任鵬飛，劉 晨，冉 翔，王恒毅

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，合肥 2300322安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽(yáng)醫(yī)院急診科，阜陽(yáng) 2360003安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032

肝癌是惡性程度最大的腫瘤之一?；熌退幨歉伟┗颊哳A(yù)后差的重要原因[1]。鉑類藥物是肝癌治療的一線藥物，但長(zhǎng)期使用往往會(huì)出現(xiàn)耐藥性[2]。DNA損傷修復(fù)是導(dǎo)致肝癌耐藥最主要的機(jī)制[3-4]。研究[5-6]表明，DNA修復(fù)酶多聚 (ADP-核糖) 聚合酶-1[poly (ADP-ribose) polymerase-1, PARP-1]在耐藥肝癌細(xì)胞中高度表達(dá), 在臨床上顯著降低鉑類藥物對(duì)肝癌的治療作用。吐根堿是一種異喹啉生物堿，近年來(lái)研究[7-8]發(fā)現(xiàn)吐根堿聯(lián)合化療藥物能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，但是機(jī)制尚不明確。因此，該研究構(gòu)建了順鉑(cisplatin, DDP)耐藥肝癌細(xì)胞株HepG2/DDP，評(píng)價(jià)吐根堿是否通過(guò)結(jié)合PARP-1而發(fā)揮增敏順鉑的抗腫瘤作用，希望為臨床逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥的研究提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料吐根堿(貨號(hào)：E275439)、瑞卡帕布(貨號(hào)：R288628)、DDP(貨號(hào)：C295225)、3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物(MTT，貨號(hào)：T100896)購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；PARP-1購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司?？筆AR抗體、抗γH2AX抗體、抗PARP-1抗體、抗β-actin抗體、抗BAX抗體、抗Bcl2抗體、抗Caspase-3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；PARP-1 siRNA、NC siRNA購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；HepG2細(xì)胞來(lái)源于安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞存儲(chǔ)中心。

1.2 反向虛擬篩選與分子對(duì)接采用Discovery studio 2017軟件進(jìn)行反向篩選和分子對(duì)接。用Chemdraw 2010繪制吐根堿結(jié)構(gòu)，Discovery studio 2017優(yōu)化加氫，Libdock程序與Discovery studio 2017軟件蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)組件對(duì)接，選取排名前十的蛋白進(jìn)行分析，選擇目標(biāo)蛋白，再次利用Libdock程序與目標(biāo)蛋白進(jìn)行對(duì)接，獲得三維(合)二維結(jié)合模式圖，分析小分子與配體間的鍵合作用。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)來(lái)源于Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)將PARP-1蛋白標(biāo)記在芯片上，6種濃度的吐根堿(500、250、125、62.5、31.25、15.625 nmol/L)通過(guò)6個(gè)通道以20 μl/min 的速度流過(guò)芯片，持續(xù)5 min，再用磷酸鹽緩沖液沖洗10 min，Biacore T200 2.1軟件分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)采用GE Biacore T200 生物大分子相互作用分析儀(Cytiva，美國(guó))進(jìn)行操作。

1.4 DDP耐藥細(xì)胞HepG2/DDP的構(gòu)建采用藥物大劑量沖擊和低劑量持續(xù)誘導(dǎo)相結(jié)合的方法誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。將HepG2細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、100 U/ml青-鏈雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待HepG2細(xì)胞細(xì)胞融合度超過(guò)60%以后加入5 g/ml的DDP培養(yǎng)，24 h后洗去死細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，待再次融合度超過(guò)60%后加入5 g/ml的DDP培養(yǎng)，24 h后洗去死細(xì)胞，依次反復(fù)傳代10次。隨后將得到的細(xì)胞加入0.5 g/ml的DDP適應(yīng)性培養(yǎng)，培養(yǎng)10代之后檢測(cè)DDP的IC50，檢測(cè)細(xì)胞的耐藥性，備用，并將細(xì)胞命名為HepG2/DDP。

1.5 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2或HepG2/DDP接種到96孔板中(密度為5 000個(gè)細(xì)胞/孔)。培養(yǎng)24 h后加入DDP(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/ml)或吐根堿(1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)或吐根堿(16 μmol/L)+DDP(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/ml)后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基后每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT，在37℃ 繼續(xù)孵育4 h，每孔再加入100 μl DMSO，混勻，在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞生存率、IC50值及HepG2/DDP細(xì)胞的耐藥指數(shù)(RI)。RI=耐藥株IC50/非耐藥株IC50。

1.6 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)siRNA由廣州市銳博生物科技有限公司合成。PARP-1 siRNA序列為5′-GGAUGAUCUUCGACGUGGA-3′；陰性對(duì)照NC siRNA序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。根據(jù)LipofectamineTM 2000說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)、蛋白印跡實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)(設(shè)為空白組、4 μg/ml DDP組、16 μmol/L吐根堿+4 μg/ml DDP組)。

1.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，加入到24孔板中預(yù)包被多聚賴氨酸的玻片上，37℃孵育5 h，待貼壁后吸干液體，多聚甲醛固定，30 min后加入羊血清封閉，孵育40 min，吸棄液體加入一抗后4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，加入二抗進(jìn)行熒光染色，作用1 h后用熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.8 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)將濃度分別為0、4、8、16 μmol/L的吐根堿與HepG2/DDP細(xì)胞孵育24 h或單獨(dú)培養(yǎng)HepG2、HepG2/DDP和HepG2/DDP (PARP-1 siRNA) 細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，蛋白定量后SDS-PAGE電泳分離蛋白轉(zhuǎn)膜，用TBS-T配制的含5%脫脂牛奶的緩沖液封閉，1 h后用TBS-T 緩沖液洗膜3 次，加入1 ∶1 000 稀釋比例的一抗(抗PAR抗體、抗γH2AX抗體、抗PARP-1抗體、抗BAX抗體、抗Bcl2抗體、抗Cleaved-caspase-3抗體、抗β-actin抗體), 4℃孵育過(guò)夜。過(guò)夜后待膜恢復(fù)至室溫，TBS-T緩沖液洗膜3次，加入1 ∶3 000稀釋的對(duì)應(yīng)二抗，孵育1 h，取出膜后TBS-T 緩沖液洗膜3次，吸干，加入化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行凝膠成像檢測(cè)，計(jì)算吸光度，分析結(jié)果。

1.9 流式細(xì)胞檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2/DDP細(xì)胞調(diào)整濃度為1×105個(gè)/ml，接種到6孔板中。分別設(shè)空白組、DDP組(4 g/ml)和吐根堿(16 μmol/L)+DDP(4 g/ml)組，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，1 000 r/min、4 ℃下離心5 min，并用預(yù)冷PBS沖洗兩次。隨后將細(xì)胞重新懸浮在100 μl PBS緩沖液中，加入5 μl Annexin V-FITC混合。冰上避光15 min，然后添加400 μl PBS。流式細(xì)胞儀檢測(cè)前加入5 μl碘化丙碇溶液，混勻后快速檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 吐根堿體外與PARP-1的相互作用反向虛擬篩選結(jié)果顯示吐根堿對(duì)多個(gè)藥物靶點(diǎn)有良好的結(jié)合作用。取契合值打分排名前十的靶點(diǎn)分析顯示，吐根堿與降低化療藥物敏感性相關(guān)的DNA修復(fù)酶PARP-1 (PDB ID: 4und)有較高的契合值打分，提示吐根堿可能通過(guò)結(jié)合PARP-1增強(qiáng)化療藥物的敏感性。見(jiàn)表1。

表1 Discovery Studio 2017預(yù)測(cè)的排名前十位的蛋白質(zhì)晶體靶標(biāo)

對(duì)已報(bào)道的PARP-1的活性位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果顯示吐根堿能夠通過(guò)多種模式結(jié)合到PARP-1活性位點(diǎn)中，包括：一個(gè)形成于氨基酸GLY863和異喹啉環(huán)上的羥基的氫鍵；一個(gè)形成于氨基酸GLU988和異喹啉環(huán)上質(zhì)子化N的離子鍵；芳香族氨基酸TYR806、TYR889、TYR907分別與吐根堿結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)產(chǎn)生的π-π堆積作用；多個(gè)疏水氨基酸與吐根堿通過(guò)范德華力和和多個(gè)弱的碳?xì)滏I相互作用。見(jiàn)圖1。

SPR實(shí)驗(yàn)在分子水平觀察吐根堿與PARP-1的相互作用，采用瑞卡帕布作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果如圖2所示，各種濃度(化合物濃度依次為500、250、125、62.5、31.25、15.625 nmol/L)的吐根堿和瑞卡帕布通過(guò)標(biāo)記PARP-1蛋白的芯片后，芯片表面偏振光折射率發(fā)生不同程度的變化，表明小分子與PARP-1蛋白發(fā)生結(jié)合作用。對(duì)結(jié)合曲線進(jìn)行擬合的到解離動(dòng)力學(xué)常數(shù)KD值，兩者分別為5.73×10-6mol/L(吐根堿)和4.26×10-6mol/L(瑞卡帕布)，說(shuō)明吐根堿與PARP-1有良好的結(jié)合作用。

2.2 HepG2/DDP細(xì)胞耐藥性鑒定及PARP-1的表達(dá)分析MTT法檢測(cè)了DDP對(duì)HepG2和HepG2/DDP耐藥株的IC50值。結(jié)果如圖3A所示，DDP對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=61.14,P<0.01)，IC50值為(4.27±0.34) μg/ml；HepG2/DDP細(xì)胞株對(duì)各個(gè)濃度的DDP均顯示出一定的耐藥性(F=73.96,P<0.01)，IC50值增至(15.76±0.84) μg/ml，RI值為3.69。這一結(jié)果說(shuō)明HepG2/DDP細(xì)胞對(duì)DDP產(chǎn)生了顯著的耐藥性。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示 (圖3B、C)，PARP-1在HepG2/DDP細(xì)胞中的表達(dá)量較HepG2顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.68,P<0.01)。

2.3 吐根堿對(duì)HepG2/DDP細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)分析如圖4A所示，吐根堿在1～16 μmol/L濃度區(qū)間內(nèi)對(duì)HepG2/DDP細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到32 μmol/L時(shí)，HepG2/DDP細(xì)胞的增殖顯著受到抑制，抑制率達(dá)到(21.86±1.78) %，故選擇16 μmol/L作為吐根堿的無(wú)毒閾值研究其對(duì)HepG2/DDP細(xì)胞的增敏作用。進(jìn)一步研究顯示吐根堿(16 μmol/L)聯(lián)合不同濃度DDP與HepG2/DDP細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞生存率較DDP單用組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=98.49,P<0.01)。計(jì)算吐根堿和DDP聯(lián)合用藥的IC50值，結(jié)果顯示較DDP單獨(dú)使用組，IC50值顯著下降[IC50值為(3.95 ±0.43) g/ml]，RI值為0.93。這一結(jié)果提示吐根堿對(duì)HepG2/DDP細(xì)胞DDP的耐藥性有顯著的逆轉(zhuǎn)作用。見(jiàn)圖4B。

圖1 吐根堿與PARP-1(PDB號(hào)：4und)的結(jié)合模式圖

圖2 SPR檢測(cè)吐根堿與PARP-1結(jié)合作用

圖3 HepG2/DDP細(xì)胞耐藥性鑒定及細(xì)胞株中PARP-1的表達(dá)

2.4 吐根堿在細(xì)胞內(nèi)對(duì)PARP-1酶活性的影響為進(jìn)一步評(píng)價(jià)吐根堿對(duì)PARP-1的抑制作用，采用免疫印跡法檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)反映PARP-1 酶活性PAR表達(dá)水平及反映DNA 損傷的γH2AX表達(dá)水平。結(jié)果顯示，吐根堿處理HepG2/DDP細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)PAR的表達(dá)量明顯降低，γH2AX的表達(dá)量增加(FPAR=519.0,P<0.01；FH2AX=794.3,P<0.01)，提示吐根堿可抑制HepG2/DDP細(xì)胞中的 PARP-1活性，進(jìn)而阻斷細(xì)胞內(nèi) DNA 損傷修復(fù)，增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性。見(jiàn)圖5。

2.5 吐根堿聯(lián)合DDP對(duì)沉默PARP-1 的HEPG2/DDP細(xì)胞增殖的影響如圖6所示，免疫熒光和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示PARP-1 siRNA轉(zhuǎn)染后HEPG2/DDP細(xì)胞中的PARP-1生成量顯著降低；在吐根堿存在的條件下，與陰性對(duì)照組相比，DDP對(duì)PARP-1 siRNA轉(zhuǎn)染的HEPG2/DDP細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯的影響。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了吐根堿通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞中的 PARP1活性，增強(qiáng)化療藥物的敏感性。

2.6 吐根堿聯(lián)合DDP對(duì)HepG2/DDP細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果如圖7所示，空白組、DDP組和吐根堿+DDP組細(xì)胞凋亡率分別為(2.84±1.02)%、(11.87±2.41)%和(39.77±4.66)%。與DDP組比較，吐根堿+DDP組HepG2/DDP細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=11.22,P<0.01)。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示(圖7B、C)，DDP降低Bcl2表達(dá)，同時(shí)增加BAX和切割的Caspase-3的表達(dá)水平，吐根堿則顯著增強(qiáng)了DDP調(diào)控這些凋亡相關(guān)蛋白的作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=84.27,P<0.01)。

圖4 吐根堿對(duì)HepG2/DDP細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

圖5 吐根堿在細(xì)胞內(nèi)對(duì)PARP-1酶活性的影響

圖6 吐根堿聯(lián)合DDP對(duì)沉默PARP-1的HEPG2/DDP細(xì)胞增殖的影響

3 討論

化療耐藥是導(dǎo)致肝癌綜合治療失敗、病死率居高不下的一個(gè)主要因素。因此，研究肝癌的化療耐藥機(jī)制，尋找逆轉(zhuǎn)化療耐藥的方法顯得尤為重要。腫瘤細(xì)胞中PARP1 蛋白響應(yīng)于 DNA 損傷反應(yīng)，在被 DNA 鏈斷裂激活后，PARP1 以 NAD+依賴性方式催化PAR的合成，進(jìn)行DNA損傷修復(fù)，這一過(guò)程在幾秒鐘內(nèi)即可發(fā)生，是最快的 DNA 損傷反應(yīng)之一[3-4]。近年來(lái)，多種結(jié)構(gòu)的PARP-1抑制劑陸續(xù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，其中一些抑制劑目前作為單一藥物或與DNA損傷藥物聯(lián)合已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的不同階段[9-10]。目前已有2 個(gè)PARP-1抑制劑獲批上市，包括奧拉帕瑞布和拉卡帕瑞[11]。多項(xiàng)研究[12]表明，這些PAPR-1抑制劑能提高肝癌細(xì)胞對(duì)DNA損傷藥物敏感性，但是部分藥物仍然存在如藥代動(dòng)力學(xué)差、潛在毒性的缺陷。因此，仍然需要努力尋找具高效低毒的新型骨架的PARP-1抑制劑。

天然產(chǎn)物是新藥發(fā)現(xiàn)的巨大寶庫(kù)，本研究顯示來(lái)源于天然產(chǎn)物茜草科植物吐根單體成分吐根堿具有潛在的增敏DDP對(duì)肝癌細(xì)胞HEPG2/DDP的毒性作用，這一結(jié)果提示在臨床治療中吐根堿具有成為化療藥物增敏劑的潛力。計(jì)算機(jī)反向虛擬篩選的過(guò)程表明吐根堿與PARP-1有良好的結(jié)合作用，提示吐根堿可能是通過(guò)結(jié)合PARP-1、抑制PARP-1活性而發(fā)揮增敏化療藥物的作用。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)分析了吐根堿與PARP-1的結(jié)合模式，顯示吐根堿能通過(guò)多重作用與PARP-1的活性位點(diǎn)的多個(gè)氨基酸殘基鍵合，在這些氨基酸中，GLY 863和TYR 907已被證實(shí)是PARP-1抑制劑鍵合的關(guān)鍵氨基酸[13]。SPR實(shí)驗(yàn)在體外分析了吐根堿與PARP-1的相互作用，結(jié)果顯示其結(jié)合PARP-1的能力與陽(yáng)性藥物瑞卡帕布相當(dāng)。在細(xì)胞水平上，免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示吐根堿可顯著抑制PARP-1的活性，表現(xiàn)為抑制酶活標(biāo)志物PAR表達(dá)，增強(qiáng)DNA損傷標(biāo)志物γH2AX的表達(dá)。此外，siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了沉默PARP-1基因后吐根堿聯(lián)合DDP對(duì)的HEPG2/DDP細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示沉默PARP-1基因的HEPG2/DDP細(xì)胞聯(lián)合使用吐根堿的DDP與單獨(dú)使用DDP相比,病死率沒(méi)有明顯變化，進(jìn)一步證實(shí)了吐根堿對(duì)DDP的增敏作用是通過(guò)靶向結(jié)合PARP-1。

圖7 吐根堿(16 μmol/L)聯(lián)合DDP(4 μg/ml)對(duì)HepG2/DDP細(xì)胞凋亡的影響

與DNA發(fā)生烷基化反應(yīng)，損傷腫瘤細(xì)胞DNA是鉑類藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制[14]。PARP-1與凋亡蛋白P53關(guān)系密切，其不僅參與P53蛋白活化途徑，而且能夠促進(jìn)P53與細(xì)胞內(nèi)損傷DNA缺口相結(jié)合，進(jìn)而修復(fù)鉑類藥物導(dǎo)致的DNA損傷[15]。因此，PARP-1作為DNA修復(fù)酶，阻礙其激活對(duì)鉑類藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡非常重要。在本研究中，Annexinv-PI雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與DDP單獨(dú)使用組相比，吐根堿可顯著增加DDP誘導(dǎo)的HepG2/DDP細(xì)胞后期凋亡，凋亡相關(guān)蛋白Bcl2表達(dá)顯著降低，Bax、Caspase-3的表達(dá)明顯增加。結(jié)合先前實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步表明吐根堿可以通過(guò)抑制PARP-1活性，增強(qiáng)HepG2/DDP細(xì)胞對(duì)DDP敏感性，促進(jìn)DDP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

綜上所述, 本研究表明吐根堿對(duì)DNA修復(fù)酶PARP-1具有較強(qiáng)的抑制作用，能夠增強(qiáng)鉑類化療藥物對(duì)耐藥肝癌細(xì)胞株的敏感性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)治療腫瘤的新型PARP-1 抑制劑提供了基礎(chǔ)。本研究尚存在著一些不足，如選取的腫瘤細(xì)胞種類單一、未開(kāi)展動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、化合物藥代動(dòng)力學(xué)信息不足等，后續(xù)的研究將針對(duì)這些缺陷開(kāi)展工作以提供更多吐根堿作為腫瘤治療藥物先導(dǎo)化合物的數(shù)據(jù)。