金科華，游云悠，魏友煜，左 越，柯志強，堯 青，劉 潔

作者單位：湖北科技學(xué)院1糖尿病與血管病變湖北省重點實驗室、2醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、3醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2018級卓越醫(yī)師班、4醫(yī)學(xué)部健康醫(yī)學(xué)院，咸寧 437100

多數(shù)腫瘤細(xì)胞有兩大代謝特征，一是通過從頭合成途徑合成[1]核苷酸；二是脂肪酸合成旺盛。磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)的中間產(chǎn)物5-磷酸核糖和NADPH分別是核苷酸和脂肪酸合成的必須原料。抑制PPP可抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成和脂肪酸合成，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。6-磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PD)是PPP的限速酶，催化6-磷酸葡萄糖(glucose 6-phosphate，G6P)和NADP+轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯和NADPH(在340 nm波長處有特征吸收值)。高活性的G6PD與腫瘤發(fā)展和不良預(yù)后密切相關(guān)[2-3]，G6PD缺失與腫瘤的生長呈負(fù)相關(guān)[4-5]。6-氨基煙酰胺通過抑制G6PD，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生氧化性脅迫，提高腫瘤對抗癌藥物和放療的敏感性[6-8]。脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)通過抑制G6PD能有效抑制腫瘤增殖[9]。然而，DHEA治療非小細(xì)胞肺癌時，易導(dǎo)致患者產(chǎn)生嚴(yán)重的抑郁和疲倦[10]，6-氨基煙酰胺有神經(jīng)毒性[11]，限制了它們在臨床上的應(yīng)用，故發(fā)現(xiàn)更多靶向G6PD的抑制劑具有重要意義。為此，擬在原核生物中表達(dá)人G6PD，并建立其體外抑制劑篩選模型，為發(fā)現(xiàn)G6PD抑制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料大腸桿菌BL21(DE3)、質(zhì)粒pET-28a為湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院保存。G6PD cDNA(與Genebank中NM_001360016.2的G6PD序列一致)由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。DNA聚合酶、DNA連接試劑盒購自TaKaRa(大連)公司。大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。引物、質(zhì)粒抽提試劑盒、卡那霉素(Kana)、凝膠回收試劑盒、G6P、NADP購自上海生工生物工程有限公司?？焖傧拗泼纲徸悦绹鳩ermentas公司，鎳離子親和層析柱購自美國GE公司。DHEA購自美國Sigma公司。兔抗人G6PD IgG單克隆抗體(一抗)購自杭州Epitomics公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(簡稱二抗)購自北京中杉金橋公司。

1.2 主要儀器Eppendorf 5425 R微量離心機(美國eppendorf公司)；HERMLE Labortechnik GmbH Z 32 HK離心機(德國HERMLE公司)；TS-1000 PCR儀、蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；DYY-6C電泳儀電源、DYCP-31DN型瓊脂糖水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；JY92II DN型超聲波細(xì)胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 PCR擴增G6PD cDNA根據(jù)G6PD cDNA序列，設(shè)計上游引物P1：5′-CGACATATGATGGCAGA-GCAGGTGGCCCTG-3′，下游引物P2：5′-ACGCTCG-AGTCAGAGCTTGTGGGGGTTCAC-3′。下劃線序列分別為NdeⅠ、XhoⅠ位點。PCR反應(yīng)體系：H2O 40.5 μl，10× Pyrobest Buffer 5 μl，dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)2 μl，P1(10 μmol/L)、P2(10 μmol/L)各1 μl，G6PD cDNA 0.25 μl(90 ng), Pyrobest DNA polymerase 0.25 μl。PCR循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃修復(fù)延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，并按DNA凝膠回收試劑盒回收。

1.4 G6PD cDNA和pET-28a的酶切與回收G6PD cDNA酶切反應(yīng)：H2O 16 μl，cDNA 25 μl，10× FD Buffer 5 μl，NdeⅠ和XhoⅠ 各2 μl，37 ℃保溫3 h。質(zhì)粒酶切反應(yīng)：H2O 42 μl，pET-28a 8 μl(800 ng)，10× Buffer 6 μl，NdeⅠ和XhoⅠ 各2 μl，37 ℃保溫3 h。酶切的cDNA和質(zhì)粒按凝膠回收試劑盒回收。

1.5 目的基因與載體的連接及轉(zhuǎn)化取1.4酶切的pET-28a 和G6PD 各2.5 μl、DNA連接試劑盒之Solution I 5 μl，混勻，16 ℃連接3 h。將100 μl Top10感受態(tài)細(xì)胞冰浴解凍，將5 μl連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞，輕吸混勻，按冰浴30 min、-42 ℃ 60 s、-冰浴2 min的程序轉(zhuǎn)化，向轉(zhuǎn)化后的菌液中，加入500 μl LB培養(yǎng)基，200 r/min 37 ℃活化菌體1 h。取100 μl菌液，涂布于含50 μg/ml Kana的LB平板(抗性平板)，篩選重組子。

1.6 重組質(zhì)粒的酶切和測序鑒定取1.5篩選的單菌落兩個，分別接種于兩支4 ml 抗性(50 μg/ml Kana)LB，37 ℃ 、220 r/min培養(yǎng)10 h。取菌液1 ml，按質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，記為pG1、pG2。質(zhì)粒雙酶切鑒定：pG1(或pG2，或pET-28a)8 μl，NdeⅠ、XhoⅠ各1 μl，10× FD Buffer 2 μl，H2O 8 μl，37 ℃酶切2 h。將酶切產(chǎn)物于1%的瓊脂糖進行電泳鑒定。委托廣州英濰捷基公司對酶切陽性的質(zhì)粒測序。

1.7 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)G6PD取pG1 10 ng，按1.5的方法轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，篩選單菌落。取抗性菌落1個，記為BL21-pG1，接種于4 ml抗性LB，37 ℃ 、250 r/min培養(yǎng)10 h，作母液。將母液按1 ∶100平行接種2份于100 ml抗性LB中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)至A600為0.6。誘導(dǎo)組加入IPTG至終濃度0.4 mmol/L，對照組加等體積的無菌水。兩份菌液于37 ℃、 250 r/min培養(yǎng)5 h。10 000 r/min室溫離心1 min(下稱離心)，去上清液，沉淀用PBS洗滌兩次。離心，去PBS上清液，沉淀用30 ml、100 mmol/L 、pH7.5 Tris-HCl重懸。按225 W功率、超聲2 s 、停4 s的程序，冰浴超聲重懸的沉淀30 min。以4 ℃、13 000 r/min離心超聲處理菌體10 min。取上清液600 μl，與200 μl 4× Loading Buffer混勻，100 ℃變性10 min，取20 μl變性蛋白進行SDS-PAGE檢測。

1.8 G6PD的純化取鎳離子層析珠0.5 ml，棄去保存液，用超純水洗滌2次。在4 ℃冰箱中，將層析珠與裂解液上清液混合30 min，流出未結(jié)合的蛋白。依次用含20、40、80 mmol/ L咪唑的100 mmol/ L 、pH7.5 Tris-HCl洗滌層析珠。加25 ml洗脫液(含200 mmol/L咪唑的100 mmol/L 、pH7.5 Tris-HCl)洗脫G6PD。取600 μl洗脫液，200 μl 4× Loading Buffer，混勻，100 ℃加熱變性10 min， 13 000 r/min室溫離心2 min，取上清液。按Millipore超濾管(截留分子量10 ku)說明書，將洗脫液超濾濃縮至約500 μl。用BCA法測定濃縮蛋白濃度。取450 μl濃縮蛋白與50 μl甘油混勻，分裝后-80 ℃保存。

1.9 Western blot檢測G6PD取1.6和1.7的變性蛋白樣品各10 μl，于10%的分離膠進行SDS-PAGE。將分離的蛋白濕法恒壓120 V×1 h電轉(zhuǎn)至PVDF膜。將PVDF膜浸于5 % BSA中，室溫處理1 h，將1 ∶1 000稀釋的G6PD一抗與PVDF膜4 ℃孵育過夜。取出PVDF膜，用TBST洗滌3次×10 min。加入1 ∶5 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次×10 min。用ECL覆蓋PVDF膜，于Bio-Rad 公司的ChemiDoc XRS+成像中系統(tǒng)檢測條帶信號。

1.10 G6PD抑制劑體外篩選模型的建立確定G6PD最佳濃度。按文獻[8]配制G6PD反應(yīng)緩沖液(G6PD buffer, GB)。用GB配置4 mmol/L G6P和2 mmol/L NADP，將適量的G6P和NADP等體積混勻，作為底物混合液，4 ℃避光待用。冰浴解凍-80 ℃保存的G6PD。向96孔板中的加入底物混合液190 μl，置Varioskan Flash微孔板度數(shù)儀(賽默飛世爾，美國)，37 ℃預(yù)熱10 min。每孔分別加入10 μl不稀釋、稀釋5倍、稀釋25倍的G6PD(終濃度依次為22.5、4.5、0.9 μg/ml)或10 μl GB，混勻，每30 s測定一次A340，測定6 min，繪制Time-A340曲線，確定最佳G6PD濃度。

確定陽性對照DHEA的最佳濃度。向96孔板中加入：底物混合液180 μl，濃度分別為200、40、8 μmol/L的DHEA溶液(終濃度分別為10、2、0.4 μmol/L)或DMSO各10 μl，最適濃度G6PD 10 μl。按上述程序測定A340，繪制Time-A340曲線。按文獻[12]計算模型的可靠性因子—Z′因子，確定最佳DHEA濃度。以上實驗均為三次生物學(xué)重復(fù)。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理用EXCEL 2013計算重復(fù)測定的數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 pET-28a-G6PD的構(gòu)建PCR產(chǎn)物分子量介于1 400 ～1 600 bp，與G6PD cDNA分子量(1 569 bp)一致(圖1A)，對照組無擴增產(chǎn)物。雙酶切的pG1、pG2均產(chǎn)生兩條帶，小帶分子量介于1 000～2 000 bp，與G6PD cDNA分子量相符；大帶分子量與pET-28a(5 369 bp)酶切片段相符(圖1B)。測序結(jié)果與G6PD cDNA序列一致?？梢奊6PD cDNA正確插入pET-28a質(zhì)粒。

圖1 pET-28a-G6PD的構(gòu)建

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定人G6PD分子量約58 ku，重組G6PD(recombinant G6PD, rG6PD)較之G6PD多出由載體翻譯產(chǎn)生的29個氨基酸(分子量約3 ku)，故rG6PD分子量約61 ku。由圖2A可見，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21-pG1裂解液上清液及純化產(chǎn)物有61 ku左右蛋白條帶(箭頭示)，與rG6PD分子量相符，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)時無61 ku的條帶。經(jīng)quantity one軟件分析，純化的G6PD總蛋白的84%。Western blot結(jié)果提示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，BL21-pG1裂解液上清及純化產(chǎn)物均存在61 ku條帶(箭頭示)，與rG6PD分子量相符(圖2B)。濃縮的rG6PD濃度為0.5 mg/ml，可知rG6PD總量為0.25 mg，故其表達(dá)量為2.5 mg/L。

圖2 鑒定G6PD表達(dá)產(chǎn)物

2.3 G6PD抑制劑體外篩選模型的建立

2.3.1G6PD最佳濃度的確定 不同G6PD濃度的時間-A340曲線見圖3。不加G6PD時，保溫過程中A340無變化。隨G6PD濃度增大，A340升高速度加快。在測定起點，22.5、4.5、0.9 μg/ml G6PD組A340相同。反應(yīng)0.5 min，三種G6PD濃度的A340升高值(ΔA340)依次為0.202、0.015、0.010；反應(yīng)0.5～1 min，ΔA340依次為0.076、0.015、0.01；反應(yīng)1～1.5 min，ΔA340依次為0.028、0.015、0.01?？梢?2.5 μg/ml G6PD濃度過大，最大反應(yīng)速度發(fā)生在加入酶液后的30 s(甚至更短時間)內(nèi)，因G6P被大量氧化，其濃度急劇降低，產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯急劇升高，導(dǎo)致反應(yīng)速度快速下降。反應(yīng)前3 min內(nèi)，4.5、0.9 μg/ml G6PD組ΔA340分別恒定為0.015、0.010；反應(yīng)3～6 min，4.5 μg/ml G6PD組每30 s內(nèi)ΔA340逐步下降，0.9 μg/ml G6PD組ΔA340仍恒定為0.010。22.5 μg/ml G6PD組無法通過ΔA340來觀測酶活力，不適合抑制劑的篩選; 4.5、0.9 μg/ml G6PD組前3 min均能通過ΔA340的變化來觀測G6PD酶活力，但0.9 μg/ml G6PD組ΔA340恒定時間更長，便于操作，故稀釋25倍是G6PD的最佳濃度(900 μg/L)。

2.3.2最佳DHEA濃度的確定 不同DHEA濃度的時間-A340曲線如圖4，隨DHEA濃度增大，A340升高速度逐步變慢。20、2、0.2 μmol/L的DHEA對G6PD的抑制率分別為(80.7±0.2)%，(40.1±1.7)%，(19.6±1.0)%；模型的Z′因子分別為0.88、0.74、0.18。Z′因子低于0.5時，模型不可靠；Z′因子越大，模型可靠性越高。可見，當(dāng)DHEA為20 μmol/L時，Z′因子最符合高通量篩選要求。故DHEA最佳濃度為20 μmol/L。

圖3 不同G6PD濃度的時間-A340曲線

圖4 不同DHEA濃度的時間-A340曲線

3 討論

本研究構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a-G6PD，重組菌BL21-pG1經(jīng)0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、鎳離子親和純化，獲得可溶性的G6PD，產(chǎn)量為2.5 mg/L。以G6P為底物、NADP為輔因子、900 μg/L G6PD為最佳酶濃度、20 μmol/L DHEA為陽性對照，建立了高可信度的G6PD體外抑制篩選模型，為發(fā)現(xiàn)G6PD的抑制劑奠定了基礎(chǔ)。

BL21-GPG6PD經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌中獲得了高水平表達(dá)，但主要以包涵體形式存在(SDS-PAGE檢測圖未列出)，可溶性蛋白產(chǎn)量偏低。汪自然 等[13]構(gòu)建Luk S-PV與GFP融合蛋白表達(dá)載體在大腸桿菌中獲得了較高水平的可溶性表達(dá)。后續(xù)擬將嘗試G6PD與標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)、延長誘導(dǎo)時間等措施提高可溶性G6PD的產(chǎn)量，以滿足大規(guī)模抑制劑篩選對酶的需求。

G6PD純度為84%，表明還存在少量雜質(zhì)蛋白。雜質(zhì)蛋白可能對酶促反應(yīng)有一定干擾，為此擬在提高G6PD產(chǎn)量的基礎(chǔ)上，進一步采用增加分子篩等純化手段提高G6PD的純度，盡可能降低雜質(zhì)的干擾。

當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)大于酶濃度時，酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比。理論上，22.5、4.5、0.9 μg/ml 的G6PD在最大反應(yīng)速度階段，ΔA340的比例應(yīng)為25 ∶5 ∶1，而實際ΔA340比例約為202 ∶15 ∶10，具體原因需進一步研究。

基于體外篩選模型篩選的抑制劑，尚不能判斷其在體內(nèi)的毒副作用。G6PD抑制劑篩選模型亦如此，故采用本模型篩選所得的G6PD抑制劑，需要進一步觀測其體內(nèi)的毒副作用。