加緩慢，在160 min達到了最大吸附量（31.64±1.11）mg/g。吸附速度先迅速降低，后趨于平緩。出現此變化規(guī)律的原因可能是，樹脂上具有許多吸附活性位點，每個活性位點吸附固定數量的分子，在吸附起始階段，較多的活性點處于未吸附的活性狀態(tài)，導致吸附較快，從而樹脂吸附量增加較快，隨著吸附的進行，可利用的活性位點越來越少，吸附量趨于穩(wěn)定，從而吸附速度下降。140 min時，吸附量為（31.25±1.09）mg/g，與最大吸附量無明顯差異，綜合考慮時間與吸附量，選擇吸附時間為140 min。

2.2.2 多酚初始濃度對吸附的影響

多酚初始濃度對樹脂吸附的影響結果見圖3。

圖3 多酚初始濃度對吸附的影響Fig.3 Effect of initial concentration of polyphenols on adsorption

由圖3可知，吸附量隨初始濃度的增加呈先上升后略下降的趨勢，當初始濃度為3.0 mg/mL時，吸附量達到最大值（31.70±0.95）mg/mL。出現該趨勢的原因一方面為濃度越高，溶液與樹脂之間的濃度差越大，吸附動力也越大，故濃度越高相同時間吸附量越大；另一方面，當粗提液多酚濃度高時雜質濃度也高，部分雜質會與多酚競爭樹脂的吸附活性位點，導致對多酚的吸附量降低[21]。綜合考慮，選擇初始濃度為3.0 mg/mL為最適初始濃度。

2.2.3 乙醇濃度對樹脂解吸率和多酚純度的影響

乙醇濃度對樹脂解吸率和多酚純度的影響結果見圖4。

圖4 乙醇濃度對樹脂解吸率和多酚純度的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption rate and polyphenol purity of resin

由4圖可知，多酚的解吸率隨著乙醇濃度的增加呈增加趨勢，但多酚純度隨乙醇濃度的增加呈先增加后減小的趨勢。乙醇濃度為70%時，解吸率為（86.13±2.58）%，多酚純度達到最大值（57.5±1.72）%；當乙醇濃度 80%時，解吸率基本達到最大值（91.07±2.73）%，但是多酚純度降到（50.16±1.50）%。綜合考慮解吸率和多酚純度，選擇乙醇濃度70%為最適洗脫溶劑。

2.2.4 上樣流速對樹脂吸附效果的影響

上樣流速對AB-8樹脂吸附荸薺皮多酚的影響結果見圖5。

圖5 上樣流速對樹脂吸附的影響Fig.5 Effect of sample loading flow rate on resin adsorption

當流出液中目標成分的質量濃度為上樣液質量濃度的1/10時即為泄漏點，此時大孔樹脂基本達到吸附飽和狀態(tài)，可以停止上樣[22]。由圖5可知，當流速為2、4、6 mL/min時，泄漏點的流出液體積分別為240、190、140 mL，泄漏點的流出液體積隨上樣流速的增加而降低，導致其吸附率隨上樣流速的增加而降低。速度越快，樣液與樹脂接觸時間越短，吸附率下降，反之，速度降低，吸附率增加。但是速度過慢，穿透時間越長，導致生產效率降低，綜合考慮速度與吸附率，選擇流速為4 mL/min。

2.2.5 洗脫速度對樹脂解吸效果的影響

洗脫劑流速對多酚解吸的影響見圖6。

圖6 洗脫速度對解吸的影響Fig.6 Effect of elution rate on desorption

由圖6可知，當洗脫劑流速較低時，洗脫峰峰型較對稱、尖銳，洗脫劑流速增加，洗脫峰拖尾較嚴重，對洗脫劑用量為250 mL時的解吸率進行了測定，結果表明，流速為1、2、3 mL/min時，解吸率分別約為91%、87%、74%，洗脫劑流速越低，解吸效率越高。但是，洗脫速度過慢，洗脫時間太長，綜合考慮，確定洗脫流速為2 mL/min。

2.2.6 純化工藝的驗證

在多酚初始濃度3.0 mg/mL、上樣流速4 mL/min、洗脫劑70%乙醇溶液、洗脫流速2 mL/min條件下，采用AB-8樹脂對初始純度為12.54%的荸薺皮多酚進行純化，多酚回收率為（81.65±2.45）%，多酚純度為（58.64±1.76）%。

2.2.7 多酚抗氧化活性的測定

純化前后荸薺皮多酚ABTS+自由基和DPPH自由基清除率研究結果見圖7。

圖7 多酚抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of polyphenols

由圖7可知，多酚對兩種自由基的清除率都隨著濃度的增加而增加，多酚粗提物的抗氧化活性較低，純化多酚與VC的抗氧化活性相近，說明純化多酚有較高的抗氧化活性。

2.2.8 荸薺皮多酚穩(wěn)定性

為有效利用荸薺皮多酚、采取科學的加工方式提供依據，試驗研究溫度、pH值、光照、蔗糖等因素對荸薺皮多酚的穩(wěn)定性研究，結果見圖8。

圖8 荸薺皮多酚的穩(wěn)定性Fig.8 Stability of Eleochairis toberosa peel polyphenols

由圖8a可以看出，在不同溫度下，多酚濃度隨時間的延長而降低，溫度為40℃時，多酚變化較平緩，4 h內基本保持穩(wěn)定，60℃～100℃時，隨時間延長下降較快，說明多酚熱穩(wěn)定性較差。由圖8b可以看出，多酚在pH3時，較穩(wěn)定，放置14 d后含量仍較高，在pH9時，多酚濃度迅速下降，說明多酚在較高pH值下穩(wěn)定性較差。由圖8c、圖8d可以看出，多酚在光照和蔗糖條件下較穩(wěn)定。

3 結論

采用大孔樹脂對荸薺皮多酚進行純化，對5種大孔吸附樹脂，包括 D101（非極性）、AB-8（弱極性）、ADS-17（中等極性）、S-8（極性）、NKA-9（極性）的吸附和解吸性能研究，結果表明弱極性AB-8樹脂的吸附量與解吸率均較高，吸附量為（31.64±1.11）mg/g，解吸率為（88.35±2.65）%，選擇AB-8為最適樹脂。AB-8樹脂對荸薺皮多酚的靜態(tài)吸附動力學曲線表明，靜態(tài)吸附140 min基本達到飽和，此時樹脂對荸薺皮多酚的飽和吸附量為（31.25±1.09）mg/g。樹脂動態(tài)吸附-解吸研究結果表明，多酚初始濃度3.0 mg/mL、以4 mL/min的流速吸附，吸附平衡后以70%乙醇為洗脫劑，洗脫流速為2 mL/min工藝最佳。對大孔樹脂純化荸薺皮多酚工藝進行驗證，純化后，荸薺皮多酚純度由12.54%提高到（58.64±1.76）%。對純化前后多酚與VC的ABTS+自由基和DPPH自由基清除率研究，結果表明純化多酚抗氧化活性高于粗多酚，純化多酚的抗氧化活性接近VC的抗氧化活性，說明純化多酚有較高的抗氧化活性。對多酚穩(wěn)定性進行了研究，結果表明多酚熱穩(wěn)定性較差，在pH3、光照和蔗糖條件下較穩(wěn)定。本試驗為荸薺皮多酚的進一步研究及保健食品與食品加工奠定了研究基礎。