鄭江霞，束 軍，汪 新，楊彩梅，沈繼龍

作者單位：1安徽醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，合肥 2300112病原生物學安徽省重點實驗室，人畜共患病安徽高校省級重點實驗室，合肥 230032

肺癌是中國乃至全世界發(fā)病率和病死率均居首位的惡性腫瘤[1]，其最常見的病理類型是肺腺癌。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)，是由色氨酸經(jīng)過羥化和脫羧催化合成的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，已被證明是多種正常細胞和腫瘤細胞培養(yǎng)的促有絲分裂因子，且特定的受體亞型與腫瘤的進展有關(guān)[2]。而苯噻啶是一種非選擇性5-HT1、5-HT2A和5-HT2C受體拮抗劑[3]，常用于預防和治療復發(fā)性血管性頭痛。近年研究發(fā)現(xiàn)苯噻啶對結(jié)腸癌[4]、胃癌[5]和肉瘤[6]等有直接抑制作用，而苯噻啶對肺癌治療的研究未見報道。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肺腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程[7]。Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)節(jié)肺癌細胞增殖、侵襲和遷移以及耐藥的重要途徑，可調(diào)節(jié)EMT進程[8]。該研究從增殖、遷移與侵襲三方面觀察不同濃度苯噻啶對人肺腺癌A549和PC9細胞的影響，并初步探究其可能的作用機制是否與Wnt3a/β-catenin-EMT通路有關(guān)，以期為肺癌治療研究的老藥新用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株與藥物人肺腺癌PC9細胞(貨號：CL-0668)購自武漢普諾賽公司；人肺腺癌A549細胞株由安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院中心實驗室惠贈。苯噻啶(貨號：HY-B1005)購自美國MCE公司，純度為99.73%，規(guī)格為100 mg，精密稱取29.544 mg溶于1 ml DMSO，配制成0.1 mol/L濃度儲備液，于-20 ℃保存，使用前室溫溶解，稀釋到所需濃度即可，實驗組混合溶液中DMSO濃度均不超過0.1%。

1.2 主要試劑與儀器RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基均購自美國HyClone公司；胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶公司；CCK-8 試劑盒(C0039)購自上海碧云天公司；青霉素/鏈霉素/兩性霉素B溶液(100 ×) 、0.25%胰酶、RIPA裂解液均購自山東思科捷公司；Transwell小室(3422)購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自購自美國BD公司；人Wnt-3a蛋白(Wnt3a)ELISA 試劑盒(JL14159)、人β-蛋白(β-catenin)ELISA 試劑盒(JL19217)、人E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)ELISA試劑盒(JL13185)、人基質(zhì)金屬蛋白酶 9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)ELISA 試劑盒(JL29650)均購自上海江萊生物公司；酶標儀購自美國Biotek公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 取出冷凍保存的A549和PC9細胞，于37 ℃水浴鍋融化，用配好的A549細胞培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基+10% FBS+1%青鏈兩性霉素B混合液)和PC9細胞培養(yǎng)基(RPMI-1640培養(yǎng)基+10% FBS+1%青鏈兩性霉素B混合液)分別復蘇于細胞瓶中，在5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。視貼壁細胞的生長狀態(tài)用0.25%胰酶進行消化傳代，選取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3.2CCK-8增殖實驗 制備單細胞懸液并計數(shù)，配成1×104/ml細胞懸液并混勻，每孔取100 μl細胞懸液，鋪2塊96孔板。細胞培養(yǎng)箱中過夜貼壁，實驗組分別用細胞培養(yǎng)基配制的不同濃度苯噻啶(10、20、30、40 μmol/L)溶液進行換液，細胞對照組和溶劑對照組分別用等量細胞培養(yǎng)基、含0.1% DMSO的細胞培養(yǎng)基進行換液，培養(yǎng)24、48 h后每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標儀在波長450 nm 處進行吸光度(optical density, OD)值檢測并計算各組細胞活力，實驗重復3次。

1.3.3細胞劃痕實驗 在6孔板背面劃6條水平直線(每孔均勻分布3條直線)，將細胞均勻接種于6孔板中。待細胞融合度達90%以上時，用移液槍槍頭在每孔中均勻劃出與背面直線相垂直的兩條劃痕，PBS清洗干凈后，實驗組分別加入等量含有不同濃度苯噻啶(10、20、30、40 μmol/L)的無FBS細胞基礎培養(yǎng)基，細胞對照組和溶劑對照組分別加入等量無FBS細胞培養(yǎng)基、含0.1% DMSO的無FBS細胞培養(yǎng)基。0 h和24 h后在顯微鏡下觀察和拍照，用Image J軟件測定劃痕面積并計算劃痕愈合率，實驗重復3次。

1.3.4Transwell遷移實驗 將細胞均勻接種于6孔板中，待細胞融合度達80%時，實驗組分別用細胞培養(yǎng)基配制的不同濃度苯噻啶(10、20、30、40 μmol/L)溶液進行換液，溶劑對照組用含0.1% DMSO的細胞培養(yǎng)基進行換液。置于培養(yǎng)箱中24 h后分別收集每孔細胞并計數(shù)，用無FBS細胞培養(yǎng)基重懸為5×103/ml的細胞懸液。取出24孔板中的小室，在下室加入500 μl含15% FBS的細胞培養(yǎng)基，上室放回6孔再各接種200 μl細胞懸液，置于培養(yǎng)箱24 h后取出小室，經(jīng)PBS洗滌、4%多聚甲醛溶液固定和0.1%結(jié)晶紫溶液染色后，用棉簽拭去上室殘留的細胞，在顯微鏡下隨機選取5個視野拍照并計算穿過小室的細胞數(shù)量，實驗重復3次。

1.3.5Transwell侵襲實驗 在冰上將Matrigel基質(zhì)膠和無FBS細胞培養(yǎng)基按1 ∶8稀釋，取50 μl稀釋液加入小室并均勻鋪滿，置于細胞培養(yǎng)箱凝固后再用無FBS細胞培養(yǎng)基水化備用，其余方法同1.3.4，實驗重復3次。

1.3.6ELISA檢測相關(guān)蛋白表達水平 將細胞均勻接種于6孔板中(3×105/孔)，待細胞融合度達80%時，實驗組分別用細胞培養(yǎng)基配制的不同濃度苯噻啶(10、20、30、40 μmol/L)溶液進行換液，溶劑對照組用含0.1% DMSO的細胞培養(yǎng)基進行換液。置于培養(yǎng)箱中24 h后分開收集每孔細胞并計數(shù)，用無FBS細胞培養(yǎng)基混勻稀釋各管細胞含量為1×106個，經(jīng)PBS重懸后加入100 μl細胞裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，4 ℃裂解30 min，12 000 r/min 離心20 min后吸取上清液，分裝凍于-80 ℃冰箱備用。按照ELISA試劑盒說明書對空白組、標準組和待測組(溶劑對照組和實驗組)加樣和處理，用酶標儀在波長450 nm處進行OD值檢測。采用ELISA法檢測并計算細胞中Wnt3a、β-catenin、MMP-9和E-cad蛋白表達量，實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 苯噻啶抑制肺腺癌A549、PC9細胞的增殖能力與溶劑對照組相比，實驗組細胞活力均下降，出現(xiàn)不同程度的增殖抑制現(xiàn)象。檢測結(jié)果顯示，苯噻啶作用24 h(A549：F=210.7；PC9：F=177.2)、48 h(A549：F=132.3；PC9：F=631.3)對A549和PC9細胞增殖均具有抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與24 h相比，20、30、40 μmol/L濃度組處理48 h的抑制作用更顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與細胞對照組相比，溶劑對照組未出現(xiàn)增殖抑制現(xiàn)象，差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

2.2 苯噻啶抑制肺腺癌A549、PC9細胞的遷移能力與溶劑對照組相比，劃痕實驗組中不同濃度苯噻啶處理肺腺癌細胞24 h(A549：F=868.9；PC9：F=921.0)后，劃痕愈合率下降，且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與細胞對照組相比，溶劑對照組對劃痕愈合率影響的組間差異無統(tǒng)計學意義；與溶劑對照組相比，Transwell實驗組中不同濃度苯噻啶處理肺腺癌細胞24 h(A549：F=474.2；PC9：F=784.6)后，遷移至下室的細胞減少，且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 苯噻啶抑制肺腺癌A549、PC9細胞的侵襲能力與溶劑對照組相比，實驗組中不同濃度苯噻啶處理肺腺癌細胞24 h(A549：F=354.0；PC9：F=193.2)后，侵襲至下室的細胞減少，且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 苯噻啶對肺腺癌A549、PC9細胞中Wnt3a/β-catenin-EMT通路相關(guān)蛋白含量的影響ELISA法檢測結(jié)果顯示，苯噻啶顯著降低A549和PC9細胞中Wnt3a(A549：F=534.62，P<0.05；PC9：F=534.08，P<0.05)和β-catenin(A549：F=124.51，P<0.05；PC9：F=212.22，P<0.05)的表達。苯噻啶作用于A549和PC9細胞24 h后，上皮標志物E-cad(A549：F=224.98，P<0.05；PC9：F=534.08，P<0.05)蛋白表達顯著上調(diào)，而金屬基質(zhì)酶MMP-9(A549：F=215.96，P<0.05；PC9：F=355.48，P<0.05)表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明苯噻啶可以抑制A549和PC9細胞中的Wnt/β-catenin-EMT信號通路。見表1、2。

3 討論

肺腺癌約占肺癌的40%，起源于小氣道上皮細胞，患者被診斷時已多為晚期、發(fā)生多處轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為咳嗽、咯血、胸痛和呼吸困難等癥狀，其治療手段包括早期的肺葉切除術(shù)、化療、免疫治療和靶向治療等。苯噻啶作為鎮(zhèn)痛藥，價格低廉且毒性小，是5-HT受體拮抗劑，且有抗組胺、抗色胺和抗毒蕈堿作用，可用于嘔吐、焦慮、蕁麻疹、早搏等多種病癥。近兩年研究發(fā)現(xiàn)苯噻啶對腫瘤細胞具有抑制作用：Piao et al[4]研究表明苯噻啶可通過下調(diào)Wnt信號通路來抑制結(jié)腸癌HCT116細胞的增殖和遷移能力；Jiang et al[5]研究表明苯噻啶可通過阻斷Wnt/β-catenin-EMT信號通路來抑制胃癌MNK45和AGS細胞的生長、遷移和侵襲能力，誘導細胞凋亡；Liu et al[6]發(fā)現(xiàn)苯噻啶可通過5-羥色胺受體1A(5-HTR1A)基因在肉瘤中發(fā)揮藥物作用。綜上，苯噻啶作為毒副反應明確、成本低、可及性高的臨床常用藥，在腫瘤治療上的新應用具有較大的潛在價值。

圖1 不同濃度苯噻啶對人肺腺癌A549和PC9細胞增殖能力的影響

表1 不同濃度苯噻啶對肺腺癌A549細胞Wnt3a、β-Catenin、E-cad、MMP-9表達量的影響

表2 不同濃度苯噻啶對肺腺癌PC9細胞Wnt3a、β-Catenin、E-cad、MMP-9表達量的影響

圖2 不同濃度苯噻啶對肺腺癌A549和PC9細胞遷移能力的影響

圖3 不同濃度苯噻啶對肺腺癌A549和PC9細胞侵襲能力的影響

苯噻啶對腫瘤細胞的抑制作用，可能源于它是一種5-HT受體拮抗劑。5-HT作為能影響情緒、認知和行為的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)可以發(fā)揮多種生物學作用，包括細胞分化和血小板聚集，其中信息傳遞是最重要的功能，且5-HT作為多種腫瘤細胞的生長因子，可促進多種癌細胞的增殖[9]。多項研究發(fā)現(xiàn)5-HT及受體對肺腺癌細胞生長發(fā)揮作用：5-HT3受體拮抗劑作為肺癌圍手術(shù)期的常用止吐藥對患者預后有正面作用，5-HT3受體拮抗劑還可以抑制A549細胞增殖、遷移和集落形成，其作用機制與ERK激酶途徑介導的細胞自噬死亡有關(guān)，故可將其作為肺癌手術(shù)患者的首選止吐藥[10]；5-HT7受體對肺腺癌A549細胞的遷移和侵襲能力具有正向調(diào)節(jié)作用，其機制與上調(diào)P38/MMP-9軸通路有關(guān)，促進肺腺癌H1299細胞的遷移和侵襲則與SRC/MMP-9軸通路有關(guān)[11]；Tone et al[12]研究表明肺腺癌中5-HTR3A高表達，且與增殖標志物Ki-67表達陽性密切相關(guān)，與血清素結(jié)合介導肺腺癌細胞的促增殖作用，敲除5-HTR3A和使用5-HT3受體拮抗劑托吡司瓊可抑制肺腺癌細胞的增殖。

Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)節(jié)細胞增殖、侵襲和遷移以及腫瘤耐藥的重要途徑，是肺癌生長的重要調(diào)控通路，Wnt和β-catenin主要都在肺癌細胞胞質(zhì)中表達[13]，除調(diào)控細胞增殖、遷移和侵襲外，β-catenin還誘導人肺腺癌的EMT進程[8]。E-cad是Wnt/β-catenin通路的下游分子，與β-catenin結(jié)合形成復合物，維持細胞極性和黏附，下調(diào)E-cad表達與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]。E-cad不僅是Wnt信號通路的重要成員，也是EMT關(guān)鍵的上皮標志物。EMT進程中，E-cad丟失導致β-catenin的核易位，細胞進行肌動蛋白重組，并通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶去除基底膜附著，β-catenin再誘導MMP-9合成，然后MMP-9完成間質(zhì)膠原的切割，促使癌細胞擴散[15]。

本研究以細胞培養(yǎng)基稀釋苯噻啶再作用于肺腺癌549和PC9細胞，實驗結(jié)果揭示，苯噻啶能明顯抑制肺腺癌細胞的增殖、遷移與侵襲行為，這種抑制效應與苯噻啶的作用濃度和作用時間有關(guān)；進一步研究顯示苯噻啶給藥可增加E-cad蛋白的表達，降低Wnt3a、β-catenin、MMP-9蛋白的表達：β-catenin、Wnt3a是Wnt/β-catenin信號通路中的主要蛋白表達，二者均下降表明苯噻啶可以下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路；而E-cad蛋白和MMP-9蛋白是EMT的標志蛋白，E-cad高表達而MMP-9低表達表明苯噻啶可以抑制肺腺癌細胞的EMT進程；Wnt/β-catenin信號通路可以介導EMT進程，EMT進程是遷移和侵襲必需的細胞學形態(tài)轉(zhuǎn)變，所以苯噻啶可能是通過阻斷Wnt/β-catenin-EMT通路來抑制肺腺癌細胞的惡性生物學行為。

綜上，在體外實驗中，苯噻啶對人肺腺癌A549、PC9細胞的增殖、遷移和侵襲能力具有抑制作用，抑制作用的強弱依賴于苯噻啶的濃度和作用時間。其作用機制，可能包括Wnt3a/β-catenin-EMT通路的阻斷。本研究僅為體外細胞實驗和作用機制的初步探討，其具體機制和靶向蛋白及交互作用還有待進一步研究。