季維雪,孫 磊, 江 玉, 陳 潁, 李澤蓮, 李 敏, 肖 蘭

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽醫(yī)院婦產(chǎn)科，阜陽 2361122安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 230022

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見三大惡性腫瘤之一，病死率居首位，化療耐藥是導(dǎo)致卵巢癌療效不佳的重要因素之一[1]。越來越多研究[2]顯示卵巢癌發(fā)生、發(fā)展及耐藥與表觀遺傳學(xué)改變密切相關(guān)。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾等，其中DNA甲基化異常在卵巢癌耐藥形成中起著重要作用。文獻(xiàn)[3]報道，通過DNA甲基化抑制劑逆轉(zhuǎn) DNA甲基化狀態(tài)，為靶向治療卵巢癌提供了一個新的靶點。酒精脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)是一種多態(tài)性酶，乙醇脫氫酶1B (alcohol dehydrogenase 1B, ADH1B)也稱為ADH2，目前ADH1B與癌癥的聯(lián)系主要集中在酒精代謝和飲酒行為等方面[4]。新近研究[5]表明甲基化下調(diào)的ADH2與乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)，人腫瘤細(xì)胞中ADH2基因亦受表觀遺傳機(jī)制調(diào)控，提示ADH2基因有望成為潛在腫瘤個體化治療靶點。該研究擬體外觀察5-Aza-dc對卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，旨在探討ADH1B基因甲基化與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑細(xì)胞株：卵巢癌細(xì)胞C13K及OV2008為本室保存；組織樣本選取2019年1月—2021年5月就診于醫(yī)院婦產(chǎn)科且均經(jīng)病理學(xué)診斷卵巢癌患者55例，F(xiàn)IGO分期：Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期37例。同期因子宮肌瘤需手術(shù)患者21例(留取正常卵巢上皮)。卵巢癌組患者的平均年齡(50.4±9.6)歲，對照組平均年齡(44.6±7.3)歲。排除自身免疫病及其他系統(tǒng)腫瘤，術(shù)前均未接受新輔助化療、免疫及靶向治療，經(jīng)手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本均在30 min內(nèi)。研究對象均簽署知情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會審查。DNA純化試劑盒購自德國Qiagen公司；去甲基化制劑5-Aza-dc購自美國Sigma公司；PRMI Medium 1640培養(yǎng)基、小牛血清均購自美國Gibco公司；ADH1B兔多克隆抗體購自英國Abcam公司；Hoechst 33258染色液購自上海碧云天公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green Master Mix購自日本TaKaRa公司；CCK-8檢測試劑盒購自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析ADH1B在卵巢癌的表達(dá)，數(shù)據(jù)來源于癌癥和腫瘤基因圖譜(cancer genome atlas，TCGA)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)分組 C13K和OV2008細(xì)胞于含15%小牛血清1640培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)(70～80)%時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。5-Aza-dc設(shè)低、中及高3個濃度組，分別為0.5、2.5及10 μmol/L，分別干預(yù)48 h。

1.2.3去甲基化藥物對卵巢癌細(xì)胞毒性作用 各組細(xì)胞按1×104細(xì)胞/孔濃度種至96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞增殖：5-Aza-dc (0.5、2.5及10 μmol/L)干預(yù)48 h，加10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，450 nm波長處各孔吸光度值。實驗均重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4Hoechst33258染色法觀察細(xì)胞形態(tài)變化 兩株細(xì)胞以2×105細(xì)胞/孔濃度接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后加高濃度5-Aza-dc(10 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PBS洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌細(xì)胞2次，Hoechst 33258(5 mg /L)在室溫下染色10 min后棄去染色液，PBS洗2遍，熒光顯微鏡下觀察，拍照。正常細(xì)胞核Hoechst著色形態(tài)呈圓形，淡藍(lán)色；凋亡細(xì)胞核濃集固縮而呈亮藍(lán)色。

1.2.5甲基化特異性PCR (methylation specific PCR, MSP) 采用DNA甲基化修飾試劑盒對基因組DNA進(jìn)行甲基化修飾，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性12 min；94 ℃變性30 s，退火溫度58 ℃，72 ℃延伸45 s，45個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析。ADH1B MSP甲基化引物序列F：5′-CCAGGGATTAGGAGTGGACC-3′，R： 5′-GGAGGGGAAGAGCAGTTGTC-3′; 未甲基化引物序列， UF: 5′-CAGTGTGGAAAATGCAGAG-3′； UR：5′-GTGACCTTGGCAACGTTA-3′。MSP結(jié)果判定：僅擴(kuò)增出甲基化條帶者為完全甲基化；同時出現(xiàn)甲基化條帶和非甲基化條帶者為部分甲基化; 僅出現(xiàn)非甲基化條帶者為未甲基化。

1.2.6qRT-PCR檢測ADH1BmRNA水平 收集組織標(biāo)本及5-Aza-dc(0.5、10 μmol/L)作用兩組細(xì)胞，將組織樣本置液氮中研磨成勻漿，TRIzol法提取組織和細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物序列，ADH1B,F： 5′-GTGGCACAAGCGTCATCGTAGG-3′，R： 5′-TTCCAGGTGCGTCCAGTCAGTAG-3′；β-actin,F： 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，R： 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。2-△△Ct法計算各組細(xì)胞中ADH1B基因mRNA相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3次。

1.2.7免疫印跡檢測ADH1B蛋白水平 30 μg蛋白質(zhì)樣品行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上；5% BSA室溫封閉2 h，0.05% Tween20的TBS緩沖液(TBST)漂洗，10 min×3次；加入ADH1B(1 ∶1 000)一抗，b-actin一抗(1 ∶5 000)，4 ℃過夜，1×TBST漂洗3遍，對應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1 ∶5 000)，37 ℃搖床溫育2 h，ECL顯色曝光，采集照片。

2 結(jié)果

2.1 ADH1B在卵巢癌中表達(dá)被抑制為明確ADH1B在OC中表達(dá)情況，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)中ADH1B在426例OC患者樣本和88例正常樣本表達(dá)的差異結(jié)果顯示，ADH1B在腫瘤樣本中比正常樣本低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) , 見圖1。

2.2 組織及兩株細(xì)胞中ADH1B基因表達(dá)qRT-PCR證實，正常卵巢上皮組織中ADH1B表達(dá)水平為(6.72±1.41)，高于卵巢癌組織(1.15±0.67)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-5.742,P<0.01)；OV2008細(xì)胞ADH1B基因表達(dá)為C13K細(xì)胞5.82倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-7.313,P<0.01)。

圖1 ADH1B 在卵巢癌及正常卵巢上皮組織中相對表達(dá)量

2.3 5-Aza-dc對細(xì)胞存活率比較低濃度5-Aza-dc(0.5 μmol/L)對兩株卵巢癌細(xì)胞生長無明顯抑制作用(P>0.05)；中濃度5-Aza-dc(2.5 μmol/L)對兩株卵巢癌細(xì)胞生長有一定抑制作用(t=9.234,P<0.01；t=15.416,P<0.01)，當(dāng)5-Aza-dc增至高濃度10μmol/L時，兩株細(xì)胞生長抑制差異顯著(F=40.082,P<0.001；F=80.384,P<0.001)(表1)。

表1 各組細(xì)胞存活率比較

2.4 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的變化熒光顯微鏡下，經(jīng)高濃度5-Aza-dc(10 μmol/L)作用48 h后，OV2008及C13K細(xì)胞均出現(xiàn)典型細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為核染色質(zhì)濃縮、碎裂，而未加藥兩株對照細(xì)胞核均呈均勻藍(lán)色熒光，見圖2。

圖2 兩株細(xì)胞細(xì)胞凋亡Hoechst 33258熒光染色 ×200

2.5 5-Aza-dC對ADH1B啟動子甲基化影響結(jié)果顯示：ADH1B基因啟動子區(qū)在OV2008及SKOV3細(xì)胞株中呈完全甲基化；高濃度5-Aza-dC (10 μmol/L)處理48 h后，可見ADH1B基因啟動子區(qū)出現(xiàn)U帶，M帶未完全消失，提示ADH1B啟動子區(qū)甲基化被部分逆轉(zhuǎn)，見圖3。

圖3 5-Aza-dC處理前后兩株細(xì)胞ADH1B基因啟動子甲基化

2.6 5-Aza-dC對ADH1B mRNA表達(dá)影響OV2008細(xì)胞中ADH1B mRNA表達(dá)高于C13K細(xì)胞；5-Aza-dC(0.5、10 μmol/L)作用48 h后，OV2008及C13K細(xì)胞ADH1B mRNA均有所升高，尤以高濃度5-Aza-dC(10 μmol/L)處理后OV2008及C13K細(xì)胞ADH1B mRNA升高差異顯著(F=8.093，P<0.01；F=21.928,P<0.01)，圖4。

圖4 細(xì)胞中ADH1B mRNA表達(dá)水平比較

2.7 免疫印跡檢測ADH1B蛋白水平結(jié)果顯示，無5-Aza-dC作用，OV2008及C13K細(xì)胞中ADH1B蛋白呈較低表達(dá)狀態(tài)，且C13K中表達(dá)較之OV2008更低；低濃度5-Aza-dC(0.5 μmol/L)未引起OV2008及C13K細(xì)胞中ADH1B蛋白改變，而高濃度5-Aza-dC(10 μmol/L)使OV2008及C13K細(xì)胞中ADH1B蛋白均表達(dá)增加，見圖5A。ADH1B/b-actin對蛋白圖像掃描半定量統(tǒng)計結(jié)果表明，低濃度5-Aza-dC(0.5μmol/L)處理后，兩株細(xì)胞ADH1B蛋白表達(dá)無明顯改變(P>0.05)；高濃度5-Aza-dC (10 μmol/L)處理使ADH1B蛋白表達(dá)較兩株對照組及低濃度組升高，差異有顯著性(F=12.059,P<0.01;F=30.384,P<0.01)，見圖5B。

圖5 各組細(xì)胞ADH1B蛋白表達(dá)

3 討論

ADH1B基因編碼 I 類ADH的β亞基，定位于染色體4q23。Gharpure et al[6]發(fā)現(xiàn)ADH1B異常表達(dá)使卵巢癌細(xì)胞分泌金屬基質(zhì)蛋白酶7、白細(xì)胞分化抗原26和組織蛋白酶從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。ADH1B在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，鼻咽癌細(xì)胞過表達(dá)ADH1B后可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的惡性程度[7]。另有研究[8]指出ADH1B可能為卵巢癌細(xì)胞化療耐藥的候選基因之一。本研究qRT-PCR結(jié)果及卵巢癌TCGA數(shù)據(jù)分析均提示ADH1B在OC患者樣本中低表達(dá)，據(jù)此課題組推測ADH1B基因可能作為抑癌基因參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，但其具體調(diào)控機(jī)制目前尚未明確，有必要進(jìn)行深入探討。

腫瘤細(xì)胞DNA異常甲基化是一種常見表觀遺傳學(xué)改變，這種異常修飾可抑制基因轉(zhuǎn)錄，使抑癌基因喪失功能[9-10]?；騿幼訁^(qū)DNA甲基化是導(dǎo)致基因失活的重要原因之一，而基因啟動子甲基化的潛在可逆性為新型抗癌藥物的開發(fā)提供了機(jī)會，這些藥物可重新激活沉默的腫瘤抑制基因[11]。以5-Aza-dc為代表的類核苷甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，通過與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價結(jié)合抑制其活性，降低基因甲基化水平，已廣泛應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的異常甲基化，誘導(dǎo)因甲基化而沉默的抑癌基因重新表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生長，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)[12-13]。為探討ADH1B基因甲基化與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本研究將 5-Aza-dC作用于兩株卵巢癌細(xì)胞株，通過CCK-8 法檢測5-Aza-dc對人卵巢癌細(xì)胞生長的影響，結(jié)果表明，5-Aza-dc對兩株卵巢癌細(xì)胞增殖均有抑制作用，且該作用與 5-Aza-dc濃度呈正相關(guān)；同時，Hoechst 33258熒光染色結(jié)果顯示，高濃度5-Aza-dc處理后，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮或碎裂，出現(xiàn)典型細(xì)胞凋亡形態(tài)，表明5-Aza-dc誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡；RT-PCR結(jié)果顯示，ADH1B mRNA表達(dá)與啟動子區(qū)甲基化程度密切相關(guān)，在完全甲基化兩株卵巢癌細(xì)胞中，ADH1B mRNA表達(dá)較低，而5-Aza-dC作用48 h后，兩株細(xì)胞ADH1B甲基化均被部分逆轉(zhuǎn)，ADH1B在mRNA和蛋白水平表達(dá)均顯著提高，該結(jié)果提示5-Aza-dC可能通過沉默DNA甲基轉(zhuǎn)移酶而降低抑癌基因ADH1B 啟動子區(qū)域的甲基化水平誘導(dǎo)其重新表達(dá)。

綜上所述，ADH1B基因甲基化在OC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，5-Aza-dc可部分逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞啟動子區(qū)ADH1B甲基化，誘導(dǎo)ADH1B基因重新表達(dá)，抑制腫瘤生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。本研究也為將5-Aza-dc應(yīng)用于卵巢癌臨床治療提供一定的理論依據(jù)。