林顯活，吳正雙，梁熾瓊，羅瑞漣

（佛山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東佛山 528000）

近年來(lái)堿性染料被非法添加到食品中的事件已屢見(jiàn)不鮮，這些染料比食品添加劑中著色劑更容易染色，染色后顏色艷麗，不易褪色，且價(jià)格便宜，因此一些不法廠商將其違法使用在肉制品、豆制品、辣椒制品和火鍋底料等食品中。這些堿性染料含有大量苯環(huán)及其衍生物，具有強(qiáng)致癌及潛在致癌性，我國(guó)已嚴(yán)禁將這些染料用于食品加工生產(chǎn)。

目前檢測(cè)堿性染料的常用方法主要有高效液相色譜法[1-2]、高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法[3-5]和高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法[6-7]。由于食品種類繁多、基質(zhì)復(fù)雜，高效液相色譜法容易出現(xiàn)干擾峰，化合物定性時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性；高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法具有高通量快速篩的優(yōu)勢(shì)，但定量方面準(zhǔn)確性不高。目前相關(guān)的研究主要集中在調(diào)味品和肉制品，豆制品作為工業(yè)化程度低、保質(zhì)期相對(duì)較短的食品，尤其紅豆腐乳及膨化豆制品更容易被非法添加這類物質(zhì)。因此，建立一種能夠同時(shí)測(cè)定豆制品中多種堿性染料的高通量方法十分必要。本研究對(duì)豆制品樣品前處理方法、液相色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，開(kāi)發(fā)了一種同時(shí)測(cè)定12種堿性染料的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆腐、豆干、腐竹、紅豆腐乳以及膨化豆制品，購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和大型超市。

分散橙11、分散橙1、分散橙3、分散橙37、分散黃3、二甲基黃、二乙基黃、堿性橙22、堿性橙21、堿性嫩黃O、羅丹明B以及蘇丹橙G標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥90%），上海道垚測(cè)試技術(shù)有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技服務(wù)有限公司；HLB固相萃取柱（3 mL，60 mg）；陽(yáng)離子交換固相萃取小柱（MCX，3 mL，60 mg）；C18固相萃取小柱（3 mL，200 mg），美國(guó)Waters公司；QuEChERS凈化小管（填料為無(wú)水硫酸鎂、PSA和C18混合物），美國(guó)安捷倫。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIEX 5500超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)SCIEX公司；LabTech MV5氮吹儀，北京萊伯泰科公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取12種標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，均配制成100 μg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，置于-18 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?，根?jù)需要用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成合適濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液備用。

1.3.2 樣品提取

稱取試樣1～2 g（精確至0.01 g）至50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋1 min，超聲提取20 min (超聲過(guò)程中可不時(shí)振搖)，渦旋混勻，10000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入另一干凈的50 mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并上清液，待凈化，必要時(shí)用乙腈飽和的正己烷除油。

1.3.3 凈化

依次用3 mL甲醇、3 mL水活化HLB固相萃取小柱，將上清液過(guò)柱，待其自然流盡后，依次用 2 mL水、2 mL甲醇+水（1+1）淋洗小柱并壓干，最后用6 mL甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，流速控制在1 mL/min。洗脫液在50 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1 mL甲醇+水（1+1）溶解殘?jiān)?，渦旋1 min，經(jīng) 0.2 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，供UPLC-MS/MS上機(jī)分析。

1.3.4 液相色譜條件

色譜柱：WatersAcquity UPLC BEH C18（50 mm× 2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流動(dòng)相：0.1%的甲酸-水溶液（A）和乙腈（B）；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫，洗脫程序：0～1.0 min， 70%A；1.0～5.5 min，70%A～5%A；5.5～6.0 min， 5%A；6.0～6.1 min，5%A～70%A；6.1～7.0 min， 70%A。

1.3.5 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧正離子（ESI+）模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；離子化電壓：5500 V；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣（Curtain Gas）：35 psi；霧化氣（Gas1）：50 psi，輔助氣（Gas2）：55 psi。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照優(yōu)化后的儀器條件，用凈化后的空白基質(zhì)溶液配制12種堿性染料混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣上機(jī)測(cè)定，以濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制濃度均為100 ng/mL的12種堿性染料的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用注射泵直接進(jìn)樣的方式，在正離子模式下先后找到各母離子和特征子離子，并對(duì)去簇電壓和碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳質(zhì)譜參數(shù)，見(jiàn)表1。

表1 12種堿性染料的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）質(zhì)譜參數(shù)

2.2 液相條件的優(yōu)化

質(zhì)譜電離方式為電噴霧正離子掃描（ESI+），流動(dòng)相中添加帶正電荷的離子如H+或NH4+等能夠促進(jìn)化合物的電離，進(jìn)而增強(qiáng)靈敏度，故本文分別比較了甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈 -5 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸）流動(dòng)相體系對(duì)12種堿性染料的分離效果和響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，流動(dòng)相體系中含有甲酸銨時(shí)，雖然部分化合物的響應(yīng)值有明顯增強(qiáng)，但大部分化合物的響應(yīng)值下降明顯，分離效果較差，且部分化合物的峰形也較差，見(jiàn)圖1（a）。甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水分別為流動(dòng)相時(shí)，乙腈的洗脫效果和峰形優(yōu)于甲醇，目標(biāo)物的響應(yīng)值也較高，見(jiàn)圖1（b）。

圖1 不同流動(dòng)相對(duì)12種堿性染料的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖的影響圖

2.3 提取溶劑的選擇

12種堿性染料的極性差別較大，但都能溶于水、甲醇、乙腈和乙醇等常用溶劑，選擇一種合適的提取溶劑尤為重要。有標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)顯示，羅丹明B用乙酸乙酯-環(huán)己烷或正己烷提取，經(jīng)凝膠滲透色譜系統(tǒng)凈化，實(shí)驗(yàn)浪費(fèi)大量有機(jī)試劑，且檢出限高，不能滿足快速省時(shí)和高靈敏度的要求[8]；正己烷和丙酮對(duì)堿性染料的提取效率較差，回收率在40%以下。因此本實(shí)驗(yàn)采用水、甲醇、乙醇和乙腈作為提取溶劑，并比較了其提取效果，發(fā)現(xiàn)水的提取效果最差，尤其是對(duì)含油多的樣品；甲醇和乙醇在提取出目標(biāo)物質(zhì)的同時(shí)也提取出更多的極性雜質(zhì)和色素，不利于下一步的凈化，也容易導(dǎo)致回收率下降；采用乙腈提取，凈化后的樣液較為干凈，12種堿性染料的回收率也高。故本實(shí)驗(yàn)采用乙腈為提取溶劑。

2.4 凈化條件的選擇

豆制品如豆腐、油豆腐、腐竹、豆皮、豆干和腐乳等一般含有大量的脂肪、色素、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)及其他雜質(zhì)，經(jīng)提取后，這些物質(zhì)會(huì)隨著目標(biāo)物一并提取出來(lái)，對(duì)色譜柱、質(zhì)譜儀離子源及四極桿質(zhì)譜污染較大，因此很有必要對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。

如圖2所示，強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱和C18固相萃取柱都有一定的凈化效果，MCX固相萃取柱對(duì)少油型的火鍋底料凈化效果優(yōu)于C18固相萃取柱；但對(duì)多油型的豆制品，C18固相萃取柱的凈化效果優(yōu)于MCX柱。HLB固相萃取柱的填料為N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物，是反相和陽(yáng)離子交換的復(fù)合模式，對(duì)絕大部分樣品的凈化效果均比較好。商品化的QuEChERS凈化小管使用方便，但是回收率比較低，凈化效果不太理想。故本實(shí)驗(yàn)選用HLB固相萃取柱凈化樣品。

圖2 固相萃取柱對(duì)12種堿性染料凈化效率的影響

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的影響

本實(shí)驗(yàn)采用腐竹、豆干、油豆腐實(shí)際空白樣品，用凈化后的樣品溶液配制一定濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測(cè)試，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到斜率k1；然后用溶劑配制相同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)試，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到斜率k2，計(jì)算k1/k2的比值f，以反映凈化前后基體對(duì)目標(biāo)物的影響，比值f大于1為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，小于1則為基質(zhì)抑制效應(yīng)。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)萃取柱凈化后，可顯著降低多數(shù)染料的基體抑制 效應(yīng)。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 線性范圍和檢出限

12種堿性染料的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見(jiàn)表2。本實(shí)驗(yàn)以空白樣品添加低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，使各化合物濃度水平均為0.2～0.5 μg/kg，按照1.3中的方法均平行測(cè)定10次，分別計(jì)算出10次測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍作檢出限(置信水平P=95%)，得到各化合物的檢出限。然后，按照1.3中的方法驗(yàn)證，結(jié)果顯示，添加對(duì)應(yīng)檢出限濃度的樣品，在UPLC-MS/MS上仍然有明顯響應(yīng)，且信噪比（S/N）均大于3。

表2 12種堿性染料的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.6.2 回收率和精密度

按照實(shí)驗(yàn)測(cè)定步驟，采用腐竹、紅豆腐乳兩種具有代表性的豆制品作為研究對(duì)象，在空白樣品中分別添加高（10 μg/kg）、中（5 μg/kg）、低（1 μg/kg）3個(gè)濃度進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度平行測(cè)定6次，考察方法精密度。結(jié)果表明，在不同加標(biāo)濃度條件下，不同的樣品中，兩種化合物的加標(biāo)回收率為74.6%～93.5%，精密度（RSD）為4.9%～9.5%，能夠滿足日常檢測(cè)工作的需要。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以豆制品類食品為研究對(duì)象，優(yōu)化了前處理方法和液相色譜及質(zhì)譜條件，考察了基質(zhì)效應(yīng)。采用乙腈提取樣品，HLB固相萃取柱凈化，UPLC-MS/MS法定性和定量。結(jié)果表明，該方法前處理過(guò)程簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠，回收率為74.6% ～93.5%，精密度（RSD）為4.9%～9.5%；檢出限低，為0.1～0.5 μg/kg。 該方法適用于不同類別的豆制品的檢測(cè)，可同時(shí)定性和定量測(cè)定其中的12種堿性染料，能夠滿足檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的日常檢測(cè)工作要求，為豆制品的安全監(jiān)測(cè)提供了有效的技術(shù)手段。