蔣 倩，圣 豪，劉國(guó)瑩，余孝海，鐘明奎

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，合肥 230032

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea, OSA)是影響5%普通人群和 18% 50歲以上老年人群的常見(jiàn)疾病[1-2]。OSA的特點(diǎn)是睡眠期間反復(fù)呼吸暫停，導(dǎo)致間歇性低氧和睡眠片段化，是高血壓、缺血性心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、中風(fēng)等心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。間歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)可通過(guò)氧化應(yīng)激、一氧化氮利用不足、全身炎性反應(yīng)、交感神經(jīng)過(guò)度激活和內(nèi)皮修復(fù)能力降低等途徑導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而增加高血壓等心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。Tempol是一種抗氧化劑[4]，作為SOD類似物，可以穿透細(xì)胞膜并與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的氧自由基反應(yīng)，通過(guò)清除ROS減少氧化應(yīng)激保護(hù)血管內(nèi)皮功能[5-6]。該研究旨在探討口服Tempol對(duì)IH引起的小鼠心血管損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只雄性清潔級(jí)C57小鼠，體質(zhì)量(24±3)g，由安徽長(zhǎng)臨河醫(yī)藥科技有限公司提供，合格證號(hào)[Scxk(皖)2017-001]。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，通風(fēng)良好，室溫18～25 ℃。

1.1.2儀器 測(cè)氧儀(CYS-1型，南京新飛分析儀器制造有限公司)；DMT 620M血管張力測(cè)定系統(tǒng)(丹麥DMT公司)；倒置熒光顯微鏡，冰凍切片機(jī)(德國(guó)徠卡)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.1.3試劑 醫(yī)用壓縮氧氣(濃度>99.9%)、壓縮氮?dú)?濃度>99.9%)由合肥眾益化工產(chǎn)品有限公司充裝；Dihydroethidium(DHE)、NO測(cè)試盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Tempol、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、硝普納(sodium nitroprusside，SNP)、苯腎上腺素(phenylephrine，Phe)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1IH模型的制備和分組 小鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分成正常氧量組(Control)、間歇性低氧組(IH)、間歇性低氧Tempol干預(yù)組(IH+Tempol)，每組12只。本研究采用IH誘導(dǎo)小鼠心血管損傷模型，通過(guò)氮?dú)庀♂屧?，向低氧艙循環(huán)充入氮?dú)夂脱鯕?，每一循環(huán)為9 min，4 min充入氮?dú)猓S之5 min充入氧氣，由測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)間歇性低氧艙中的氧濃度，調(diào)節(jié)氣體流量，使每一循環(huán)間歇性低氧艙內(nèi)的最低氧濃度達(dá)到6%左右，持續(xù)時(shí)間為45 s左右，然后再逐漸恢復(fù)至21%，間歇性低氧艙內(nèi)氮?dú)夂脱鯕獾霓D(zhuǎn)換通過(guò)定時(shí)電磁轉(zhuǎn)換器來(lái)完成(圖1)。將IH組以及IH+Tempol組小鼠放進(jìn)低氧倉(cāng)內(nèi)，進(jìn)行每天8 h的間歇性低氧處理(9 ∶00 am-5 ∶00 pm)，連續(xù)4周。Control組除不入箱內(nèi)，其余均與IH組進(jìn)行相同處理。在間歇性低氧處理3周之后，IH+Tempol組連續(xù)1周每天使用Tempol(100 mg/kg)給予灌胃處理，而Control組和IH組則灌注相同體積0.9%生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第4周末，處死小鼠，進(jìn)行血管離體實(shí)驗(yàn)。

圖1 間斷性低氧艙內(nèi)氧含量的變換模式

1.2.2心臟重量指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽渫瓿珊?，首先進(jìn)行小鼠體質(zhì)量測(cè)量，隨即用10%水合氯醛(0.05 ml/10 g)腹腔注射麻醉。將麻醉小鼠固定，準(zhǔn)備成套眼科剪與鑷子打開(kāi)小鼠胸腔，將心肺等器官充分暴露，隨即將還在跳動(dòng)的心臟迅速摘取，剝離多余結(jié)締組織等，隨后置于冰冷生理鹽水中，輕輕沖洗，擠壓多余血水，用吸水紙將心臟中多余水分吸除，稱重后立即進(jìn)行稱重后液氮存放，計(jì)算心重指數(shù)為心臟重量/體質(zhì)量(mg/g)；將小鼠脛骨完整分離出，取出測(cè)量長(zhǎng)度，計(jì)算心臟重量/脛骨長(zhǎng)度(mg/cm)的比值。

1.2.3離體血管張力檢測(cè) 利用CO2吸入法麻醉并處死小鼠，采用上述方法摘取小鼠心臟后，緊貼小鼠脊柱，取出完整胸主動(dòng)脈，操作需動(dòng)作快速輕柔，對(duì)血管無(wú)牽拉。將血管放置在預(yù)先接通混合氧(95%O2和5%CO2)的Krebs溶液中，借助顯微鏡，將包裹在血管周圍多余脂肪和結(jié)締組織以及其他雜質(zhì)從外壁上小心清除，使其達(dá)到干凈透明狀態(tài)。然后將胸主動(dòng)脈分別截?cái)酁? cm左右。手持眼科鑷，將血管環(huán)固定在Myograph 張力器兩端，浴槽中持續(xù)通入混合氧，預(yù)置5 ml的Krebs液，全程保持pH值7.4，溫度37 ℃。待血管穩(wěn)定后，再給予2 mN的前負(fù)荷，緩慢拉伸血管環(huán)，并利用Powerlab系統(tǒng)記錄血管張力的變化。待平衡30 min后，加入高鉀溶液刺激血管，每次60 mmol/L，2次/15 min。血管達(dá)到最大收縮時(shí)，吸出高鉀溶液，隨后用Krebs液洗脫殘留藥物，3次/15 min。隨后加入3 μmol/L Phe刺激血管預(yù)收縮，在收縮達(dá)到穩(wěn)定峰值時(shí)，加入ACh(10-8～10-5.5mol/L)或SNP(10-9～10-5mol/L)，檢測(cè)血管內(nèi)皮依賴性與內(nèi)皮非依賴性舒張功能。ACh可激動(dòng)血管內(nèi)皮細(xì)胞M3亞型，促進(jìn)內(nèi)皮依賴性舒張因子(endothelium-derived relaxing factor, EDRF)之一NO的釋放，從而引起鄰近平滑肌細(xì)胞松弛，促使血管內(nèi)皮性依賴性舒張；SNP致使平滑肌松弛，在血管平滑肌內(nèi)代謝產(chǎn)生NO，引起血管非內(nèi)皮依賴性舒張。

1.2.4胸主動(dòng)脈中NO測(cè)定 取剝離干凈的胸主動(dòng)脈加入裂解液，使用低溫超聲裂解儀裂解組織，離心取上清液；使用裂解液將1 mol/L的NaNO2稀釋成1、10、20、40、60、80、100 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品；配制1 mol/L的NaNO2，參考說(shuō)明書的操作步驟操作，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)量出吸光度(optical density, OD)值。

1.2.5胸主動(dòng)脈中活性氧(reactive oxygen species，ROS)測(cè)定 將剝離干凈的胸主動(dòng)脈用OTC包埋，冰盒靜置后放入液氮，最后置-80 ℃冰箱保存。使用冰凍切片機(jī)將包埋好的血管切成5μm的病理切片。將DHE ROS熒光探測(cè)液(5 μmol/L)與標(biāo)本常溫避光孵育5～ 20 min。DHE在超氧化物生成處被氧化成為氧化乙錠，與DNA相結(jié)合之后，可被激發(fā)出紅色的熒光，通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光的強(qiáng)度，并ImageJ軟件計(jì)算血管內(nèi)ROS含量。

2 結(jié)果

2.1 Tempol對(duì)IH小鼠主動(dòng)脈舒張功能的影響離體血管張力檢測(cè)結(jié)果顯示：3組小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能存在明顯差異[F(2,15)=27.54，P<0.001](圖2A)。與Control組相比，IH 4周后，Phe預(yù)收縮的胸主動(dòng)脈環(huán)對(duì)ACh引起的內(nèi)皮依賴性舒張顯著降低(P<0.001)；口服SOD類似物tempol可改善IH引起的內(nèi)皮依賴性舒張功能(P<0.001)，但不能完全恢復(fù)正常內(nèi)皮依賴性舒張水平。3組間Phe預(yù)收縮的胸主動(dòng)脈環(huán)對(duì)SNP引起的內(nèi)皮非依賴性舒張差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。提示IH可能是通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞而不是平滑肌細(xì)胞引起血管舒張功能的改變。

2.2 Tempol對(duì)IH小鼠主動(dòng)脈中ROS與NO含量的影響圖3A-C依次為Control組、IH組、IH+Tempol組小鼠胸主動(dòng)脈DHE熒光染色后顯示ROS分布與濃度。熒光亮度與ROS含量正相關(guān)，亮度越強(qiáng)，ROS含量越多。分析結(jié)果顯示：與Control組相比，IH組小鼠胸主動(dòng)脈中ROS熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.001)，口服Tempol可降低IH小鼠胸主動(dòng)脈中ROS水平(P<0.001)，但不能恢復(fù)到正常水平(P<0.001)(圖3D)。提示Tempol作為超氧陰離子清除劑可通過(guò)減少血管中活性氧的產(chǎn)生或者清除活性氧來(lái)發(fā)揮保護(hù)心血管的作用。NO測(cè)定結(jié)果顯示：與Control組相比，IH組小鼠胸主動(dòng)脈中NO含量降低(P<0.001)，口服Tempol后，可以提高IH小鼠胸主動(dòng)脈中的NO含量(P<0.01)，但不能恢復(fù)到正常水平(P<0.001) (圖3E)。提示Tempol可能是通過(guò)減少活性氧的產(chǎn)生，提高NO生物利用率來(lái)減少血管內(nèi)皮功能損傷，從而發(fā)揮心血管保護(hù)作用。

2.3 Tempol對(duì)IH小鼠體質(zhì)量和心臟重量的影響與Contol組相比，間歇性低氧4周后，IH組小鼠體質(zhì)量顯著降低[F(2,21)=15.28，P<0.001]，而心臟重量/體質(zhì)量比值[F(2,21)=19.16，P<0.001]和心臟重量/脛骨長(zhǎng)度比值[F(2,21)=12.08 ，P<0.001]顯著增加，提示間歇性低氧小鼠出現(xiàn)心肌肥大。口服Tempol后，與IH組比較，IH+Tempol 組小鼠的體質(zhì)量明顯增加(P<0.01)，心臟重量/體質(zhì)量比值(P<0.01)和心臟重量/脛骨長(zhǎng)度比值(P<0.01)明顯下降，提示Tempol可抑制IH小鼠心肌肥大。見(jiàn)表1。

表1 Tempol對(duì)間歇性低氧小鼠體質(zhì)量和心臟重量的影響

圖2 Tempol對(duì)IH小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響

圖3 小鼠主動(dòng)脈ROS和NO含量 SP×400

3 討論

本研究顯示經(jīng)IH處理4周，可引起小鼠胸主動(dòng)脈對(duì)ACh引起的內(nèi)皮依賴性舒張功能下降、心肌肥大，胸主動(dòng)脈中ROS增加而NO水平降低，提示IH引起的心血管功能障礙可能與氧化應(yīng)激增加使NO的生物利用度下降有關(guān)；口服SOD類似物Tempol，使IH小鼠胸主動(dòng)脈中ROS水平降低、NO濃度增加，改善IH引起的內(nèi)皮依賴性舒張功能和心肌肥大。

OSA是多種心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是患者致殘和死亡的主要原因，IH是OSA的主要病理生理學(xué)特點(diǎn)和損傷機(jī)制，被認(rèn)為是引起心腦血管疾病的最為重要的因素[7]。反復(fù)IH可引起氧化應(yīng)激和ROS增加，而ROS可作為信號(hào)分子在OSA引起的并發(fā)癥中起著重要的作用，抑制ROS對(duì)心血管具有重要的保護(hù)作用[8]。ROS是氧在生物體內(nèi)通過(guò)單電子還原產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)活潑的物質(zhì)，包括超氧陰離子(·O-2)、羥自由基(·OH)和過(guò)氧化氫(H2O2)等。細(xì)胞內(nèi)的ROS來(lái)源于氧化酶催化的代謝產(chǎn)物和線粒體電子傳遞鏈，涉及ROS代謝的酶有NAD(P)H 氧化酶(NOX)、黃嘌呤氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫(CAT)等。超氧化物會(huì)氧化生物分子，與NO的反應(yīng)促進(jìn)過(guò)氧亞硝酸鹽的形成，減少NO的生物利用度。而在SOD的作用下CAT酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶則可將過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧氣，在ROS的代謝中發(fā)揮了重要作用。Tempol 是一種可透膜的金屬非依賴性SOD擬似物，可以減輕自由基引起的損傷，提高NO的生物利用度，在氧化應(yīng)激的動(dòng)物模型中發(fā)揮有益的作用[9]。本研究中，Tempol可抑制IH小鼠主動(dòng)脈中ROS水平，提高NO濃度，顯著改善IH小鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能和心肌肥大。Troncos et al[10]也發(fā)現(xiàn)，Tempol可明顯降低間歇性低氧模型大鼠的血壓、血漿內(nèi)皮素和血管內(nèi)ROS水平，提示ROS在IH誘發(fā)的心血管疾病中起著重要作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是連續(xù)覆蓋于血管腔表面的單層上皮細(xì)胞，是多種血管活性物質(zhì)的產(chǎn)生和作用部位，在維持血管張力、參與管壁炎癥修復(fù)、調(diào)節(jié)血管生長(zhǎng)以及調(diào)控血小板聚集和凝血功能等方面起著重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)產(chǎn)生的NO，促進(jìn)局部血管舒張，抑制血小板聚集、單核細(xì)胞黏附和血管平滑肌增殖來(lái)維持血管正常的形態(tài)和功能。內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是心血管疾病發(fā)展過(guò)程中最早可檢測(cè)到的和可能被逆轉(zhuǎn)的異常之一。內(nèi)皮功能障礙通常指的是內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損，與NO生物利用度降低有關(guān)；而非內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損，則表示與血管壁中的平滑肌功能障礙有關(guān)的進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)損傷。慢性IH可通過(guò)氧化應(yīng)激、一氧化氮利用不足、全身炎性反應(yīng)、交感神經(jīng)過(guò)度激活和內(nèi)皮修復(fù)能力降低等途徑導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙能，進(jìn)而增加高血壓等心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),可能是引起間歇性小鼠心肌肥大的機(jī)制之一。本研究顯示，IH小鼠胸主動(dòng)脈對(duì)ACh引起的內(nèi)皮依賴性舒張功能下降，而對(duì)SNP引起的非內(nèi)皮依賴性舒張功能正常，提示血管內(nèi)皮功能受損可能是IH引起心血管疾病的重要原因之一，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。