陶 龍，劉 銳，徐家雯，張 闊，姚余有

作者單位:安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院1衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系、2人口健康與優(yōu)生安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

抑郁癥作為一種全球性的精神疾病，其特點(diǎn)是消極和動(dòng)機(jī)減少，嚴(yán)重危害人們的身心健康[1]，是全球總體疾病負(fù)擔(dān)的主要原因[2]。目前，抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，有研究[3]顯示暴露于慢性應(yīng)激事件可以增加人類(lèi)患抑郁癥的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，動(dòng)物研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，孕鼠在懷孕期間遭受慢性應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)其后代出現(xiàn)抑郁樣行為, 且雄性子代更易出現(xiàn)。當(dāng)今社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)激烈，孕婦和其子代都有可能暴露于慢性應(yīng)激環(huán)境中，但很少有研究關(guān)注慢性子代應(yīng)激對(duì)妊娠期慢性應(yīng)激的子代抑郁有何影響。因此，該文擬通過(guò)觀察妊娠期慢性應(yīng)激和慢性子代應(yīng)激聯(lián)合作用對(duì)子鼠抑郁樣行為的影響，研究慢性子代應(yīng)激對(duì)妊娠期慢性應(yīng)激的子代抑郁有何作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只7周齡C57/BL6J小鼠(40只雌性、20只雄性)購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技公司，體質(zhì)量17～20 g。在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下[室溫(24±1)℃, 濕度50%±2%, 光照12 h循環(huán)，無(wú)病原體環(huán)境]飼養(yǎng)。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由獲取水和食物。

1.2 試劑與儀器

1.2.1主要儀器 垂直電泳儀、轉(zhuǎn)移槽、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);ELX全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BD公司)；Centrifuge5424R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；正置熒光顯微鏡(德國(guó)萊卡儀器有限公司)；SuperMaze系列行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(上海欣軟公司)。

1.2.2主要試劑 TUNEL試劑盒(上海羅氏制藥有限公司)； mTOR單克隆抗體(美國(guó)Abmart公司)；p-mTOR(Ser24448)單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；山羊抗兔IgG抗體和DBA顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)； BCA測(cè)定試劑盒(上海碧云天公司)。

1.3 動(dòng)物模型建立方案及分組C57/BL6J小鼠以雌雄2 ∶1的比例在19 ∶00進(jìn)行合籠，第二天07 ∶00查陰栓，查到陰栓后將其進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，為懷孕第一天。正常飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取20只孕鼠進(jìn)行妊娠期慢性應(yīng)激(chronic stress during pregnancy，CSDP)。應(yīng)激方式包括：① 禁水24 h; ② 禁食24 h; ③ 束縛 2 h; ④溫水游泳15 min; ⑤ 冰水游泳5 min; ⑥ 夾尾5 min; ⑦ 晝夜顛倒12 h。自孕第7天開(kāi)始，采用隨機(jī)數(shù)表法每天進(jìn)行一種應(yīng)激，直至孕鼠分娩。子鼠出生后于第21天被隨機(jī)分為母代正常對(duì)照+子代正常對(duì)照組(NC+NC)；母代正常對(duì)照+子代慢性應(yīng)激組(NC+COS)；母代妊娠期慢性應(yīng)激+子代正常對(duì)照組(CSDP+NC)；母代妊娠期慢性應(yīng)激+子代慢性應(yīng)激組(CSDP+COS)，每組8只。子代應(yīng)激方式同孕鼠應(yīng)激方式，在出生第21天至35天進(jìn)行14 d的慢性應(yīng)激。

1.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus maze, EPM) 實(shí)驗(yàn)時(shí)，將每組的8只小鼠單獨(dú)置于離地面50 cm高度的迷宮中，在迷宮上方固定攝像機(jī)，記錄小鼠運(yùn)動(dòng)情況。在測(cè)試前，用75%酒精溶液清洗迷宮，以避免嗅覺(jué)提示。每只小鼠被放置在迷宮的中央，面對(duì)著其中一只閉合的臂。每只動(dòng)物探索時(shí)間為5 min。

1.4.2強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test, FST) 在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將每組的8只小鼠單獨(dú)置于直徑20 cm的透明桶中游泳15 min(深度12 cm,水溫23～25 ℃)。第二天，將小鼠單獨(dú)放置在桶中進(jìn)行游泳6 min,統(tǒng)計(jì)最后4 min不動(dòng)時(shí)間總和。

1.5 TUNEL檢測(cè)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡用石蠟對(duì)腦組織進(jìn)行包埋，在相應(yīng)位置進(jìn)行切片，經(jīng)二甲苯脫蠟乙醇水化后，PBS清洗3次，滴加0.1%T-ritonX-100,0.1%檸檬酸鈉室溫消化8 min，PBS清洗3次后滴加TUNEL反應(yīng)混合物，37 ℃、60 min，PBS清洗后滴加DAPI染液復(fù)染10 min，在熒光顯微鏡下(× 200)觀察。統(tǒng)計(jì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)即為凋亡指數(shù)。

1.6 Golgi-Cox染色觀察海馬神經(jīng)元樹(shù)突變化將小鼠大腦置于高爾基染色中浸泡7 d后，將其置于30%蔗糖溶液中浸泡3 d，使用震動(dòng)切片機(jī)對(duì)其進(jìn)行冠狀切片(200 μm)。切片分別在水(1 min)、氫氧化銨(30 min)、水(1 min)、顯影液(30 min)、水(1 min)連續(xù)染色。然后將切片在(50%、75%、95%和100%)酒精中連續(xù)脫水，二甲苯清洗后，中性樹(shù)脂封片，在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 慢性子代應(yīng)激對(duì)CSDP的子代雄鼠行為學(xué)影響高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。與NC+NC組相比，CSDP+NC組開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比降低(F(3,8)=24.689,P<0.05)，CSDP+COS組開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比提高(F(3,8)=24.689,P<0.001)，NC+COS組開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組和NC+COS組開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比均上升(F(3,8)=24.689,P<0.001)。此外，與NC+COS組相比，CSDP+COS組開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比也上升(F(3,8)=24.689,P<0.01)。強(qiáng)迫游泳結(jié)果顯示，與NC+NC組相比，CSDP+NC組強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間提升(F(3,28)=3.631,P<0.01)；與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間降低(F(3,28)=3.631,P<0.01)。此外，與NC+COS組相比，CSDP+NC組和CSDP+COS組強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與NC+NC組相比，NC+COS組和CSDP+COS組強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

圖1 各組雄性子代小鼠開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比

圖2 各組雄性子代小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間

2.2 慢性子代應(yīng)激對(duì)CSDP的子代雄鼠海馬神經(jīng)元的影響在正置光學(xué)顯微鏡(×200)下觀察Golgi-Cox染色的小鼠腦切片，選取小鼠海馬CA3區(qū)進(jìn)行拍照(圖3A)。使用sholl分析海馬神經(jīng)元樹(shù)突進(jìn)行分析(圖3B)。與NC+NC組相比，CSDP+NC組在30～90 μm同心圓上的樹(shù)突交點(diǎn)數(shù)量減少(30 μm:F(3,16)=54.00,P<0.01; 40 μm:F(3,16)=118.73,P<0.001; 50 μm:F(3,16)=106.05,P<0.001; 60 μm:F(3,16)=103.12,P<0.001; 70 μm:F(3,16)=59.27,P<0.01; 80 μm:F(3,16)=40.20,P<0.05; 90 μm:F(3,16)=25.78,P<0.05)，CSDP+COS組僅在40 μm和90 μm同心圓處存在差異(40 μm:F(3,16)=118.733,P<0.05; 90 μm:F(3,16)=25.783,P<0.05)。與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組樹(shù)突交點(diǎn)數(shù)量在30～70 μm間增加(30 μm:F(3,16)=54,P<0.05; 40 μm:F(3,16)=118.733,P<0.01; 50 μm:F(3,16)=106.05,P<0.05; 60 μm:F(3,16)=103.117,P<0.05; 70 μm:F(3,16)=59.267,P<0.05)。NC+COS組和CSDP+NC組相比，NC+COS組在40～90 μm同心圓內(nèi)的樹(shù)突交點(diǎn)數(shù)量增加(40 μm:F(3,16)=118.733,P<0.01; 50 μm:F(3,16)=106.05,P<0.01; 60 μm:F(3,16)=103.117,P<0.01; 70 μm:F(3,16)=59.267,P<0.01; 80 μm:F(3,16)=40.2,P<0.05; 90 μm:F(3,16)=25.783,P<0.05)。見(jiàn)圖4。

在正置熒光顯微鏡(×200)下使用不同熒光波長(zhǎng)觀察TUNEL處理海馬CA3區(qū)腦組織切片，DAPI染色的細(xì)胞核呈藍(lán)色，TUNEL染色的細(xì)胞核呈綠色，凋亡指數(shù)=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。如圖5所示，與NC+NC組相比，CSDP+NC組凋亡指數(shù)增大(F(3,8)=117.514,P<0.001); 與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(F(3,8)=117.514,P<0.001)。此外，NC+COS組凋亡指數(shù)明顯低于CSDP+NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(3,8)=117.514,P<0.001)；NC+NC組、NC+COS組與CSDP+NC組3組之間細(xì)胞凋亡指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(3,8)=117.514)。見(jiàn)圖6。

圖3 Sholl分析中各組具有代表性的神經(jīng)元樹(shù)突追蹤

圖4 各組海馬神經(jīng)元sholl分析的結(jié)果

圖5 TUNEL染色法檢測(cè)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡圖×200

圖6 各組TUNEL染色法凋亡指數(shù)

2.3 慢性子代應(yīng)激對(duì)CSDP的子代海馬mTOR活性的影響采用Western blot方法檢測(cè)小鼠海馬中mTOR和p-mTOR蛋白含量，使用p-mTOR/m-TO來(lái)表示mTOR蛋白活性，結(jié)果如圖7所示。與NC+NC組相比，CSDP+NC組子代小鼠海馬mTOR活性降低(F(3,8)=28.762,P<0.01), CSDP+COS組海馬mTOR活性增加(F(3,8)=28.762,P<0.01), NC+COS組海馬mTOR活性呈下降趨勢(shì)(F(3,8)=28.762,P<0.05)；與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組海馬mTOR活性增加極為明顯(F(3,8)=28.762,P<0.001)。此外，NC+COS組與CSDP+NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(3,8)=28.762,P>0.05)；NC+COS組相比于CSDP+COS組，其mTOR活性較低(F(3,8)=28.762,P<0.001)。

圖7 各組小鼠海馬mTOR蛋白活性

3 討論

越來(lái)越多的研究[6-7]表明抑郁癥與海馬損傷息息相關(guān)。很多研究關(guān)注于CSDP對(duì)誘發(fā)子代抑郁的影響。關(guān)于CSDP和慢性子代應(yīng)激在雄性子代抑郁中有何種交互作用的研究很少。因此，本文旨在探討CSDP和慢性子代應(yīng)激在誘導(dǎo)雄性子代抑郁中的相互作用及其機(jī)制。

該研究采用了慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激進(jìn)行應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，避免孕鼠對(duì)應(yīng)激產(chǎn)生適應(yīng)性。有研究[8]已證實(shí)鼠在妊娠期接受慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激后可表現(xiàn)出抑郁樣行為。FST和EPM已被廣泛應(yīng)用于測(cè)量抑郁樣行為[9]。在FST實(shí)驗(yàn)中，不動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)，表明小鼠抑郁程度越嚴(yán)重；在EPM實(shí)驗(yàn)中，開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比越低，代表小鼠抑郁程度越嚴(yán)重。本研究結(jié)果顯示，與NC+NC組相比，CSDP+NC組雄性子代小鼠在FST中不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)、在EPM中開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比明顯降低，表明抑郁樣行為增加，求生欲望較低；與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比明顯升高，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間降低。這些結(jié)果表明，CSDP誘導(dǎo)子代雄鼠呈現(xiàn)抑郁樣行為，慢性子代應(yīng)激可以抑制妊娠期慢性應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的雄性子代小鼠的抑郁樣行為，這與Van Den Hove et al[10]課題組在CSDP所產(chǎn)成年子代大鼠身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所得到的的結(jié)果具有相似性。本研究結(jié)果，慢性應(yīng)激對(duì)子鼠抑郁樣行為無(wú)明顯影響，這可能與子鼠月齡較小且應(yīng)激時(shí)間較短有關(guān)。

以往的研究[11-12]表明海馬CA3區(qū)與抑郁樣行為存在著密切聯(lián)系。本研究選取海馬CA3區(qū)進(jìn)行高爾基染色，結(jié)果顯示，與NC+NC組相比，CSDP+NC組在30～90 μm同心圓處樹(shù)突交點(diǎn)數(shù)量減少，CSDP+COS組僅在40 μm與90 μm同心圓處樹(shù)突交點(diǎn)數(shù)量有差異；與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組在30～70 μm同心圓處樹(shù)突交點(diǎn)數(shù)量明顯增加。上述結(jié)果表明，CSDP引起了海馬CA3區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突分支復(fù)雜性降低，慢性子代應(yīng)激逆轉(zhuǎn)了CSDP所引起的海馬神經(jīng)元樹(shù)突損傷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證慢性子代應(yīng)激是否能夠改善CSDP引起的海馬神經(jīng)元損傷，課題組采用TUNEL染色法觀察細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，與NC+NC組相比，CSDP+NC組海馬CA3區(qū)凋亡指數(shù)明顯升高；與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組海馬CA3區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CSDP誘導(dǎo)雄性子代小鼠海馬神經(jīng)元損傷，慢性子代應(yīng)激減輕了CSDP引起的神經(jīng)元損傷。

mTOR信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮、神經(jīng)元分化和突觸的部分功能[13]。最近的研究[14]也表明mTOR可能介導(dǎo)了抑郁癥的發(fā)生。本研究顯示，與NC+NC組相比，CSDP+NC組mTOR活性明顯降低； 與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組mTOR活性上升； CSDP+COS組相較于NC+NC組，其mTOR活性更高，提示慢性子代應(yīng)激可能通過(guò)mTOR信號(hào)通路改善CSDP引起的抑郁樣行為和海馬病理?yè)p傷。

總之，CSDP誘導(dǎo)雄性子代小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，并伴有海馬神經(jīng)元損傷和mTOR活性降低。慢性子代應(yīng)激可以改善雄性子代小鼠的抑郁行為和海馬的病理?yè)p傷。CSDP和慢性子代應(yīng)激在誘導(dǎo)雄性子代小鼠抑郁樣行為中具有拮抗作用，mTOR信號(hào)通路在其中發(fā)揮可能著重要作用，但更進(jìn)一步的機(jī)制，有待深入研究。