肖仕和，李鋼，周奮，劉珍，劉仲海

（海南省第三人民醫(yī)院神經(jīng)外科，海南三亞 572022）

高血壓腦出血（hypertensive intracerebral hemorrhage, HICH）是高血壓最嚴重的并發(fā)癥之一，也是主要的致殘性疾病之一[1]。流行病學資料顯示，HICH 主要影響50～70 歲人群，30 d 病死率可達32%～50%，即使存活，約70%的患者仍會出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，僅28%～35%的患者具有獨立的生活技能[2-3]。HICH 發(fā)病后神經(jīng)元的損傷是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙及其他并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)，而星形膠質(zhì)細胞參與了HICH 發(fā)病后對神經(jīng)元的保護和重建[4-5]。星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的細胞類型，參與神經(jīng)元的營養(yǎng)、保護，維持血腦屏障，并協(xié)助跨突觸的信號傳遞過程[6]。在出現(xiàn)腦組織損傷后，星形膠質(zhì)細胞被激活，并可通過分泌各種細胞因子參與損傷后的修復(fù)，星形膠質(zhì)細胞大量的凋亡影響HICH 的恢復(fù)[7-8]。 微RNA（microRNA,miRNA）是一種內(nèi)源性的、約為22～25 個核苷酸長度的RNA，參與細胞增殖、凋亡、分泌等過程及細胞功能的調(diào)控[9]。microRNA-27b（miR-27b）是近年來發(fā)現(xiàn)的與HICH 有關(guān)的miRNA，有研究發(fā)現(xiàn)降低miR-27b 的表達會緩解HICH 大鼠的腦損傷[10-11]，但是其對星形膠質(zhì)細胞的影響仍不清楚。本文主要分析miR-27b 在HICH 大鼠腦組織中的表達及對星形膠質(zhì)細胞生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

自發(fā)性高血壓（spontaneous hypertension，SHR）大鼠（血壓：160～180 mmHg）、健康的同源性WKY大鼠，12月齡，SPF 級，雄性，體重190～210 g（上海斯萊克實驗動物中心），實驗動物使用許可證號:SYXK（ 瓊）2022-0013；大鼠星形膠質(zhì)細胞（BNCC338613，北京北納科技有限公司）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

蘇木精-伊紅和TUNEL 染料（C1091，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基和抗體（美國Gibco 公司）；miR-27b 的類似物（mimic）、抑制劑（inhibitor）及陰性對照（negative control, NC）（中國吉瑪公司）；TRIzol 試劑（北京艾德萊生物科技有限公司）；TRIzol 和miRNeasy Mini 試劑盒（德國QIAGEN有限公司）；SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（中國TaKaRa 公司）；CCK-8 試劑盒（C0037，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；凋亡試劑盒（Annexin V-FITC 和PI）（中國耶森實業(yè)有限公司）；酶標儀（日本Bio-Rad公司）；流式細胞儀（美國Becton 公司）；數(shù)碼相機（IXUS，日本佳能公司）和光學顯微鏡（ECLIPSE Ni，美國Nikon 公司）。

1.2 HICH大鼠模型復(fù)制

選取15 只健康WKY 大鼠作為對照組，15 只SHR 大鼠作為HICH 組。通過自體血腦內(nèi)注射法復(fù)制HICH 模型[8]：大鼠腹腔注射10% 水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后固定在立體定向儀中，調(diào)整儀器，使大鼠前囟和后囟處于同一平面，在前囟后側(cè)0.2 mm 處鉆孔，然后斷尾取自體血50 μL，進針6.0 mm（尾殼核處）注入50 μL 自體血，緩慢注射持續(xù)3 min，留針7 min。對照組進行相同的操作但不注射自體血。通過改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）評估模型復(fù)制結(jié)果。24 h 后將大鼠安樂死，取腦組織用于后續(xù)實驗檢測。

1.3 檢測方法

1.3.1 HE染色大鼠安樂死后取腦組織，室溫下用4%多聚甲醛固定6 h，乙醇脫水后用石蠟包埋，然后切成5 μm 厚的切片，并將這些切片貼到載玻片上，室溫下使用蘇木精染色10 min，自來水沖洗1～2 min 后，將其置于10%冰醋酸中10 s，然后再置于1%氨水中，直到切片變藍，再用自來水清洗1～2 min 后，放入伊紅液染色10 s，脫水后置于二甲苯中2 min，最后用中性膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.3.2 TUNEL染色1.3.1 中的切片用二甲苯脫石蠟2 次，每次10 min，經(jīng)過梯度乙醇脫水（乙醇濃度：100%、95%、90%、80%、70%），在37°C 的潮濕暗箱中用50 μL 的TUNEL 反應(yīng)溶液處理切片60 min，隨后將50 μL 辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素加入其中孵育30 min，用DAPI 對細胞核進行熒光染色，常規(guī)脫水、脫色、固定。檢測細胞凋亡率并用光學顯微鏡放大400 倍捕獲圖像，計算TUNEL 陽性細胞數(shù)。細胞凋亡指數(shù)=（TUNEL 陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%。

1.3.3 qRT-PCR 檢測大鼠腦組織及各組細胞miR-27b mRNA 相對表達量收集大鼠腦組織及各組細胞，采用TRIzol 法從大鼠腦組織及各組細胞中提取總RNA，并使用Nanodrop 2000 進行定量。用miRNeasy Mini 試劑盒分離miRNA 并進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM進行qRTPCR：95°C 預(yù)變性2 min，95°C 變性30 s 退火20 s，72°C 延伸20 s，共40 個循環(huán)。miR-27b mRNA 正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGGAGAGCTTAGCTGATT G-3′，引物長度為 30 nt；反向引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCYAGTTGA GGTTCAC-3′，引物長度為43 nt；U6 正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，引物長度為17 nt；反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，引物長度為20 nt。以U6 為內(nèi)參對照，使用2-ΔΔCt法計算目的基因miR-27b mRNA 相對表達量。

1.4 星形膠質(zhì)細胞分組和轉(zhuǎn)染

星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)于RPMI 1640 完全基中，培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清、0.1 mg/mL 的鏈霉素及100 u/mL 的青霉素。將細胞在37°C，95%濕度條件下培養(yǎng)于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中。細胞分為3 組，NC 組、miR-27b mimic 組及miR-27b inhibitor 組，根據(jù)組別分別轉(zhuǎn)染miR-27b mimic、miR-27b inhibitor質(zhì)粒來過表達和抑制miR-27b 水平。將細胞在6 孔板中培養(yǎng)，當細胞達到60% 匯合后，添加Opti（100 μL）和LipofectamineTM2000（5 μL）并孵育5 min作為試劑A。加入Opti（100 μL）和miR-27b mimic/inhibitor 質(zhì)粒（20 ng/μL）并孵育5 min 作為試劑B。將A、B 試劑混合在一起并孵育20 min。16 h 后，更換培養(yǎng)基并收獲細胞。NC 組細胞轉(zhuǎn)染等量的NC 質(zhì)粒作為對照。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖活力

將100 μL 的細胞懸浮液添加到96 孔板，分別孵育24 h、48 h 后，將體積為10 μL 的CCK-8 溶液添加到每個孔中并孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm波長處的光密度（OD）值。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

將細胞用1×PBS 洗滌并懸浮在100 μL 結(jié)合緩沖液中，分別加入5 μL 的Annexin V-FITC 和10 μL的PI，并在室溫下黑暗中孵育10～15 min，最后將400 μL 的結(jié)合緩沖液添加到樣品中，并在1 h 內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩間的比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織病理學檢查結(jié)果

光學顯微鏡下觀察到，對照組神經(jīng)元分布均勻，細胞核結(jié)構(gòu)清晰；HICH 組的細胞核染色變深，并且出現(xiàn)間質(zhì)性水腫。見圖1。

圖1 大鼠腦組織病理學改變 （HE染色×200）

2.2 大鼠神經(jīng)元凋亡情況

光學顯微鏡下觀察到，細胞核為藍色，棕褐色為TUNEL 染色陽性表達細胞，即凋亡（見圖2）。HICH 組與對照組細胞凋亡指數(shù)分別為（35.91±3.24）和（2.75±0.36），兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=39.400，P=0.000）， HICH 組高于對照組。

圖2 大鼠神經(jīng)元凋亡情況 （TUNEL染色×400）

2.3 兩組大鼠腦組織中miR-27b mRNA相對表達量的比較

HICH 組大鼠腦組織中miR-27b mRNA 相對表達量為（3.45±0.48），對照組為（1.00±0.12），兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=19.180，P=0.000），HICH 組高于對照組。

2.4 3 組星形膠質(zhì)細胞miR-27b mRNA 相對表達量的比較

轉(zhuǎn)染后，3 組細胞miR-27b mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），miR-27b mimic 組高于NC 組（P＜0.05），miR-27b inhibitor 組低于NC 組（P＜0.05）。見表1。

表1 3組星形膠質(zhì)細胞miR-27b mRNA相對表達量的比較 （±s）

表1 3組星形膠質(zhì)細胞miR-27b mRNA相對表達量的比較 （±s）

注：?與NC組比較，P ＜0.05。

組別NC組miR-27b mimic組miR-27b inhibitor組F 值P 值miR-27b mRNA 1.00±0.09 3.86±0.35?0.62±0.05?424.448 0.000

2.5 3組星形膠質(zhì)細胞增殖活力的比較

3 組星形膠質(zhì)細胞增殖活力比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），miR-27b mimic 組低于NC 組（P＜0.05），miR-27b inhibitor 組高于NC 組（P＜0.05）。見表2。

表2 3組星形膠質(zhì)細胞增殖活力的比較 （±s）

表2 3組星形膠質(zhì)細胞增殖活力的比較 （±s）

注：?與NC組比較，P ＜0.05。

組別NC組miR-27b mimic組miR-27b inhibitor組F 值P 值48 h 0.81±0.08 0.65±0.07?0.97±0.09?23.753 0.000 24 h 0.46±0.04 0.40±0.05?0.53±0.06?9.896 0.000

2.6 3組星形膠質(zhì)細胞凋亡率比較

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，3 組星形膠質(zhì)細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），miR-27b mimic 組高于NC 組（P＜0.05），miR-27b inhibitor 組低于NC 組（P＜0.05）。見表3和圖3。

表3 3組星形膠質(zhì)細胞凋亡率的比較 （%，±s）

表3 3組星形膠質(zhì)細胞凋亡率的比較 （%，±s）

注：?與NC組比較，P ＜0.05。

組別NC組miR-27b mimic組miR-27b inhibitor組F 值P 值凋亡率5.73±0.56 17.89±1.40?3.12±0.35?466.797 0.000

圖3 miR-27b對星形膠質(zhì)細胞凋亡的影響

3 討論

HICH 多由長期的高血壓和顱內(nèi)動脈粥樣硬化引起，導(dǎo)致患者顱內(nèi)小動脈破裂引起實質(zhì)內(nèi)出血[12]。HICH 早期無癥狀，多在劇烈運動或情緒起伏狀態(tài)下突然出現(xiàn)劇烈頭痛、煩躁或嘔吐，在數(shù)分鐘或數(shù)小時內(nèi)進展為嗜睡、昏迷甚至死亡[13-14]。但是目前尚無有效治療HICH 和改善患者神經(jīng)功能的方法。

miRNA 是近年來的研究熱點，其可通過堿基配對識別并結(jié)合mRNA 的3'-端的非翻譯區(qū)域，進而誘導(dǎo)mRNA 的降解或者抑制翻譯[15-16]。動物實驗表明腦卒中大鼠血漿中miR-27b 的水平顯著上調(diào)，并與病情嚴重程度有關(guān)[17-19]。本研究通過對SHR 大鼠進行自體血腦內(nèi)注射復(fù)制HICH 大鼠模型，結(jié)果顯示復(fù)制后模型有明顯的腦組織損傷，發(fā)現(xiàn)大量細胞凋亡，并且出血腦組織中miR-27b mRNA 相對表達量顯著升高，這初步提示miR-27b 參與HICH后的組織損傷和神經(jīng)元凋亡，但是miR-27b 對何種細胞產(chǎn)生影響仍不清楚。

星形膠質(zhì)細胞是哺乳動物腦內(nèi)分布最廣泛的一類細胞，在維持微環(huán)境穩(wěn)定性和神經(jīng)回路功能方面起著至關(guān)重要的作用，在正常條件下，星形膠質(zhì)細胞負責調(diào)控鉀離子緩沖和神經(jīng)元代謝，并通過分泌細胞因子營養(yǎng)神經(jīng)元[20-21]。而在HICH 等病理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細胞會被激活，不僅通過分泌炎癥細胞因子幫助清除受損組織，并且還參與神經(jīng)元的重建[22]。近年來研究[23]表明星形膠質(zhì)細胞受到miRNA 的調(diào)節(jié)，如miR-194-5p 通過直接靶向神經(jīng)外營養(yǎng)蛋白抑制脂多糖誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞活化。miR-27b 在調(diào)節(jié)細胞存活、增殖及凋亡中起到關(guān)鍵作用，如下調(diào)miR-27b 的表達會通過靶向口腔扁平苔蘚中的PLK2 的表達促進角質(zhì)形成細胞增殖[24]。也有研究[25-26]顯示，提高miR-27b 水平會促進彌漫性大B 細胞淋巴瘤細胞的凋亡。為分析miR-27b 對星形膠質(zhì)細胞的影響，本研究通過轉(zhuǎn)染分別復(fù)制了miR-27b 過表達和沉默的星形膠質(zhì)細胞模型，并通過檢測轉(zhuǎn)染后miR-27b 的水平驗證了轉(zhuǎn)染結(jié)果。CCK-8 實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-27b 顯著抑制了星形膠質(zhì)細胞的增殖能力，并促進星形膠質(zhì)細胞凋亡；而miR-27b 水平的降低則促進了星形膠質(zhì)細胞的增殖活力，并抑制了凋亡。結(jié)合本次的細胞實驗和動物實驗，提示HICH 發(fā)生后miR-27b水平的升高誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞的凋亡，參與HICH的損傷。然而，本次研究也有許多不足之處，首先，miR-27b 調(diào)控星形膠質(zhì)細胞增殖和凋亡的機制仍需要進一步分析；其在HICH 中的作用仍需要進一步的動物實驗驗證；并且miR-27b 在HICH 中的意義也需要臨床研究證實。

綜上所述，miRNA-27b 在HICH 大鼠腦組織中顯著升高，抑制星形膠質(zhì)細胞的增殖并促進其凋亡。這提示miRNA-27b 可能是診斷和治療HICH 的新靶點。