肖劍虹，趙正宜，鄒多宏,2

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，安徽省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 2300322上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院口腔外科，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200001

引導(dǎo)骨再生(guided bone regeneration, GBR)技術(shù)是臨床上治療牙槽骨缺損常用且有效的方法之一。其中，GBR屏障膜在阻止成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞等非成骨細(xì)胞長入骨缺損區(qū)和維持骨修復(fù)所需要的空間等方面起到重要作用。目前臨床上應(yīng)用的可吸收性屏障膜機(jī)械強(qiáng)度不足，在骨缺損修復(fù)的過程中容易發(fā)生穿孔和破裂，不利于屏障功能的實(shí)現(xiàn)和骨修復(fù)空間的維持，從而導(dǎo)致骨修復(fù)效果不佳[1]。因此，研發(fā)出一種具有足夠力學(xué)性能的屏障膜，尤其是在體內(nèi)濕態(tài)環(huán)境下還能維持足夠的力學(xué)強(qiáng)度，以維持骨再生所需要的空間是目前發(fā)展GBR技術(shù)的當(dāng)務(wù)之急。該研究在殼聚糖(chitosan, CS)基質(zhì)中引入細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose, BC)，并通過自蒸發(fā)方法制備出CS-BC復(fù)合膜，通過測(cè)試該復(fù)合膜在干態(tài)和濕態(tài)下的拉伸強(qiáng)度及其對(duì)大鼠骨髓干細(xì)胞增殖的影響，探究其作為GBR膜的可行性。

1 材料與方法

1.1 合成材料中低黏度CS(100～200 Mpa.s，脫乙酰度≥95%，阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)。細(xì)菌纖維素(生化級(jí)，阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)

1.2 主要試劑與儀器胎牛血清(美國Gbico公司)；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(美國Gbico公司)；胰酶消化液(美國 Hyclone公司)；CCK-8試劑盒(日本株式會(huì)同仁化學(xué)研究所)；冰乙酸和氫氧化鈉(北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；二氧化碳孵育箱(美國Thermo公司)；高溫高壓滅菌鍋(HVE-50, 日本Hirayama公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-tek公司)；超聲破碎機(jī)(JYD1800L, 上海比朗儀器有限公司)；力學(xué)萬能測(cè)試機(jī)(5565A, 美國英斯特朗公司)；掃描電子顯微鏡(Supra 40，德國蔡司公司)；透射電子顯微鏡(HT7700, 日本日立公司)；傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet 8700， 美國熱電尼高力儀器公司)；X 射線衍射儀 (X'Pert3 Powder，荷蘭帕納科公司)。

1.3 原料合成稱取1 g CS粉末溶于98 ml去離子水中，邊攪拌邊往溶液中逐滴加入1 ml冰乙酸，攪拌至粉末完全溶解，配制出質(zhì)量濃度為1%的CS溶液，離心除氣泡備用。

1.4 復(fù)合膜的制備首先制備CS ∶BC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 ∶1的復(fù)合膜，取100 g 1% CS溶液和20 g 0.5% BC溶液，冰水浴中超聲破碎至兩者混合均勻，在真空干燥箱中除盡氣泡后倒入培養(yǎng)皿中，放置于40 ℃加熱臺(tái)上待水分完全蒸發(fā)后成膜。將自蒸發(fā)所制備的膜浸泡于0.3 mol/L的氫氧化鈉乙醇溶液中24 h，待酸除盡后用去離子水沖洗干凈后一半干燥，另一半在去離子水中浸泡保持濕潤狀態(tài)備用。同理分別制備CS ∶BC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 ∶3、10 ∶5、10 ∶7和10 ∶9的復(fù)合膜以及純CS膜(圖1)。

圖1 復(fù)合膜的制備過程示意圖

1.5 力學(xué)性能測(cè)試將所制備的各組薄膜在室溫下裁剪為長50 mm、寬3 mm 的樣品(每組薄膜樣品數(shù)量為6)。用螺旋測(cè)微器測(cè)量每個(gè)樣品的厚度后，通過力學(xué)測(cè)試機(jī)在拉伸速度為0.01 mm/s的情況下拉伸樣品至樣品斷裂，并記錄其拉伸強(qiáng)度。每組膜干燥和濕潤的樣品均重復(fù)測(cè)試6次。繪制出各組膜分別在干態(tài)和濕態(tài)下的拉伸強(qiáng)度值表和應(yīng)力應(yīng)變曲線圖，取拉伸強(qiáng)度最大的復(fù)合膜組及純CS膜組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 樣品表征取純CS組和拉伸強(qiáng)度最大的復(fù)合膜組，用掃描電子顯微鏡觀察其橫截面的微觀結(jié)構(gòu)。將成品BC溶液稀釋后滴于透射銅網(wǎng)的表面，待其完全干燥后經(jīng)透射電鏡觀察BC的形貌。將BC溶液經(jīng)自蒸發(fā)沉積后成膜，取純BC膜、純CS膜和拉伸強(qiáng)度最大的復(fù)合膜，采用傅立葉變換紅外光譜儀和X-射線衍射儀分析其各組成分。

1.7 大鼠骨髓干細(xì)胞(rat bone marrow stem cells, RBMSCs)的分離及培養(yǎng)取3～4周齡體質(zhì)量為(50±5) g的雄性SD大鼠(安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)的兩邊股骨，用眼科剪將股骨兩端剪去成兩端相通，用1 ml的注射器吸取含20%胎牛血清的DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔、離心、棄上清液后將沉淀的組織細(xì)胞重懸于大皿中培養(yǎng)，大皿中總體積為10 ml，標(biāo)記為P0。5 d后首次換液，之后每3 d換1次液，待P0細(xì)胞融合至70%～80%后用胰蛋白酶消化傳代。本實(shí)驗(yàn)所用的大鼠骨髓干細(xì)胞均為P3～P5代。

1.8 細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)取純CS組及干濕態(tài)力學(xué)性能最強(qiáng)組復(fù)合膜，用打孔器將薄膜制備為直徑為6 mm的圓，每組至少15個(gè)樣，經(jīng)過高溫高壓滅菌后備用。取P3～P5代RBMSCs，分為空白對(duì)照組、純CS膜組和復(fù)合膜組共3組，每組5個(gè)復(fù)孔，共3個(gè)時(shí)間段以5×103/孔的細(xì)胞密度接種于3個(gè)96孔板中。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待孔板中的細(xì)胞貼壁后，將滅菌好的薄膜材料分別加入3個(gè)96孔板中，空白對(duì)照組中不加任何薄膜。繼續(xù)將96孔板置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、4、7 d。將CCK-8試劑與純DMEM以1 ∶10的比例混合后，每孔加110 μl，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀讀取每孔在波長為450 nm處的吸光度(optical density, OD)值。

2 結(jié)果

2.1 純CS膜及各組復(fù)合膜在干態(tài)和濕態(tài)下拉伸強(qiáng)度的比較各組薄膜在干態(tài)和濕態(tài)下的拉伸強(qiáng)度值和應(yīng)力應(yīng)變曲線圖如圖2。隨著BC含量增加，CS-BC復(fù)合膜在干濕態(tài)下的拉伸強(qiáng)度隨之增加，在CS ∶BC為10 ∶7時(shí)，拉伸強(qiáng)度達(dá)到最大，干、濕態(tài)的拉伸強(qiáng)度分別為(204.7±63.0)、(44.4±6.4) MPa，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于臨床上最常用的Bio-Gide膜在干、濕狀態(tài)下的力學(xué)性能約為3.7、1.16 MPa，之后隨著BC含量增加，拉伸強(qiáng)度開始下降。

2.2 樣品表征純CS膜和CS ∶BC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 ∶7的復(fù)合膜橫截面的掃描圖如圖3所示。純CS膜為均一的有機(jī)質(zhì)結(jié)構(gòu)，復(fù)合膜中可見BC的纖維撕扯樣結(jié)構(gòu)。透射電鏡示BC的納米纖維樣結(jié)構(gòu)(圖4)。傅立葉變換紅外光譜圖和X-射線衍射圖中示復(fù)合膜中存在CS和BC(圖5)。

2.3 細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)選取純CS膜和CS ∶BC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 ∶7時(shí)的復(fù)合膜進(jìn)行細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)。圖6結(jié)果顯示，純CS組和復(fù)合膜組與RBMSCs共培養(yǎng)1 d (F=3.590，P=0.060)、4 d (F=0.293，P=0.751)和7 d (F=1.737，P=0.217)后，在同一個(gè)時(shí)間段內(nèi)，各組OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。基于此結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)所制備的復(fù)合膜具有優(yōu)良的細(xì)胞相容性。

圖2 純CS膜、各組復(fù)合膜及Bio-Gide膜在干態(tài)和濕態(tài)下拉伸強(qiáng)度的比較

圖3 橫截面掃描電鏡微觀結(jié)構(gòu)圖

圖4 BC在不同倍數(shù)下的透射電鏡圖

圖5 CS-BC復(fù)合膜的傅立葉變換紅外光譜圖

圖6 各組膜材料與RBMSCs共培養(yǎng)1、4和7 d后細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較

3 討論

臨床上，GBR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于因炎癥、創(chuàng)傷、腫瘤摘除或者先天性疾病而引起的牙槽骨缺損的治療[2]。該技術(shù)將一層屏障膜置于骨缺損和軟組織之間來阻擋周圍遷移過快的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞等軟組織細(xì)胞長入骨缺損從而確保骨修復(fù)正常進(jìn)行[3-4]。

目前臨床上應(yīng)用的GBR膜根據(jù)其降解性與否劃分為不可吸收性膜和可吸收性膜。不可吸收性膜具有良好的生物相容性和足夠的機(jī)械強(qiáng)度以維持骨缺損修復(fù)的空間，但是需要二次手術(shù)取出極大地限制了其臨床應(yīng)用[5]?？晌招阅ひ蚓哂辛己玫纳锵嗳菪?、可降解性而廣泛應(yīng)用于臨床。但是可吸收性膜力學(xué)性能不足可能會(huì)導(dǎo)致骨缺損預(yù)后不佳[6]。因此，理想的GBR膜除了應(yīng)具有良好的生物相容性，還應(yīng)具備足夠的力學(xué)強(qiáng)度，以維持骨缺損修復(fù)的空間和防止膜的穿孔破裂。考慮到GBR膜的實(shí)際應(yīng)用環(huán)境是在體內(nèi)濕態(tài)環(huán)境下，所以GBR膜在濕潤狀態(tài)下的力學(xué)性能更是至關(guān)重要。

所以，本研究擬制備出一種具有良好的生物相容性，在干態(tài)和濕態(tài)下具有優(yōu)異力學(xué)性能的新型GBR膜。CS因具備良好的生物相容性、可降解性和抑菌性而被廣泛的應(yīng)用于組織工程[7]。但是純CS力學(xué)強(qiáng)度不夠，常通過應(yīng)用納米復(fù)合材料、與聚合物混合以及通過化學(xué)交聯(lián)等方法來提高CS的力學(xué)性能，但是這些提高CS機(jī)械強(qiáng)度的方法會(huì)影響到其生物活性，所以，如何做到在不影響CS生物活性的前提下提高其力學(xué)強(qiáng)度是當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)[8-9]。

BC是一種具有三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的納米纖維，因具有顯著的物理性能(拉伸強(qiáng)度大)和優(yōu)異的生物學(xué)性能(生物相容性和低毒性)作為一種生物醫(yī)學(xué)材料而備受關(guān)注[10-11]。

因此，本研究以CS為主體，在CS體系中引入BC來提高復(fù)合膜的力學(xué)性能。通過超聲破碎的方法將不同比例的CS和BC混合均勻后通過蒸發(fā)自沉積的方式制備出復(fù)合膜，將制備出來的復(fù)合膜使用氫氧化鈉乙醇溶液浸泡除酸處理后備用。對(duì)所制備的各組復(fù)合膜在干態(tài)和濕態(tài)下進(jìn)行拉伸強(qiáng)度的測(cè)試，可得在CS ∶BC為10 ∶7時(shí)，復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度達(dá)到最大，分別是(204.7±63.0) MPa (干態(tài))和(44.4±6.4) MPa (濕態(tài))。Bio-Gide膜作為臨床上最常用的GBR膜之一，其在干濕態(tài)下的力學(xué)強(qiáng)度分別約為3.7 MPa和1.16 MPa[1]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CS-BC復(fù)合膜的力學(xué)強(qiáng)度。BC對(duì)CS力學(xué)性能的增強(qiáng)作用可能取決于以下兩個(gè)方面：① BC本身所具有的顯著的拉伸強(qiáng)度[12]；② BC具有高比表面積并且在CS基質(zhì)中分散良好，有利于BC和CS間氫鍵形成[13-14]。取力學(xué)強(qiáng)度最大的復(fù)合膜組進(jìn)行后續(xù)生物相容性的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組相比結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明復(fù)合膜具備良好的生物相容性。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建CS-BC二元體系的復(fù)合膜，探究復(fù)合膜的微觀結(jié)構(gòu)，復(fù)合膜在干態(tài)和濕態(tài)下的力學(xué)性能以及復(fù)合膜的細(xì)胞相容性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所制備的新型復(fù)合膜在干態(tài)和濕態(tài)下均具有較好的拉伸強(qiáng)度且具有優(yōu)異的生物相容性，有望作為新型的GBR膜而應(yīng)用于臨床。