李經(jīng)緯 夏 銘 黃廷敏 祖貴東 陸芳麗 屈立武 張萬(wàn)萍,*

(1 貴州大學(xué)蔬菜研究院，貴州 貴陽(yáng) 550000；2 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000；3 威寧縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 畢節(jié) 551700；4 貴州省農(nóng)業(yè)信息中心，貴州 貴陽(yáng) 550000)

蘿卜(RaphanussativusL.)是重要的十字花科蔬菜，其可持續(xù)性生產(chǎn)受蕓薹鏈格孢菌(Alternariabrassicae)引起的黑斑病的威脅[1]，發(fā)病時(shí)植株各部位形成黑褐色、具同心輪紋的近圓形病斑，嚴(yán)重影響蘿卜光合同化效率和商品性[2]。鏈格孢菌適應(yīng)力強(qiáng)、傳播快，目前主要依賴化學(xué)藥劑防治，但大量使用化學(xué)農(nóng)藥不利于產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展，因此應(yīng)積極探索綠色防控方法。

褪黑素(melatonin，MT)最早發(fā)現(xiàn)于牛松果體[3]，是廣泛存在于生物界的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)[4-8]，主要作用于晝夜節(jié)律[9-10]、抗氧化[11-15]和抗逆[11,16-19]調(diào)節(jié)。在誘導(dǎo)逆境抗性方面，MT可顯著提高葫蘆科(Cucurbitaceae)作物對(duì)黃粉菌(Podsphaeraxanthii)和疫霉菌(Phytophthoracapsici)的抗性[17]，以及通過(guò)介導(dǎo)水楊酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)信號(hào)途徑調(diào)節(jié)基因和病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)，提高水稻(OryzasativaL.)對(duì)白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv．Oryzae)的抗性[15]；另外，劉建龍[20]證明了MT通過(guò)激活PbOPR3轉(zhuǎn)錄促進(jìn)JA合成，最終提高梨(PyrusbretschneideriRehd.)果實(shí)對(duì)輪紋病的抗性。此外，MT在對(duì)微生物生理生化作用上表現(xiàn)出復(fù)雜性[21-23]。該物質(zhì)一方面可促進(jìn)枝菌根菌(Rhizophagusintraradices)逆境下菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育[24]，另一方面會(huì)在低劑量下抑制對(duì)綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)和鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)增殖[25]。感病植物同時(shí)攜帶植物細(xì)胞與病原體，對(duì)感病植物噴施MT，該物質(zhì)同時(shí)作用于二者，目前大部分針對(duì)MT介導(dǎo)植物抗病的研究集中在植物上，對(duì)其影響植物與病原物互作的作用模式研究十分有限。

隨著測(cè)序和建庫(kù)技術(shù)的提升，以及高通量UTRNAs序列敏感性的增加，促進(jìn)了“雙重RNA序列”的發(fā)展[26]?；プ鬓D(zhuǎn)錄組測(cè)序(Dual RNA-seq)可同時(shí)對(duì)宿主和病原體的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測(cè)定，該方法已成為揭示二者相互關(guān)系的有效手段[27]。目前，Dual RNA-seq已成功應(yīng)用于人類(lèi)-寄生蟲(chóng)[28]、動(dòng)物-病原菌[27,29]或寄生蟲(chóng)[27]、微生物共生[30]、植物-病原[31-33]互作的研究。本研究以Dual RNA-seq為主要檢測(cè)手段，在生理水平上和轉(zhuǎn)錄水平上初步探究外源褪黑素介導(dǎo)感病蘿卜中寄主與蕓薹鏈格孢菌互作的作用模式，以期為研究外源褪黑素調(diào)控植物對(duì)病原菌的防御機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和培養(yǎng)方法

試驗(yàn)使用菌種為蕓薹鏈格孢菌[A.brassicae(Berk.)Sacc]，分離于貴州省威寧縣雙龍鎮(zhèn)紅光村蘿卜種植基地，于合成低營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(synthetic low nutrient agar，SNA)中培養(yǎng)，環(huán)境條件為25±2℃、全黑暗，每3 d轉(zhuǎn)接1次。植物材料為黑斑病易感品種江南圓白四葉一心幼苗(25 d)，苗期培養(yǎng)條件為濕度80%、光強(qiáng)100%(33 000 Lux)、溫度25℃/16℃，光周期16 h。

1.2 鏈格孢接種

將剪去葉尖的蘿卜幼苗葉面浸泡于106CFU·cm-3的菌懸液5 min，葉片上包裹保鮮膜保濕，在上述苗期培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)4周至葉片表面出現(xiàn)黑斑病癥。以0.6%(v/v)乙醇溶液為溶劑，配置50、100、500、 1 000、 1 500 μmol·L-1MT溶液，過(guò)濾滅菌后備用。以ddH2O和溶劑噴施組為對(duì)照，對(duì)培養(yǎng)4周后出現(xiàn)病癥的植株每株噴施5 mL，每3 d噴施1次，共處理5次，期間培養(yǎng)條件同1.1。每個(gè)處理至少重復(fù)3次，每重復(fù)至少使用10棵蘿卜幼苗。

1.3 病情指數(shù)測(cè)定

最后一次噴施MT 3 d后測(cè)定病情指數(shù)，每個(gè)處理隨機(jī)調(diào)查10株，每株均調(diào)查全部葉片，總計(jì)3次重復(fù)。植株發(fā)病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：無(wú)癥狀；1級(jí)：葉黑斑面積占總?cè)~面5%以下；3級(jí)：葉黑斑面積占總?cè)~面6%～10%；5級(jí)：葉黑斑面積占總?cè)~面11%～20%；7級(jí)：葉黑斑面積占總?cè)~面21%～50%；9級(jí)：葉黑斑面積占總?cè)~面51%以上。病情指數(shù)計(jì)算公式如下：

病情指數(shù)=[∑(各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×9)]×100。

1.4 互作轉(zhuǎn)錄組的測(cè)定和分析

1.4.1 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序 對(duì)感病葉片提取和純化總RNA，方法參考TRIzol試劑盒(Invitrogen，美國(guó))和NanoDrop ND-1000超微量分光光度計(jì)(Wilmington，美國(guó))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RNA質(zhì)量通過(guò)Bioanalyzer 2100試劑盒(Agilent，美國(guó))操作說(shuō)明和瓊脂糖電泳進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)oligo(dT)磁珠(Thermo Fisher，美國(guó))特異捕獲帶有PolyA尾的mRNA。利用Magnesium RNA Fragmentation Module(NEBNext?，美國(guó))對(duì)mRNA在94℃條件下處理5～7 min至片段化后，參照 Invitrogen SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen，美國(guó))操作說(shuō)明合成cDNA。cDNA的二鏈合成使用EscherichiacoliDNA polymerase I(NEB，美國(guó))和RNase H(NEB，美國(guó))試劑盒，同時(shí)在二鏈中摻入dUTP Solution(Thermo Fisher，美國(guó))，補(bǔ)平雙鏈DNA末端，再在末端各加1個(gè)A，隨后篩選和純化片段大小。UDG酶(NEB，美國(guó))消化二鏈。產(chǎn)物反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min；98℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸5 min，8個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。程序下合成片段大小為300±50 bp的文庫(kù)。使用illumina Novaseq 6000(聯(lián)川生物，杭州)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序模式為PE150。轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)中，在各處理組中隨機(jī)取9個(gè)樣本，3個(gè)樣本混合為1重復(fù)，共3個(gè)重復(fù)進(jìn)行測(cè)序。

1.4.2 測(cè)序結(jié)果分析 利用cutadapt 1.9對(duì)原始數(shù)據(jù)除接頭、低質(zhì)量序列和重復(fù)序列。使用HISAT2(2.0.4)將Clean Data比對(duì)到基因組上(蘿卜參考基因組：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/12929 genomeassemblyid=249276，鏈格孢真菌參考基因：https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/fungi/Alternaria-alternata/latestassemblyver sions/GCF-001642055.1-Altal1/GCF-001642055.1-Altal1genomic.fna.gz)。利用StringTie(1.3.4d.Linux-x86-64)進(jìn)行初組裝，gffcompare(0.9.8.Linux-x86-64)進(jìn)一步組裝注釋結(jié)果。使用ballgown包進(jìn)行每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取數(shù)(Fragments Per Kilobase per Million，F(xiàn)PKM)定量[Total_exon_fragments/mapped_reads(millions)× exon_length(kb)]，R包edgeR或者R包DESeq 2對(duì)樣本之間進(jìn)行顯著差異分析，將差異倍數(shù)(fold change, FC)>2倍或FC<0.5倍且P<0.05的基因定義為差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)，并對(duì)其進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO，http://geneontology.org/)注釋和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，http://www.kegg.jp/kegg)富集分析。

1.5 關(guān)鍵基因表達(dá)模式的檢測(cè)

以與蘿卜生長(zhǎng)和免疫反應(yīng)相關(guān)的DEGs序列和與鏈格孢菌增殖調(diào)控和致病相關(guān)的DEGs序列為目標(biāo)，設(shè)計(jì)引物(表1、2)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(reverse transcription real-time fluorescence quantitative chain polymerase reaction, RT-qPCR)表達(dá)驗(yàn)證并以相對(duì)定量方法進(jìn)行分析，試驗(yàn)平臺(tái)為L(zhǎng)ineGene 9600 Plus(博日，杭州)。反應(yīng)體系為 20 μL：2× SYBR Green qPCR Master Mix(APExBIO，USA)10 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，無(wú)酶水7 μL。RT-qPCR程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。繪制溶解曲線時(shí)程序?yàn)椋?5℃變性15 s，60℃退火60 s；95℃變性15 s，每秒升高或者降低0.4℃。RT-qPCR中，每個(gè)基因重復(fù)檢測(cè)3次，同時(shí)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

表2 關(guān)鍵DEGs RT-qPCR引物序列Table 2 Key DEGs primer sequences for RT-qPCR

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

顯著性差異分析利用單因素方差分析(One way ANOVA)于0.05水平上進(jìn)行比較，P<0.05表示顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素對(duì)病情指數(shù)的影響

植株病情指數(shù)隨褪黑素濃度的增加呈先下降后上升的趨勢(shì)，50、100和500 μmol·L-1處理組的病情指數(shù)低于對(duì)照和其他處理組，其中100和500 μmol·L-1處理間無(wú)顯著性差異，1 000和1 500 μmol·L-1處理組病情指數(shù)顯著高于其他處理組(圖1左)。葉面病癥見(jiàn)圖1右圖。

2.2 互作轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

互作轉(zhuǎn)錄組中CK、500和1 500 μmol·L-1處理組轉(zhuǎn)錄測(cè)序數(shù)據(jù)有效率在97%以上，GC含量在46%以上，Q30均為98%(表3)，以上數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量穩(wěn)定，可用于下一步分析。測(cè)序結(jié)果與蘿卜基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，三組總reads比對(duì)率均為88%以上，唯一對(duì)比率均為62%左右(表4)。測(cè)序結(jié)果與鏈格孢菌基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，三組唯一對(duì)比率為0.02%(500 μmol·L-1和1 500 μmol·L-1組)-0.05%(CK)。三組比對(duì)結(jié)果在蘿卜樣本上無(wú)明顯差異，但在鏈格孢菌樣本上差異較大，500 μmol·L-1和1 500 μmol·L-1處理組上可比對(duì)reads和唯一比對(duì)reads數(shù)量明顯低于對(duì)照(表4)。

注：左圖：噴施外源褪黑素的江南元白蘿卜黑斑病苗病害指數(shù)；數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。右圖：不同濃度外源褪黑素對(duì)蘿卜黑斑病發(fā)病率的影響；A～F分別代表0、50、100、500、1 000和1 500 μmol·L-1外源褪黑素處理的病葉；比例尺=1厘米。Note: Left: disease index of black leaf-spot diseased Jiangnan Yuanbai radish seedlings sprayed with exogenous melatonin. Lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level. Right: the disease incidence of radish black leaf spot diseased leaves sprayed with different concentrations of exogenous melatonin. A～F represent diseased leaves with 0, 50, 100, 500, 1 000 and 1 500 μmol·L-1 exogenous melatonin treated. Bar=1 cm.圖1 感黑斑病江南圓白蘿卜幼苗外源噴施褪黑素后病情指數(shù)和發(fā)病情況Fig.1 The disease incidence and Disease index of black leaf spot disease in radish leaves sprayed with different concentrations of exogenous melatonin

表3 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估Table 3 evaluation of sample sequencing data

2.3 互作轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄本區(qū)域分布比對(duì)

互作轉(zhuǎn)錄組中，CK和500、1 500 μmol·L-1處理組測(cè)序數(shù)據(jù)與蘿卜和鏈格孢菌基因外顯子的比對(duì)率均在98%以上(圖2)，說(shuō)明樣本和測(cè)序質(zhì)量較高。

2.4 差異表達(dá)基因數(shù)量分析

蘿卜樣本中，500 μmol·L-1處理組與CK相比共檢測(cè)出588個(gè)上調(diào)基因和898個(gè)下調(diào)基因，1 500 μmol·L-1處理樣品中共檢測(cè)出1 185個(gè)上調(diào)基因和1 352個(gè)下調(diào)基因；1 500 μmol·L-1VS 500 μmol·L-1中共檢出606個(gè)上調(diào)基因和526個(gè)下調(diào)基因。鏈格孢菌樣本檢出差異表達(dá)基因較少：500 μmol·L-1處理樣品中共檢測(cè)出6個(gè)上調(diào)基因和47個(gè)下調(diào)基因，1 500 μmol·L-1處理樣品中共檢測(cè)出6個(gè)上調(diào)基因和136個(gè)下調(diào)基因，1 500 μmol·L-1VS 500 μmol·L-1中未檢出上調(diào)基因，檢出4個(gè)下調(diào)基因(圖3)。與蘿卜相比，褪黑素對(duì)感病葉片上鏈格孢菌影響較小。

表4 比對(duì)到參考基因組去除核糖體RNA數(shù)據(jù)Table 4 RNA data that mapped to reference genome and with rRNA data removed

圖2 轉(zhuǎn)錄本區(qū)域分布比對(duì)Fig.2 Transcripts mapped region

圖3 差異表達(dá)基因火山圖Fig.3 Volcano plot of deferentially expressed genes

2.5 差異表達(dá)基因富集分析

2.5.1 GO富集分析 蘿卜和鏈格孢菌DEGs均被富集為3個(gè)GO功能 (GO function)：生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能。蘿卜500 μmol·L-1VS對(duì)照比對(duì)組中，生物過(guò)程中最顯著富集(P<0.05)的GO條目為190個(gè)，DEGs 2 208個(gè)，最顯著富集GO條目包括幾丁質(zhì)應(yīng)答、脫落酸應(yīng)答、抗逆境應(yīng)答、細(xì)菌防御反應(yīng)、創(chuàng)傷應(yīng)答以及芳香族化合物生物合成過(guò)程等；細(xì)胞組成中顯著變化的條目共24個(gè)，共894個(gè)DEGs，包括光合系統(tǒng)I和II、質(zhì)膜、捕光復(fù)合體、葉綠體類(lèi)囊體膜等；分子功能中顯著富集的GO條目共97個(gè)，包括序列特異DNA結(jié)合、葉綠素結(jié)合、色素結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等，共涉及1 317個(gè)DEGs。蘿卜1 500 μmol·L-1VS對(duì)照中，生物過(guò)程中最顯著富集的GO條目195個(gè)，共 2 937 個(gè)DEGs，包括幾丁質(zhì)應(yīng)答、細(xì)菌抵御反應(yīng)、創(chuàng)傷應(yīng)答、氧化脅迫應(yīng)答、冷脅迫應(yīng)答和脫落酸反應(yīng)等；細(xì)胞組成上顯著富集的GO條目共26個(gè)，其中最顯著富集為質(zhì)外體、葉綠體、CCR4-NOT核復(fù)合體、細(xì)胞壁、質(zhì)膜和類(lèi)囊體等；分子功能上最顯著富集GO條目共108個(gè)，DEGs共1 710個(gè)，包括特異序列DNA結(jié)合、硫酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性活性、琥珀酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等。蘿卜樣本1 500 μmol·L-1VS 500 μmol·L-1中，生物過(guò)程中最顯著富集的GO條目144個(gè)，包括光合作用中光和系統(tǒng)I和II光采集、對(duì)生物體反應(yīng)、葉片衰老的負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)-生色團(tuán)連鎖等，共1 019個(gè)DEGs；細(xì)胞組成上顯著富集的GO條目共40個(gè)，包括質(zhì)體小葉、采光復(fù)合體、光和系統(tǒng)I和II、質(zhì)膜、葉綠體等，共1 358個(gè)DEGs；分子功能上共有108條顯著富集的GO條目，色素結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、葉綠素結(jié)合、過(guò)渡金屬離子結(jié)合和錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合等為最顯著富集條目，共檢出450個(gè)DEGs。蘿卜對(duì)照VS 500 μmol·L-1VS 1 500 μmol·L-1中，生物過(guò)程中共檢出250個(gè)GO條目，最顯著富集條目為冷脅迫應(yīng)答、幾丁質(zhì)應(yīng)答、脫落酸應(yīng)答和細(xì)菌抵御應(yīng)答等，DEGs共4 109個(gè)；細(xì)胞組成上共有GO條目42條，包括質(zhì)膜、光合體統(tǒng)I和II，光捕捉復(fù)合體和葉綠體類(lèi)囊體膜等，檢出3 348個(gè)DEGs；分子功能上顯著性富集條目141條，包括葉綠素結(jié)合、序列特異DNA結(jié)合、色素結(jié)合和蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等，DEGs共2 756個(gè)(前20條顯著富集GO條目見(jiàn)圖4)。

感病葉片上鏈格孢菌生物量顯著低于蘿卜，各GO功能上富集的條目數(shù)量顯著低于蘿卜。500 μmol·L-1VS對(duì)照中，生物過(guò)程上檢出52條GO條目，其中有絲分裂肌動(dòng)球蛋白收縮環(huán)組件、肌動(dòng)蛋白絲退火的負(fù)調(diào)控、鳥(niǎo)苷一磷酸(guanosine monophosphate, GMP)挽救和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和肌動(dòng)蛋白絲脫支等條目富集最顯著，DEGs共56個(gè)；細(xì)胞組成上顯著性富集9條GO條目，包括質(zhì)膜、肌動(dòng)蛋白相關(guān)、Set3復(fù)合體和細(xì)胞尖端等，DEGs共17個(gè)；分子功能上顯著富集GO term為30條，包括外源性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphophate)ATP酶活性、蛋白質(zhì)二聚活性、肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合和谷胱甘肽合酶活性等，DEGs 37個(gè)。1 500 μmol·L-1VS對(duì)照中，生物過(guò)程中共有63條顯著富集GO條目，包括Arp2/3復(fù)合物介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白成核的正調(diào)控、醋酸鹽分解代謝過(guò)程、碳利用和RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物組裝的正調(diào)控等，DEGs共97個(gè)；細(xì)胞組成中24條顯著性富集GO條目，包括線粒體、細(xì)胞質(zhì)、胞漿蛋白酶體復(fù)合體、核蛋白酶體復(fù)合體和肌動(dòng)蛋白皮質(zhì)片等，DEGs共83個(gè)；分子功能上顯著富集GO條目共48條，包括蛋白酶體激活A(yù)TP酶活性、外源性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶活性、質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和高檸檬酸合酶活性等，DEGs共60個(gè)。1 500 μmol·L-1VS 500 μmol·L-1中，各GO功能下沒(méi)有顯著性富集條目。對(duì)照VS 500 μmol·L-1VS 1 500 μmol·L-1比對(duì)組中，生物過(guò)程中顯著性富集條目共52條，包括Arp2/3復(fù)合物介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白成核的正調(diào)控、RNA聚合酶ⅡC末端絲氨酸2殘基的磷酸化與RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄延伸的正調(diào)控、肌動(dòng)蛋白成核、甾醇進(jìn)口等，顯著DEGs 52個(gè)；細(xì)胞組成上共17個(gè)顯著GO條目，包括核蛋白酶體復(fù)合體、線粒體、肌動(dòng)蛋白皮質(zhì)片、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴等，顯著DEGs 92個(gè)；分子功能上顯著性富集GO條目共34個(gè)，包括外源性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶活性、RNA聚合酶Ⅱ羧基末端結(jié)構(gòu)域激酶活性、肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合和ATP結(jié)合等條目，共57個(gè)DEGs(前20條顯著富集GO條目見(jiàn)圖4)。

圖4 差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.4 GO classification analysis of DEGs

2.5.2 KEGG富集分析 蘿卜葉片樣本上，500 μmol·L-1VS對(duì)照組中，DEGs主要富集植物絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路(46個(gè))、光合作用天線蛋白(10個(gè))、植物-病原體互作(48個(gè))、倍半萜和三萜生物合成(9個(gè))、膦酸鹽和膦酸鹽代謝(5個(gè))、丁酸代謝(6個(gè))等；1 500 μmol·L-1VS對(duì)照組中，DEGs主要富集于植物-病原體互作(85個(gè))、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)通路(59個(gè))、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(14個(gè))等；1 500 μmol·L-1VS 500 μmol·L-1組中，DEGs主要富集光合作用天線蛋白(9個(gè))和真核生物自噬(7個(gè))等；500 μmol·L-1VS 1 500 μmol·L-1VS對(duì)照比對(duì)中，光合作用天線蛋白(15個(gè))、植物-病原體互作(91個(gè))和MAPK信號(hào)通路(67個(gè))等。

鏈格孢菌樣本上，顯著富集的DEGs較蘿卜樣本明顯減少。500 μmol·L-1VS對(duì)照組中，僅3個(gè)DEGs顯著富集于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)通路；1 500 μmol·L-1VS對(duì)照組和1 500 μmol·L-1VS 500 μmol·L-1比對(duì)組中，各有1個(gè)DEGs顯著富集于淀粉和蔗糖代謝通路；在3個(gè)處理的比對(duì)組中，共有9個(gè)DEGs被富集于3個(gè)KEGG通路上，其中蛋白酶體通路上4個(gè)，萜類(lèi)主鏈生物合成通路上3個(gè)，脂肪酸延長(zhǎng)2個(gè)(圖5)。

2.6 關(guān)鍵DEGs表達(dá)模式驗(yàn)證

本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分別在蘿卜和鏈隔孢菌上各篩選出5個(gè)關(guān)鍵DEGs，其中蘿卜關(guān)鍵基因?yàn)锳px1、Ert-like、Aos、Lox3和Dlp-like，涉及功能分別為L(zhǎng)-抗壞血酸過(guò)氧化物酶1、乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子3、丙二烯氧化物合酶、葉綠體脂氧合酶3和防御素樣蛋白合成；鏈格孢菌上DEGs分別為GstII、Gt1、Ilp、Glm和PrpD，其功能分別涉及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶II合成、葡萄糖/半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體合成、異檸檬酸裂解酶和磷酰變位酶合成、谷胱甘肽代謝調(diào)控、2-甲基檸檬酸脫水酶合成。

蘿卜樣本中，RT-qPCR結(jié)果證實(shí)Apx1在對(duì)照樣品中表達(dá)量最高，為5.45，500 μmol·L-1組中最低，為0.53，1 500 μmol·L-1組樣本中表達(dá)量居中，為1.02；Ert-like表達(dá)趨勢(shì)與LPd相反，500 μmol·L-1組樣本表達(dá)量最高，為69.42，對(duì)照最低，為29.43，1 500 μmol·L-1組居中，為50.74；Aos表達(dá)量在對(duì)照中顯著高于500和1 500 μmol·L-1褪黑素處理組；Lox3在1 500 μmol·L-1樣本中表達(dá)量顯著高于對(duì)照和500 μmol·L-1；Dlp-like在500 μM外源褪黑素處理樣本中的表達(dá)量明顯高于對(duì)照和1 500 μmol·L-1。鏈格孢菌樣本中，GstII在500 μmol·L-1組中表達(dá)量高于其他兩組，其中對(duì)照為0.52，1 500 μmol·L-1組中為0.82；Gtl、Ilp和Glm表達(dá)趨勢(shì)與GstII相似，500 μmol·L-1組表達(dá)量高于其他兩組；PrpD在對(duì)照組樣本中表達(dá)量顯著高于外源褪黑素處理組，其中500 μmol·L-1組中為0.92，1 500 μmol·L-1組中為0.51。10個(gè)DEGs在3組中的表達(dá)趨勢(shì)與RNA-seq測(cè)序結(jié)果基本一致(表5、6)。

表5 關(guān)鍵DEGs的RNA-seq FPKM值Table 5 RNA-seq FPKM value of DEGs and their RT-qPCR verification

表6 關(guān)鍵DEGs的RT-qPCR驗(yàn)證Table 6 RT-qPCR verification of DEGs

圖5 差異表達(dá)基因KEGG pathway功能富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of DEGs from each contrast set

3 討論

MT是自然界廣泛存在的胺類(lèi)物質(zhì)，對(duì)植物和微生物均具有較復(fù)雜的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用[22-23,34-35]。大量報(bào)道證實(shí)外源施加MT可顯著提升農(nóng)作物對(duì)生物脅迫的抗性，但該類(lèi)報(bào)道主要集中于植物的研究[11,17,20,36]，忽略了其對(duì)病原微生物的影響，限制了對(duì)外源MT介導(dǎo)作物與病原菌互作作用機(jī)制的理解。本研究主要利用基于RNA-seq的互作轉(zhuǎn)錄組分析解析不同濃度外源褪黑素影響蘿卜黑斑病葉上寄主與鏈格孢菌互作的作用模式，為進(jìn)一步明確MT誘導(dǎo)植物抗病的機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

已有報(bào)道證實(shí)MT對(duì)植物的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用具有明顯的劑量依賴性效應(yīng)[37-39]。外源MT對(duì)蘿卜健康葉片的生長(zhǎng)和對(duì)鏈格孢菌免疫力、以及對(duì)鏈格孢菌菌落生長(zhǎng)和孢子發(fā)生的影響亦表現(xiàn)為明顯的劑量依賴型效應(yīng)，共同呈現(xiàn)低濃度(50～500 μmol·L-1)促進(jìn)、高濃度(1 000 和1 500 μmol·L-1)抑制的趨勢(shì)，其中500 μmol·L-1對(duì)寄主和鏈格孢菌的促生作用最明顯，1 500 μmol·L-1明顯抑制二者生長(zhǎng)(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。理論上，外源MT在相同濃度下對(duì)寄主和病原物的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)影響作用相同，可能不具備緩解蘿卜黑斑病的作用，但本研究證實(shí)適宜濃度的外源MT可顯著降低黑斑病病情指數(shù)(圖1)。以上結(jié)果證明外源褪黑素對(duì)蘿卜-鏈格孢菌互作影響的作用模式與其單獨(dú)對(duì)二者的作用模式存在明顯差異。

為分析差異發(fā)生原因，以CK、外源噴施500、1 500 μmol·L-1MT的感病葉片進(jìn)行Dual RNA-seq測(cè)序，并做互作轉(zhuǎn)錄組分析。各組樣本比對(duì)到蘿卜基因組的read比例均為88%以上，而比對(duì)到鏈格孢菌基因組上reads比率僅為0.02%～0.06%(表4)，結(jié)合葉面積與病斑面積的比率計(jì)算(病情指數(shù))可知，在感病葉片上，蘿卜葉片的生物量與鏈格孢菌生物量相比占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，推斷植物寄主與MT的作用水平顯著超過(guò)MT對(duì)鏈格孢菌的作用，導(dǎo)致各濃度MT對(duì)蘿卜葉片的生長(zhǎng)和抗性的影響明顯超過(guò)對(duì)鏈格孢菌侵染力的影響。另外，500及1 500 μmol·L-1處理組上，蘿卜樣本中可分別檢出1 486和2 537個(gè)DEGs，而鏈格孢菌上檢出數(shù)量分別為53和142個(gè)，進(jìn)一步說(shuō)明在感黑斑病葉片上，MT對(duì)蘿卜的影響遠(yuǎn)超對(duì)鏈格孢菌。

褪黑素可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)植物對(duì)病原菌抗性[11]。Yin等[36]證明外源MT通過(guò)調(diào)控蘋(píng)果(Malusprunifolia)葉片抗氧化酶活性以降低植株H2O2含量，最終提高對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)病(Diplocarponmali)的抗性。L-抗壞血酸過(guò)氧化物酶在清除H2O2中起到重要作用，可通過(guò)調(diào)控水楊酸合成途徑誘導(dǎo)抗性[39]。一般逆境會(huì)誘導(dǎo)抗壞血酸過(guò)氧化物酶家族成員表達(dá)量上調(diào)[40]，且該酶合成受H2O2負(fù)調(diào)控，參與植物對(duì)病原物的超敏反應(yīng)和免疫反應(yīng)[39]。本研究中，蘿卜L-抗壞血酸過(guò)氧化物酶1合成基因Apx1在500及 1 500 μmol·L-1處理組中表達(dá)量顯著低于對(duì)照，且500 μmol·L-1中表達(dá)量最低，說(shuō)明蘿卜因感病引起的氧化逆境可能因外施MT得到緩解，從而提高對(duì)鏈格孢菌的抗性。RT-qPCR證明蘿卜類(lèi)乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子3合成基因Ert-like在500 μmol·L-1處理上表達(dá)量為對(duì)照的2.35倍。已有研究證明生物和非生物脅迫均可刺激乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子3合成上調(diào)[41]。本研究中，低濃度外源MT可能通過(guò)提高Ert-like的表達(dá)以提高蘿卜葉片對(duì)鏈格孢菌抗性。丙二烯氧化物合酶屬于細(xì)胞色素P450酶超家族，定位于葉綠體中，Rustgi等[42]認(rèn)為該酶可通過(guò)調(diào)控植物防御調(diào)節(jié)劑JA的生物合成以防御環(huán)境脅迫，是植物抗逆中重要的酶，但也有研究認(rèn)為該酶對(duì)葡萄(VitisviniferaL.)中JA合成意義不大[43]，說(shuō)明該酶在不同植物中作用復(fù)雜。本研究中，丙二烯氧化物合酶合成基因AOS受外源MT負(fù)調(diào)控，且其表達(dá)量隨MT濃度提高而下降，與各處理病情指數(shù)的變化不一致，說(shuō)明該基因或許不參與MT誘導(dǎo)的抗性調(diào)控，可能存在更加復(fù)雜的模式。脂質(zhì)過(guò)氧化是植物內(nèi)源氧化脅迫中的重要內(nèi)容，可由脂氧合酶家族介導(dǎo)合成，在對(duì)抗性表現(xiàn)差異較大的番茄(Lycopersiconesculentum和L.pennellii)中，脂氧合酶合成基因LOX的表達(dá)量之間的差異達(dá)400倍[44]。本研究中，500 μmol·L-1處理組中Lox3的表達(dá)量顯著低于對(duì)照，且1 500 μmol·L-1處理組中表達(dá)量最高，說(shuō)明低濃度外源MT可有效減輕蘿卜葉片脂質(zhì)氧化，從而提高植株抗性，但高濃度MT可能轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸{迫，使植物喪失抗性。MAPK通路是MT誘導(dǎo)植物抗逆的重要途徑[16]。RNA-seq結(jié)果顯示，MAPK通路中防御樣蛋白1合成基因Dlp-like隨MT施用表達(dá)量變化明顯，其中500 μmol·L-1處理組中表達(dá)量顯著高于對(duì)照和1 500 μmol·L-1處理組。Naguib[45]證明該蛋白可調(diào)控小麥(Triticumaestivum)對(duì)枯萎病(Fusariumwilt)抗性，Dlp-like在各組中的表達(dá)模式與各處理組種病情指數(shù)的變化類(lèi)似，說(shuō)明其可能受MT調(diào)控，介導(dǎo)蘿卜對(duì)生物脅迫抗性的變化。

谷胱甘-S-轉(zhuǎn)移酶基因家族廣泛存在于所有生命形式中，主要參與生物解毒、生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境抗性[46-47]。本研究中，谷胱甘-S-轉(zhuǎn)移酶合成基因GstII在MT處理的表達(dá)高于對(duì)照，且500 μmol·L-1處理組中最高，說(shuō)明適宜濃度MT可能通過(guò)調(diào)節(jié)該酶表達(dá)量以促進(jìn)鏈格孢菌發(fā)育。MT參與調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝以提高動(dòng)植物對(duì)逆境的抗性[48-49]。RNA-seq和RT-qPCR證實(shí)鏈格孢菌參與谷胱甘肽代謝的基因Glm的表達(dá)量受外源MT誘導(dǎo)，且在500 μmol·L-1處理組表達(dá)量最高，可為MT在真菌中調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝提供證據(jù)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶以及參與調(diào)控谷胱甘肽代謝的酶在真菌應(yīng)對(duì)氧化逆境中具有重要作用[50]，但真菌上相關(guān)研究較匱乏，GstII和Glm的具體功能和MT調(diào)控兩者機(jī)制需進(jìn)一步驗(yàn)證。葡萄糖是大多數(shù)生物碳和能量的主要來(lái)源，在細(xì)胞代謝和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，也是一種信號(hào)分子，在基因轉(zhuǎn)錄、酶活性、激素分泌等方面具有多種調(diào)節(jié)功能。細(xì)胞外通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞膜攝取葡萄糖，是葡萄糖代謝的關(guān)鍵步驟[51]。本研究中控制葡萄糖/半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)的基因Gt1在MT處理組中表達(dá)量高于對(duì)照，且500 μmol·L-1處理組中量最高，說(shuō)明MT可能提高植物對(duì)碳源的獲取能力以刺激菌落生長(zhǎng)。異檸檬酸裂解酶是一種參與乙醛酸途徑的關(guān)鍵酶，對(duì)多種真菌的毒力和致病性至關(guān)重要。目前認(rèn)為可通過(guò)開(kāi)發(fā)異檸檬酸裂解酶抑制劑以控制真菌的生長(zhǎng)[52]。本研究中參與檸檬酸裂解酶合成的基因Ilp在500 μmol·L-1處理組中表達(dá)最高，說(shuō)明適宜濃度MT可能提高鏈格孢菌毒力。2-甲基檸檬酸脫水酶對(duì)檸檬酸鹽、異檸檬酸鹽和2-甲基檸檬酸鹽具有脫水催化作用，也對(duì)部分羥基酸具有脫水催化作用[53]，在細(xì)菌中參與丙酸氧化為丙酮酸過(guò)程[54]。敲除2-甲基檸檬酸脫水酶合成基因PrpD導(dǎo)致蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)大量合成2-甲基檸檬酸[55]，而該物質(zhì)可抑制芽孢形成[56]。目前，針對(duì)PrpD的研究大多集中在細(xì)菌上，該基因?qū)φ婢l(fā)育和毒性影響的生物功能尚不十分明確。本研究證實(shí)MT顯著抑制PrpD基因的表達(dá)，且濃度越高表達(dá)量越低，但具體機(jī)制需要后續(xù)深入研究。以上結(jié)果顯示，500 μmol·L-1MT對(duì)感病葉片上鏈格孢菌生長(zhǎng)和毒性具有正向影響作用，但可能因MT對(duì)寄主細(xì)胞免疫誘導(dǎo)作用更強(qiáng)，導(dǎo)致噴施后葉片表現(xiàn)抗病性增強(qiáng)現(xiàn)象。

4 結(jié)論

本研究首次利用互作轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)手段分析外源MT介導(dǎo)蘿卜-鏈格孢菌互作作用機(jī)制，研究了梯度濃度MT在寄主和病原菌代謝變化、以及蘿卜對(duì)鏈格孢菌抗性誘導(dǎo)上的作用，并證明該作用存在低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的劑量依賴性效應(yīng)：50～500 μmol·L-1濃度下MT對(duì)雙方均具生長(zhǎng)促進(jìn)作用，其中500 μmol·L-1在表型和轉(zhuǎn)錄水平上均可顯著提升寄主及病原菌的生長(zhǎng)及抗性/致病性，但MT對(duì)寄主的影響顯著超過(guò)對(duì)菌的作用，最終表現(xiàn)為蘿卜抗性提高。另外，1 500 μmol·L-1濃度下MT抑制雙方生長(zhǎng)及抗性/致病性。