馮振游, 胡孔旺 , 丁慧明, 黃志國

作者單位：安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院普外科，合肥 230022

胃癌(gastric carcinoma，GC)是發(fā)病率最高的腫瘤之一。大多數(shù)胃癌患者確診時已經(jīng)處于中晚期。研究[1]表明，胃癌細胞中的上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)會促進細胞的增殖、遷移和侵襲。課題組前期試驗表明，全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)會提高胃癌患者的生存率。ATRA屬于維生素A的一種，其相對分子量大小為300.44。ATRA對于人體的生長發(fā)育以及細胞的分化起到了重要的作用。已經(jīng)有相關研究[2]證明，ATRA與受體RARRa/RXR 結合后，對胃癌細胞的增殖和凋亡等產(chǎn)生了一定的抑制作用。如ATRA與受體 RARα 結合后可誘導神經(jīng)母瘤細胞分化，與RARβ結合后則使其生長受到抑制[3]。ATRA在臨床中已經(jīng)被用作細胞誘導分化劑，對于多種腫瘤均存在治療效果。因此，該實驗探討了ATRA對胃癌術后患者預后的影響，以及ATRA參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料2001年5月—2012年12月在安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院普外科就診，并且病理組織學診斷為胃癌組織浸潤到黏膜下層以下的胃癌患者，外周血常規(guī)檢查、肝腎功能和血脂檢測指標均正常，美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern cooperative oncology group，ECOG)體力狀態(tài)評分4分以下。

1.2 治療方法按照均衡循序隨機的方法將入選胃癌患者于手術后分為對照組和ATRA組。其中對照組對患者進行靜脈輔助化療的方式，具體為患者采用FLP[5-Fu 400 mg/m2×5 d，DDP 60 mg/m2×1次，亞葉酸鈣每天200 mg/m2×5 d] 方案，3周為一個化療周期，共計6個療程。ATRA組患者為靜脈輔助化療+口服ATRA的方式，口服ATRA具體為手術后2 d開始服用ATRA，10 mg/次，3 次/d，共計6個月。上述研究方案經(jīng)安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，并獲得患者的知情同意。

1.3 隨訪通過當?shù)匦姓芾砣藛T、社區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生服務人員及患者或家屬電話聯(lián)系隨訪，了解患者是否生存或患者的死亡時間。隨訪截止到2020年10月，248例患者中198例獲得隨訪。其中ATRA組98例，對照組100例。

1.4 細胞株及主要試劑胃癌 MGC-803 細胞購自上海冠道生物科技有限公司；全反式維甲酸購自美國sigma公司；CCK-8試劑盒購自廣州濟恒醫(yī)藥科技有限公司；胰酶購自武漢金開瑞科技有限公司；胎牛血清購自上海江林生物科技有限公司；DMEM低糖培養(yǎng)基購自合肥欣樂生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，快速凝膠試劑盒購自武漢賽維爾科技有限公司；E-cadherin、N-cadherin和Vimentin一抗購自美國CST公司；GAPHD一抗和過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗購自合肥欣樂生物科技有限公司；細胞凋亡試劑盒和熒光二抗購自武漢賽維爾科技有限公司公司； Western-blot凝膠和板均購自康樂有限公司。熒光定量PCR儀器購自美國Thermo Scientific公司。ATRA購自山東良福制藥有限公司。亞葉酸鈣購自連云港伊特諾化工科技有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1細胞培養(yǎng)和藥物處理 胃癌 MGC-803 細胞使用DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)箱參數(shù)為37 ℃、5% CO2。胎牛血清的濃度為10%。細胞貼壁生長，每2 d進行細胞傳代。將培養(yǎng)好的胃癌 MGC-803 細胞分為對照組和ATRA組。ATRA組中用30 μmol/L ATRA溶液進行處理。對照組不進行ATRA溶液處理。

1.5.2CCK-8法檢測胃癌MGC-803細胞的增殖能力 取對數(shù)生長期的細胞，常規(guī)消化，將其接種到96孔板中，96孔板中每個孔中細胞懸液量為100 μl，細胞數(shù)為5 000個/孔，每組設置3次重復組。將96孔板放入細胞培養(yǎng)箱中，參數(shù)設置為37 ℃、5% CO2。待細胞貼壁生長后，更換不同濃度的ATRA培養(yǎng) (10、25、50、75和100 μmol/L)，同時設置對照組和DMSO組。ATRA溶液分別處理24 h和48 h后，加入CCK-8試劑，在酶標儀測量450 nm波長的吸光度。

1.5.3細胞劃痕愈合實驗檢測胃癌MGC-803細胞的遷移能力 當6孔板中胃癌 MGC-803 細胞的細胞密度為2×105個/孔時，此時加入不含有胎牛血清的培養(yǎng)基，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。用1 ml的槍頭全部沿著同一個方向進行直線劃線，之后每孔中的細胞使用PBS進行洗滌，加入含有1%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用相機拍攝顯微鏡中細胞遷移的照片。

1.5.4Transwell實驗檢測胃癌MGC-803細胞的侵襲能力 基底膜進行預冷處理，使用不含胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋?；啄し胖迷赥ranswell的板上室，將整個聚碳脂膜全部覆蓋。將其放入細胞培養(yǎng)箱中1 h待其形成穩(wěn)定的凝膠。在下面加入700 μl DMEM低糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清。在上室孔中加入無血清的細胞懸液，密度為2×105個/孔。分別設置對照組和ATRA組，培養(yǎng)36 h后，用甲醇溶液固定胃癌 MGC-803 細胞，加入0.1%的結晶紫染色液染色20 min，用PBS洗滌3次，放在顯微鏡下用相機拍照。

1.5.5流式細胞術檢測胃癌MGC-803細胞的凋亡水平 收集對照組和ATRA組細胞，用不含EDTA的胰酶消化收集，室溫下2 000 r/min離心5 min，用4 ℃的PBS重懸細胞，室溫下2 000 r/min離心5 min，棄上清液洗滌細胞。加入300 μl的1×Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μl的Annexin V-FITC混勻后，避免室溫孵育15 min，加入5 μl的PI染色，200 μl的1×Binding Buffer，進行細胞凋亡檢測。

1.5.6Western blot實驗檢測胃癌MGC-803細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達水平 收集對照組和ATRA組細胞，使用RIPA裂解液將細胞裂解，離心機參數(shù)設置為12 000 r/min，離心時間15 min。收集胃癌 MGC-803 細胞的上清液存儲于1 ml離心管中。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白樣品20 μg加入上樣緩沖液(5×)100 ℃加熱10 min。將制得的樣品分別加入8% SDS-PAGE和12% SDS-PAGE凝膠中。電泳條件為電壓120V，電泳時間30 min。當溴酚藍到達凝膠底部時停止電泳，使用濕轉法進行轉膜。將蛋白質轉移到PVDF膜上后，使用BSA溶液在室溫的條件下進行封閉1 h。分別加入一抗E-cadherin(1 ∶2 000)、N-cadherin(1 ∶2 000)、Vimentin(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶1 000)，在4 ℃冰箱中孵育12 h。使用TBST溶液洗滌3次，每次洗滌10 min。使用辣根過氧化物酶標記的山羊兔抗體IgG(1 ∶5 000)在室溫的條件下進行孵育1 h。使用TBST溶液洗滌3次，每次洗滌10 min。加入顯色液后使用BIO RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察不同分組的蛋白灰度值，使用Image J 軟件分析蛋白的相對表達量。

1.5.7RT-qPCR法檢測胃癌MGC-803細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的mRNA表達水平 選擇生長密度達到80%～90%之間的胃癌 MGC-803 細胞，丟棄培養(yǎng)基后使用PBS溶液洗滌2～3次。每個培養(yǎng)皿中加入1 ml TRIzol試劑，冰上靜止10 min后使用200 μl移液槍進行吹打。將裂解液全部轉移至2 ml的EP管中。TaKaRa試劑盒反轉錄RNA為cDNA。將1μg總RNA反轉錄為cDNA 后用IDTE緩沖液( pH = 8.0，Integrated DNA Technologies，美國)稀釋至10 ng /μl。qPCR反應體系；25 μl SYBR Premix Ex TaqⅡ，20 ng cDNA和上下游引物共40 μmol/L, dd H2O補充至50 μl。依據(jù)RT-qPCR說明書進行檢測，反應條件為: 95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 45s，70 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。實驗重復3次。各基因引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列

1.5.8免疫熒光檢測胃癌MGC-803細胞標記蛋白N-cadherin，E-cadherin和Vimentin的表達 將處理后的胃癌細胞以1×104個/皿接種于共聚焦小皿中，培養(yǎng)24 h。將FBS進行更換，使用PBS溶液將細胞培養(yǎng)基洗去，同時使用多聚甲醛將細胞固定30 min，用PBS緩沖液輕輕晃洗4次后吹干，使用1%的曲通進行細胞膜的裂解，使用PBS緩沖液洗去曲通，100 mmol甘氨酸進行封閉，再使用PBS緩沖液進行清洗，每次10 min共3次。5% BSA封閉1 h后加入N-cadherin，E-cadherin和Vimentin一抗，4 ℃孵育過夜，使用TBST緩沖液進行清洗，每次10 min共3次，室溫避光孵育熒光二抗1 h，使用TBST緩沖液進行清洗，每次10 min共3次。加入細胞核染液DAPI室溫孵育10 min，使用TBST緩沖液進行清洗，每次10 min共3次，用超純水清洗2次，加入適量的抗淬滅劑，于正置熒光顯微鏡下分析樣本并拍照記錄。

2 結果

2.1 基線數(shù)據(jù)兩組性別、TNM分期、分化程度和手術方式等差異無統(tǒng)計學意義，具體見表2。

2.2 ATRA治療延長胃癌患者的生存時間對198例GC患者進行術后隨訪， Kaplan-Meier的生存分析結果顯示，ATRA組的GC患者生存期高于對照組的GC患者(P<0.01),差異有統(tǒng)計學意義。見圖1。

2.3 ATRA抑制胃癌 MGC-803細胞的增殖能力不同濃度的ATRA溶液處理胃癌MGC-80細胞24、48 h后，CCK-8法進行檢測結果顯示：與對照組相比， ATRA處理的胃癌MGC-803細胞增殖能力降低(P<0.01)，且隨著濃度的增大增殖能力不斷下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

表2 兩組基線數(shù)據(jù)(n)

圖1 Kaplan-Meier分析兩組胃癌術后患者的生存時間

圖2 不同濃度的ATRA對胃癌MGC-803細胞增殖的影響

2.4 ATRA抑制胃癌MGC-803細胞的遷移能力30 μmol/L ATRA溶液處理胃癌 MGC-803 細胞 24、48 h后，與對照組比較，細胞劃痕愈合實驗結果表明，ATRA組的胃癌 MGC-803 細胞遷移率下降(F=41.718，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 細胞劃痕實驗檢測ATRA抑制胃癌MGC-803細胞遷移能力 ×200

2.5 ATRA抑制胃癌MGC-803細胞的侵襲能力ATRA組中加入30 μmol/L ATRA溶液，培養(yǎng)36 h后與對照組相比，Transwell實驗結果表明，ATRA組的胃癌 MGC-803 細胞侵襲細胞數(shù)量小于對照組(F=36.098，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖4。

2.6 ATRA誘導胃癌MGC-803細胞的凋亡ATRA組30 μmol/L ATRA溶液作用24 h和48 h后，與對照組相比， ATRA處理后的胃癌 MGC-803 細胞凋亡率升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖5。

2.7 ATRA上調(diào)E-cadherin，下調(diào)N-cadherin及Vimentin蛋白表達水平ATRA組30 μmol/L ATRA溶液處理細胞24、48 h后，Western blot實驗檢測結果顯示，與對照組相比，ATRA組的胃癌 MGC-803 細胞中E-cadherin表達水平上升(F=118.022，P<0.01)，且隨著時間的增加表達水平上升。N-cadherin(F=149，P<0.01)和Vimentin(F=180，P<0.01)表達水平下降，且隨著時間的增加表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義。見圖6。

圖4 Transwell實驗檢測ATRA抑制胃癌MGC-803

2.8 ATRA上調(diào)E-cadherin，下調(diào)N-cadherin及Vimentin mRNA表達水平和對照組相比，ATRA組經(jīng)過 30 μmol/L ATRA溶液處理24、48 h后。E-cadherin mRNA表達水平上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Vimentin、N-cadherin mRNA表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 見表3。

表3 ATRA上調(diào)E-cadherin，下調(diào)N-cadherin及Vimentin mRNA表達水平

2.9 ATRA增強E-cadherin熒光強度，降低Vimentin 和N-cadherin熒光強度ATRA組30 μmol/L ATRA溶液作用24 h和48 h后，和對照組相比，免疫結果表明，ATRA增強E-cadherin熒光強度，降低N-cadherin、Vimentin熒光強度(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖7。

圖5 流式細胞術實驗檢測ATRA促進胃癌 MGC-803 細胞凋亡

圖6 Western blot實驗檢測ATRA對EMT相關蛋白表達水平的影響

圖7 ATRA影響E-cadherin，Vimentin 和N-cadherin的熒光強度 ×200

3 討論

在目前已知的腫瘤中，GC是發(fā)病率較高的一種，且發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢。根據(jù)報道[4]，我國2019年GC患者數(shù)量就已經(jīng)超過了110萬例。由于國內(nèi)的飲食習慣存在一定的差異，導致GC發(fā)病率是其他國家的兩倍以上[5]。目前對于GC的治療主要有藥物，手術化療等方式。術后GC患者的預后較差，5年的生存率僅為35%[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)治療中加入ATRA可改善胃異型增生患者的預后。Rb蛋白的定量可以作為腫瘤轉陰的標記物，經(jīng)過ATRA處理后的樣本顯示Rb水平升高，這可能有助于抑制胃異型增生。

實驗證明，ATRA可以通過抑制GC細胞的上皮間質轉化作用，從而抑制GC細胞的增殖、遷移、侵襲等。EMT是大多數(shù)腫瘤細胞在進行分化時所存在的一種過程。因此EMT對于腫瘤細胞的侵襲和轉移過程存在顯著的作用。研究EMT顯示，此過程中出現(xiàn)較多的標志性蛋白表達量的改變，例如E-cadherin表達下降， N-cadherin和Vimentin表達增高等。如果抑制此過程，相關蛋白的表達量會呈現(xiàn)相反的趨勢。探究ATRA對GC細胞EMT的影響中顯示，ATRA組的E-cadherin蛋白表達量增多，N-cadherin和Vimentin蛋白表達量下降，這和預期結果一致。EMT過程中，腫瘤細胞的黏附性降低，同時伴有大量細胞因子分泌，從而發(fā)生侵襲和轉移的現(xiàn)象。已經(jīng)有相關實驗[8]表明，EMT對于腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲過程具有增強作用。且研究[9]發(fā)現(xiàn)，GC細胞中已經(jīng)明確存在EMT。ATRA屬于維生素A的中間代謝產(chǎn)物，是一種新型的細胞誘導分化劑，對腫瘤細胞有著明顯的抑制效果。ATRA可以抑制多種腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲，在臨床中應用較為廣泛。在宮頸癌、甲狀腺癌患者的治療中，口服ATRA的治療作用和預防效果較為顯著[10]。前期研究[11]已經(jīng)證明，ATRA治療GC具有一定的療效，且在一些腫瘤細胞株中ATRA可以增強順鉑的治療作用[12]。ATRA聯(lián)合5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu) 或順鉑腹腔灌注治療GC有較好的臨床療效。

本研究中以198例GC患者為研究對象，結果表明，ATRA治療的GC術后患者生存期大于未進行ATRA治療的患者。因此ATRA聯(lián)合化療治療的方式可以延長患者的生存時間。ATRA可以抑制GC MGC-803 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進GC細胞的凋亡。經(jīng)過ATRA處理后，EMT相關基因(N-cadherin、Vimentin)表達水平下降，E-cadherin表達水平上升。