劉 蕓，徐 恰，劉力偉，戚 楠，秦宜德，

作者單位：安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院1生物化學與分子生物學教研室、2免疫教研室，合肥 230032

宮頸癌是全世界婦女最常見的癌癥之一[1]，其存活率低，預后不佳[2]?；熀头暖煶Ｒ姷氖菍m頸癌治療方案。順鉑是常用的化療藥物，目前針對該藥物的主要研究目標是不斷提高藥效以降低該藥物的副作用及降低機體產(chǎn)生的耐藥[3]。p62是一種自噬受體，近期被證明[4]可以將泛素化蛋白質(zhì)遞送到蛋白酶體進行降解。p62增加會延遲泛素化蛋白向泛素蛋白酶體系統(tǒng)的降解，而p62缺失會加劇細胞損傷。乳鐵蛋白活性源六肽(LfcinB 4-9)來自于牛乳鐵蛋白的乳鐵蛋白抗菌肽(bovine lactoferricin，LfcinB)，是其活性中心，序列為RRWQWR，其中3個Arg殘基(帶有正電荷)通過腫瘤細胞外膜負電荷吸引而結(jié)合，通過翻轉(zhuǎn)擴散(flip-flop)進入胞內(nèi)。該文主要研究LfcinB 4-9增加藥物敏感性的作用，探索LfcinB 4-9與DDP聯(lián)合作用在宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮的作用，以期為宮頸癌治療提供潛在的治療方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑本實驗使用的Hela細胞、p62 KO Hela細胞由許尹教授(美國貝勒醫(yī)學院)饋贈。LfcinB 4-9由上海生工公司合成; 順鉑購自云南植物藥業(yè)有限公司；MTT購自美國Promega公司；TRIzol購自美國Thermo Fisher公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；PCR引物由上海生工合成；PCR MIX購自美國Promega；胎牛血清購自杭州四季青公司； Annexin V/PI雙染凋亡試劑盒購自上海貝博公司。β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標記抗兔IgG購自北京中杉金橋有限公司；SIAH抗體購自愛博泰克生物技術(shù)公司；PSMA、β-catenin抗體購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人宮頸癌細胞Hela和Hela/KO p62使用含有10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細胞增殖實驗 分別取對數(shù)生長期的HeLa細胞和p62 KO HeLa細胞以5.0×103/孔的密度接種到96孔板中，用不同濃度的 LfcinB 4-9(0.15、1.5、15 μmol/L)和 DDP(IC50)刺激24、48和72 h后，每孔加入20 μl MTT置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。 棄去上清液，每孔加200 μl DMSO。用酶標儀(Bio-Rad)在490 nm波長處測量吸光度(optical density, OD)值，以空白為對照，按照計算公式細胞存活率(%) ，計算公式如下如下：抑制率(Ⅰ)(%)=1-(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)，計算化療藥物的抑制率和半抑制濃度(IC50)并建立細胞生長抑制曲線。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡 將1×106個細胞接種于6孔板中培養(yǎng)過夜。分為6組加藥：正常對照組、15 μmol/L LfcinB 4-9組、 DDP(IC50)組、DDP(IC50)+0.15 μmol/L LfcinB 4-9組、DDP(IC50)+1.5 μmol/L LfcinB 4-9組、DDP(IC50)+15 μmol/L LfcinB 4-9組。作用48 h后，用不含EDTA的胰酶消化后收集細胞，用冷PBS洗滌細胞2次。將細胞重懸于400 μl 1×Annexin結(jié)合液中，在細胞懸液中加入5 μl膜聯(lián)蛋白 V-異硫氰酸熒光素(FITC)，輕輕搖勻后于4°C避光條件下孵育15 min，加入10 μl PI染色液后輕輕混勻并于4 ℃避光條件下孵育5 min。在2 h內(nèi)用流式細胞儀檢測，并用FlowJo7.6.1軟件分析實驗結(jié)果。

1.2.4平板克隆檢測細胞克隆形成 將Hela細胞(1×103) 和Hela/KO p62細胞(1×103)分別接種在6孔板中，按照上述分組加藥，每2 d更換1次新鮮培養(yǎng)基，在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周。 棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細胞并用0.1%結(jié)晶紫染色30 min。 拍攝圖像，并計算每個孔中的克隆數(shù)。細胞克隆抑制率(%)=1-(加藥組形成的克隆數(shù)/空白對照組形成的克隆數(shù))。

1.2.5RT-qPCR檢測E3泛素連接酶(seven in absentia homologue，SIAH)、蛋白酶體(蛋白酶體，巨蛋白因子)亞基-α型[proteasome(prosome-macropain) subunit alpha type，PSMA]、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的mRNA表達情況 通過RT-qPCR定量檢測相關(guān)基因表達的mRNA。使用 TRIzol 試劑從宮頸癌細胞中提取總 RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補 DNA(cDNA)。 按照試劑盒說明配置10 μl體系后上機。使用 qPCR 測定法(SYBR Green；Bio-Rad，USA)測定蛋白 mRNA 的表達； β-actin用作內(nèi)部對照。qPCR條件如下：預變異95 ℃ 1 min，擴增95 ℃、20 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40個循環(huán)，溶解95 ℃、10 s，65 ℃、60 s，97 ℃、1 s，冷卻37 ℃、30 s。使用2-ΔΔCt方法計算相對mRNA表達。見表1。

1.2.6Western blot檢測SIAH、PSMA、β-catenin的蛋白的表達情況 將宮頸癌細胞分為6組加藥：對照組、1.5 μmol/L LfcinB 4-9組、DDP(IC50)組、DDP(IC50)+0.15 μmol/L LfcinB 4-9組、DDP(IC50)+1.5 μmol/L LfcinB 4-9組、DDP(IC50)+15 μmol/L LfcinB 4-9組。培養(yǎng)48 h后收集細胞總蛋白，經(jīng)電泳、電轉(zhuǎn)、孵育一抗、二抗，洗滌后顯影并用Image J進行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 對Hela/KO p62內(nèi)p62蛋白表達的檢測通過Western blot檢測敲除株p62蛋白的表達，結(jié)果表明敲除株內(nèi)p62蛋白不表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 Western blot檢測敲除株p62蛋白表達

2.2 聯(lián)合用藥對宮頸癌細胞的增殖的影響為了研究 LfcinB 4-9與DDP聯(lián)合用藥對宮頸癌細胞的影響，Hela和p62 KO Hela細胞系用不同濃度的LfcinB 4-9和相同濃度的DDP處理 24～72 h，并評估細胞增殖。結(jié)果顯示單獨用LfcinB 4-9細胞生長抑制率較小，當DDP和LfcinB 4-9聯(lián)合作用時，細胞的生長抑制率增高，并且隨著LfcinB 4-9的度的增高而逐漸增高，差異有統(tǒng)計學意義(F=56.72,P<0.01；24 h：21.3±1.06；48 h：28.5±1.13；72 h：30.5±0.98)。見圖2。

2.3 聯(lián)合用藥對宮頸癌細胞克隆形成的影響通過克隆形成實驗觀察聯(lián)合用藥對宮頸癌細胞增殖的抑制。結(jié)果表明，與對照組相比，加藥組細胞克隆形成顯著降低，并且LfcinB 4-9與DDP聯(lián)合作用效果更強，克隆形成能力隨著Lfcin B 4-9的濃度的增加而逐漸降低。與Hela對比，p62敲除抑制了宮頸癌細胞的增殖，集落數(shù)少于HeLa組，差異有統(tǒng)計學意義(F=72.5,P<0.01)。見圖3。

2.4 聯(lián)合用藥對宮頸癌細胞凋亡的影響為了研究 LfcinB 4-9 是否可以調(diào)節(jié) Hela和p62 KO Hela 細胞對 DDP 的抗性，分別用不同濃度的LfcinB 4-9和相同濃度的DDP作用于這兩種細胞。 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組對比，加藥組的凋亡率增加。單獨用LfcinB 4-9或者DDP，細胞凋亡率略有增加。當聯(lián)合用藥時，細胞凋亡率增加，并且細胞凋亡率隨著LfcinB 4-9濃度的增高而逐漸增高，差異有統(tǒng)計學意義(F=120.5，P<0.01)。與Hela組對比，聯(lián)合用藥對Hela/KO p62組促進細胞凋亡作用更強。這些結(jié)果表明聯(lián)合用藥促進宮頸癌細胞的凋亡，LfcinB 4-9可以通過促進體外 DDP 誘導的細胞凋亡調(diào)節(jié)宮頸癌細胞對 DDP的抵抗力。見圖4。

2.5 LfcinB 4-9聯(lián)合DDP處理對人宮頸癌細胞的PSMA、SIAH、β-catenin基因表達的影響qRT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比，單獨用LfcinB 4-9處理的Hela和Hela/KO p62細胞中PSMA、SIAH、β-catenin表達水平無明顯變化。與LfcinB 4-9組相比，聯(lián)合用藥組的PSMA、SIAH基因表達量增加，且隨著LfcinB 4-9濃度的增加表達水平逐漸增加，而聯(lián)合用藥組β-catenin的表達水平降低，隨著LfcinB 4-9濃度的增加表達水平有不同程度的降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與Hela細胞相比，相同加藥組Hela/KO p62細胞中PSMA、SIAH表達水平有不同程度的下降，β-catenin表達水平變化差異無統(tǒng)計學意義。見圖5。

2.6 LfcinB 4-9聯(lián)合DDP處理對人宮頸癌細胞的PSMA、SIAH、β-catenin蛋白表達的影響用LfcinB 4-9(1.5 μmol/L)、DDP(48 h IC50)、DDP(48 h IC50)+LfcinB 4-9(0.15 μmol/L)、DDP(48 h IC50)+LfcinB 4-9(1.5 μmol/L)、DDP(48 h IC50)+ LfcinB 4-9(15 μmol/L)共5種不同濃度藥物作用于Hela和Hela/KO p62 48 h后， Western blot結(jié)果顯示，單獨用LfcinB 4-9組SIAH、PSMA、β-catenin蛋白表達水平無明顯變化， 聯(lián)合用藥時，SIAH、PSMA蛋白表達量上升，隨著聯(lián)合作用時用LfcinB 4-9濃度的增高，表達量有不同程度的上升。與對照組相比，聯(lián)合用藥時隨著藥物濃度的增加，β-catenin的蛋白表達量有不同程度的下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。聯(lián)合用藥和單獨DDP組相比，隨著LfcinB 4-9濃度的増高，SIAH、PSMA蛋白表達水平有不同程度的上升，β-catenin蛋白表達水平有不同程度的下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖6。

圖2 MTT檢測聯(lián)合用藥對2種細胞增殖能力的影響

圖3 平板克隆實驗檢測聯(lián)合用藥對人宮頸癌細胞細胞克隆形成能力的影響

圖4 不同濃度藥物對Hela、Hela/KO p62凋亡的影響

圖5 不同濃度藥物對Hela、Hela/KO p62細胞相關(guān)基因mRNA的影響

圖6 Western blot檢測各組SIAH、PSMA、β-catenin蛋白表達

3 討論

宮頸癌是婦科可致死的惡性腫瘤，DDP已被用作治療這種癌癥最有效的放化療藥物之一。然而，現(xiàn)已在宮頸癌細胞中發(fā)現(xiàn)了治療耐藥性，尤其是在轉(zhuǎn)移性、復發(fā)性和晚期疾病的患者中[5]。由于順鉑的耐藥性，許多天然產(chǎn)物被用于研究抗癌藥物的開發(fā)[6]。源自牛、山羊、綿羊、水牛和駱駝奶的乳源活性肽肽具有多功能特性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、酶抑制作用、抗血栓形成和對抗各種毒物的拮抗活性。其中大部分調(diào)節(jié)免疫、胃腸道、激素和神經(jīng)反應，從而在預防癌癥、骨質(zhì)疏松癥、高血壓和其他疾病方面發(fā)揮重要作用[7]。LfcinB 4-9是一種來自牛乳鐵蛋白的生物活性肽，安全無毒。

泛素-蛋白酶體途徑 (UPP) 影響細胞功能，包括細胞生長、分化、凋亡、信號轉(zhuǎn)導、抗原加工和炎癥反應，現(xiàn)在已被認為是細胞蛋白質(zhì)降解最重要的方法之一。蛋白酶體控制蛋白質(zhì)降解的執(zhí)行并在泛素-蛋白酶體途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。蛋白酶體與癌癥之間密切聯(lián)系的展開為使用蛋白酶體抑制劑治療癌癥提供了潛在的策略[8]。抑制蛋白酶體系統(tǒng)可能代表一種治療和克服耐藥性惡性腫瘤耐藥性的新策略。泛素-蛋白酶體系統(tǒng) (UPS) 和自噬是兩個不同且相互作用的蛋白水解系統(tǒng)。它們在正常條件下和壓力下的細胞存活中起著關(guān)鍵作用。p62 是一種經(jīng)典的自噬受體，是一種多功能蛋白質(zhì)，位于整個細胞中，參與許多信號轉(zhuǎn)導通路。它參與泛素化蛋白質(zhì)的蛋白酶體降解。當細胞 p62 水平波動時，泛素化蛋白質(zhì)的數(shù)量和位置也會發(fā)生變化，對細胞存活產(chǎn)生相當大的影響。抑制蛋白酶體所導致的應激可以通過 p62 磷酸化激活自噬。自噬缺陷可能會損害泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，因為盡管蛋白酶體催化活性沒有改變，但過多的 p62 會延遲蛋白酶體底物向蛋白酶體的遞送[8]。

β-catenin是一種多功能蛋白質(zhì)，在生理穩(wěn)態(tài)中起核心作用[9]。β-catenin的高水平細胞質(zhì)表達和核定位總是誘導致瘤性狀并促進癌細胞增殖和存活。此外，它還可以通過抑制T細胞反應促進腫瘤的進展[10]。β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定在腫瘤發(fā)生中至關(guān)重要，這通常是由異常 Wnt 激活和β-連環(huán)蛋白的體細胞基因突變或破壞復合物組分誘導的[11]。β-catenin的泛素化是一個復雜的過程，磷酸化的β-catenin 被特定的E3泛素連接酶識別和泛素化，并在蛋白酶體中降解。相應的E3泛素連接酶在不同的亞細胞位置是不同的。在細胞質(zhì)中，β-TrCP、Jade1、SIAH是介導 β-連環(huán)蛋白泛素化的E3連接酶[12]。除了Jade1、SIAH也誘導非磷酸化 β-catenin 泛素化，以響應腫瘤抑制因子 p53 以促進 β-catenin 降解[9]。

本研究探究LfcinB 4-9與DDP聯(lián)合作用對宮頸癌細胞增殖與遷移的影響，顯示聯(lián)合用藥可以提高DDP在宮頸癌Hela和Hela/KO p62細胞中的藥物作用，且細胞凋亡率比單獨用LfcinB 4-9或DDP增長顯著。在控制DDP濃度相同的條件下，細胞凋亡率隨著LfcinB 4-9濃度的增加逐漸升高。同時，LfcinB與DDP聯(lián)合用藥抑制宮頸癌細胞的增殖和克隆形成。通過干擾p62基因表達，宮頸癌細胞耐藥性降低。此外，本研究還表明，聯(lián)合用藥使SIAH、PSMA1的表達量增加，而β-catenin的表達量降低，這表明LfcinB 4-9可能通過蛋白酶體途徑抑制宮頸癌的耐藥性，為宮頸癌治療提供了一種新的思路。