楊書瀚，裴筱涵，祁義軍

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，合肥 2300222中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床病理中心，合肥 230002

結(jié)直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，2018年，中國的新增病例已經(jīng)達(dá)到52萬，位居所有癌癥的第二位[1]。尋找能提高診斷率、指導(dǎo)預(yù)后的分子靶標(biāo)是研究熱點(diǎn)。LAMP5是目前較受關(guān)注的腫瘤相關(guān)蛋白，在腫瘤中的研究主要集中于白血病領(lǐng)域。LAMP5是MLL融合蛋白的一個新靶點(diǎn)，在急性髓系白血病的增殖過程中發(fā)揮重要作用[2]，LAMP-5也是混合系白血病-重排急性白血病的一個重要的炎癥信號調(diào)節(jié)劑和新的免疫治療靶點(diǎn)[3]。有關(guān)LAMP5基因在結(jié)直腸癌中的研究尚未見報道，該研究通過生物信息學(xué)分析結(jié)合免疫組化驗(yàn)證，研究LAMP5在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平及其與臨床參數(shù)的關(guān)系，分析LAMP5與結(jié)直腸癌臨床生存、預(yù)后的關(guān)系，以期對結(jié)直腸癌的診斷、治療及評估預(yù)后提供理論和實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 病例資料結(jié)直腸癌組織標(biāo)本選取自2013-2018年在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科接受外科手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者，癌組織和配對癌旁組織各120例，所有病例均經(jīng)術(shù)后病理明確診斷，根據(jù)AJCC第8版進(jìn)行術(shù)后病理分期。術(shù)后電話或門診定期隨訪獲得生存資料，隨訪截止時間為2020年12月31日。用于實(shí)驗(yàn)組織標(biāo)本均與患者或授權(quán)家屬簽署安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的倫理協(xié)議。組織標(biāo)本在手術(shù)切除后使用10%中性福爾馬林固定，經(jīng)脫水浸蠟，石蠟包埋，以2.5 μm厚度連續(xù)切片。

1.2 所使用的數(shù)據(jù)庫GEPIA(www.gepia.cancer-pku.cn)數(shù)據(jù)庫是一個可以用來分析腫瘤和正常組織的線上工具，其數(shù)據(jù)來源于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫，可用來分析特定的基因或基因集在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)對比、腫瘤患者的臨床參數(shù)分析以及生存分析等[4]。ONCOMINE(www.oncomine.org)整合了TCGA和GEO的部分?jǐn)?shù)據(jù)，可用于分析基因表達(dá)差異、尋找離群值、預(yù)測共表達(dá)基因等，并可根據(jù)腫瘤分期、分級、組織類型等臨床信息進(jìn)行分類。本研究采用了ONCOMINE基因表達(dá)差異模塊，分析LAMP5在不同癌癥類型的癌組織相對其正常組織的表達(dá)水平。

1.3 免疫組化及判讀本研究采用免疫組化SP法進(jìn)行檢測，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行以下染色步驟：① 修復(fù)抗原：抗原修復(fù)之前加入0.3%過氧化氫溶液室溫孵育15 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶，使用微波爐在檸檬酸鈉修復(fù)液中修復(fù)5 min，常溫自動冷卻、洗滌；② 封閉抗原：使用山羊血清工作液封閉1 h；③ 一抗孵育：按照1 ∶500濃度稀釋兔抗人多克隆抗體LAMP5(HPA07076，sigma公司，美國)，在4 ℃冰箱中孵育過夜；④ 二抗孵育：次日洗去一抗，使用HRP標(biāo)記的1 ∶200濃度稀釋的抗兔IgG(Dako公司，丹麥)室溫孵育1 h；⑤ 顯色：洗去二抗，使用辣根過氧化物酶DAB顯色液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)進(jìn)行顯色。使用PBS代替一抗作為陰性對照，使用DAB試劑贈送的已知陽性片為陽性對照。由2名病理醫(yī)師雙盲條件下對每一張切片進(jìn)行讀片，每張切片隨機(jī)選取4個高倍視野(400倍)，根據(jù)視野內(nèi)陽性細(xì)胞百分率以及陽性程度使用半定量積分法評分分級，綜合參考已發(fā)表文獻(xiàn)[5-6]中的評分標(biāo)準(zhǔn)如下：① 陽性細(xì)胞百分率：未觀察到陽性細(xì)胞的為0分，陽性細(xì)胞占比<25%為1分，占比25%～75%為2分，占比>75%為3分；② 陽性程度：未顯色的為0分，淺黃色陽性為1分，棕黃色陽性為2分，棕褐色陽性為3分。將兩項(xiàng)得分相加取和：0～1分為陰性，2～3分為弱陽性，4～5分為中陽性，5～6分為強(qiáng)陽性。其中陰性和弱陽性結(jié)果判定為低表達(dá)，中陽性和強(qiáng)陽性結(jié)果判定為高表達(dá)。

1.4 生存分析使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析LAMP5表達(dá)與結(jié)直腸癌病人總生存期和無病生存期之間的相關(guān)性。GEPIA數(shù)據(jù)庫的生存信息來源于TCGA，將TCGA中的COAD和READ子數(shù)據(jù)集過濾樣本，按照LAMP5表達(dá)水平對樣本進(jìn)行排序，將前50%和后50%的樣本分別指定為“high-group”和“l(fā)ow-group”(通過分別將“Cutoff-high %”設(shè)置為50和“Cutoff-low %”設(shè)置為50)使用Kaplan-Meier法可視化。具體操作方法按照以下操作步驟：① 輸入基因名LAMP5；② 選擇總生存期或無病生存期；③ 選擇腫瘤類型(同時選取COAD和READ)；④ 可視化。GEPIA使用Log-rank法進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)。

將120例結(jié)直腸癌患者根據(jù)免疫組化LAMP5表達(dá)水平評分高低分為兩組，使用SPSS 23.0作生存分析并繪制Kaplan-Meier生存曲線。使用Log-rank法進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)。并且將120例結(jié)直腸癌患者的生存信息通過單因素和多因素COX風(fēng)險回歸模型分析研究結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)的危險因素。

1.5 基因集富集分析使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析LAMP5與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。使用Link Interpreter模塊進(jìn)行GO分析和KEGG分析。按照以下操作步驟：① 選擇結(jié)直腸癌；② 選擇RNAseq；③ 選擇LAMP5；④ 選擇RNAseq；⑤ 選擇Spearman相關(guān)性分析；⑥ 根據(jù)上一步結(jié)果，分別選擇GSEA中的GO和KEGG進(jìn)行聚類分析。

1.6 基因表達(dá)相關(guān)性分析使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析LAMP5在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)相關(guān)性基因。按照以下操作步驟：① 輸入基因名LAMP5；② 選擇相關(guān)性分析；③ 選擇腫瘤類型(同時選取COAD和READ)；④ 可視化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 23.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對于連續(xù)性變量若服從正態(tài)分布以描述，若呈偏態(tài)分布則以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)進(jìn)行描述。對于分類變量，采取n(%)進(jìn)行描述。使用χ2檢驗(yàn)分析免疫組化實(shí)驗(yàn)中LAMP5蛋白在結(jié)直腸癌組織和配對癌旁組織中的表達(dá)水平，以及LAMP5表達(dá)與結(jié)直腸癌病人臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性；使用Log-Rank檢驗(yàn)分析LAMP5表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性，使用COX回歸模型篩選結(jié)直腸癌預(yù)后獨(dú)立危險因素；使用皮爾遜相關(guān)性檢驗(yàn)分析LAMP5在LinkedOmics數(shù)據(jù)庫中的富集分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中LAMP5的表達(dá)使用免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測LAMP5在120例結(jié)直腸癌組織和配對癌旁組織中的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示LAMP5蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，陽性部位著色為黃色、棕黃色和棕褐色顆粒狀，在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平高于配對癌旁組織(P<0.05，圖1、表1)。通過分析ONCOMINE數(shù)據(jù)庫，LAMP5基因在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)高于配對相鄰的正常組織(圖2A)，進(jìn)一步在數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證了免疫組化結(jié)果。

圖1 LAMP5蛋白在配對組織

表1 LAMP5蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

2.2 LAMP5在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性LinkedOmics分析顯示LAMP5 mRNA上調(diào)與T分期、N分期和M期相關(guān)(圖2 B～D，P<0.05)。為了對生信分析數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，將120例結(jié)直腸癌癌組織按照LAMP5評分高低分為LAMP5高表達(dá)組和LAMP5低表達(dá)組。59例高齡組有34例LAMP5蛋白高表達(dá)，61例低齡組有37例LAMP5蛋白高表達(dá)，高齡組與低齡組LAMP5表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；60例男性組有38例LAMP5蛋白高表達(dá)，60例女性組有33例LAMP5蛋白高表達(dá)，男性組與女性組LAMP5表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；LAMP5蛋白表達(dá)水平與腫瘤分化負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與腫瘤N分期和M分期均正相關(guān)(P<0.05)，與T分期無相關(guān)性(表2)。

表2 LAMP5蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 LAMP5與結(jié)直腸癌病人預(yù)后的相關(guān)性分析GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示LAMP5高表達(dá)組結(jié)直腸癌患者(n=179)的總生存期短于LAMP5低表達(dá)組[P=0.014；HR=1.6，PP(HR)=0.033]。LAMP5高表達(dá)組(n=179)的無病生存期短于LAMP5低表達(dá)組[P=0.008 2；HR=2，P(HR)=0.001 9]。對120例結(jié)直腸癌患者臨床樣本作生存分析并繪制Kaplan-Meier生存曲線，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LAMP5高表達(dá)的患者比LAMP5低表達(dá)的患者具有更短的總生存期和無病生存期(P<0.05，圖3)。單因素COX分析結(jié)果表明，LAMP5表達(dá)、N分期和M分期與結(jié)直腸癌患者的總生存期和無病生存期相關(guān)(表3)。多因素COX分析顯示LAMP5表達(dá)、N分期和M分期是結(jié)直腸癌患者總生存期和無病生存期的獨(dú)立危險因素(表4)。

圖2 LAMP5在結(jié)直腸癌中的表達(dá)以及與臨床參數(shù)的關(guān)系

表3 結(jié)直腸癌總生存期和無病生存期單因素分析

表4 結(jié)直腸癌總生存期和無病生存期多因素分析

圖3 LAMP5與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 LAMP5在結(jié)直腸癌中基因富集分析使用Linkedomics數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出在結(jié)直腸癌中與LAMP5表達(dá)水平相關(guān)的前1 000位基因，在DAVID網(wǎng)站分析LAMP5在結(jié)直腸癌中的分子功能以及相關(guān)分子機(jī)制。GO分析細(xì)胞組分結(jié)果顯示LAMP5在結(jié)直腸癌中與細(xì)胞外基質(zhì)、黏附斑和細(xì)胞間連接等有關(guān)；GO分析生物過程結(jié)果顯示LAMP5在結(jié)直腸癌中與細(xì)胞黏附細(xì)胞外基質(zhì)組織、SMAD蛋白磷酸化、細(xì)胞基質(zhì)黏附和WNT信號通路等有關(guān)；GO分析分子功能結(jié)果顯示LAMP5在結(jié)直腸癌中與細(xì)胞外基質(zhì)定位、WNT蛋白定位和膠原定位等有關(guān)；KEGG分析結(jié)果顯示LAMP5基因可能與TGF-β信號通路、PI3K-Akt信號通路激活有關(guān)(P均<0.05，圖4)。

3 討論

LAMP5屬于LAMP家族的一員，是一種主要存在于溶酶體膜上的糖基化蛋白[7]。在正常生理過程中，LAMP5與大腦中一部分GABA能神經(jīng)元的短期突觸可塑性有關(guān)，在腦干和脊髓的感覺運(yùn)動處理中起著關(guān)鍵作用[8]。與LAMP5相關(guān)的疾病包括II型脊髓性肌萎縮癥和I型家族性噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥[9-10]。目前關(guān)于LAMP5的研究較少，Defays et al[11]發(fā)現(xiàn)人LAMP5位于新鮮分離的CD123(+)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間區(qū)室(ERGIC)中，并在被未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)寡核苷酸激活后迅速丟失。LAMP5在其他腫瘤中的研究尚未見報道，因此對LAMP5的研究具有較大的研究空間和價值。

本研究通過ONCOMINE和LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析顯示LAMP5在結(jié)直腸癌中表達(dá)水平升高且和腫瘤T、N和M分期存在相關(guān)性。使用免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，表明LAMP5在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平高于配對正常組織并且與N分期、M分期呈正相關(guān)，提示LAMP5可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生與進(jìn)展。

接著通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)直腸癌患者生存分析，結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌患者中，LAMP5高表達(dá)組總生存期和無病生存期均低于LAMP5低表達(dá)組?；谂R床樣本的生存分析結(jié)果與GEPIA分析結(jié)果一致，兩者互為印證表明結(jié)直腸癌組織中LAMP5的表達(dá)水平可能影響患者預(yù)后。經(jīng)過COX多因素分析進(jìn)一步證實(shí)LAMP5高表達(dá)是結(jié)直腸癌的獨(dú)立不良預(yù)后影響因素。

圖4 LAMP5在結(jié)直腸癌中的功能基因集富集分析

腫瘤的發(fā)生發(fā)展影響因素極其復(fù)雜，TGF-β和PI3K-Akt信號通路抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)增殖，是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中一個重要的信號通路[12]。本研究通過GO分析，顯示LAMP在結(jié)直腸癌中與細(xì)胞外基質(zhì)、黏附斑、細(xì)胞間連接、細(xì)胞黏附細(xì)胞外基質(zhì)組織、SMAD蛋白磷酸化、細(xì)胞基質(zhì)黏附和WNT信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)定位、WNT蛋白定位和膠原定位等有關(guān)；KEGG分析結(jié)果顯示LAMP5基因可能與TGF-β信號通路、PI3K-Akt信號通路激活有關(guān)，提示LAMP5可能通過作用細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的黏附能力促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移。

本研究的創(chuàng)新之處在于巧妙利用臨床數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測及分析，結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。由于臨床數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)是LAMP5基因mRNA水平的表達(dá)數(shù)據(jù)，而本實(shí)驗(yàn)主要研究LAMP5在結(jié)直腸癌中的蛋白水平，這樣設(shè)計實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于同時從基因和蛋白層面說明問題。本研究為LAMP5在結(jié)直腸癌中的臨床研究提供了理論基礎(chǔ)，提出了LAMP5可能作為調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的一個重要靶點(diǎn)，從而為結(jié)直腸癌的診斷、臨床治療和預(yù)測預(yù)后提供新思路。